Download Técnicas de laboratorio para HLA

Técnicas inmunológicas y
moleculares para la
determinación de haplotipos HLA
y transplantes en general
Inmunología Aplicada 1065
Formación de profesores 2005
Carolina Hernández
Supervisado por MD Lastra
Microlinfocitotoxicidad

Se distribuyen
los linfocitos de los
donadores potenciales y el receptor en
una placa de microtitulación. Se añaden a
los
diferentes
pozos
anticuerpos
específicos para diversos alelos MHC de
las clases I y II. Se incuba y se adiciona
complemento a los pozos y se valora la
citotoxicidad según la captación o
exclusión de colorante por las células.
Si los leucocitos expresan el alelo MHC
para el que es específico el anticuerpo, las
células experimentan lisis al añadir
complemento y estas células captan el
colorante.
 Esta prueba puede indicar la presencia o
ausencia de diversos alelos MHC

Cultivo Mixto de Linfocitos

Cuando se combinan los linfocitos de dos
individuos con diferentes HLA en el cultivo
de tejido, las células crecen, sintetizan
DNA y proliferan, mientras que las células
con HLA idéntico permanecen en reposo.
La
proliferación
se
desencadena
principalmente por diferencias en los
antígenos HLA clase II entre las dos
poblaciones células por analizar.

La reactividad en la prueba CML quizá
refleja el paso inicial del reconocimiento
inmunitario del rechazo a transplante in
vivo. Mientras más inmunogénica sea la
diferencia del locus D, mayor será la
respuesta celular del CML y mayor
posibilidad habrá de un rechazo al
transplante. Normalmente ambas células
proliferan y forman el CML de doble vía.

Para evaluar la respuesta de una sola
célula responsable, se inactiva la célula
estimulante por medio de radiación o
fármacos , que inhiben la síntesis de DNA.

Por lo general se presenta una respuesta
proliferativa después de incubar 6 días.

Entonces, se aplica al cultivo un pulso de
timidina tritiada de 5 a 12 horas para
marcar al DNA recién sintetizado.
Finalmente se cosechan las células, se
libera la radioactividad no adherida y con
un contador beta se da el resultado en
CPM. Esta prueba se utiliza para
confirmar la aparente identidad de HLA,
en el caso de transplante de donador
familiar.
Revela incompatibilidades
ocultas de clase II.
LMC

La exposición a antígenos no propios de
clases I y II, puede dar como resultado la
generación de linfocitos T citotóxicos
(CTL). Los CTL matan a sus células
blanco mediante contacto directo, quizá
por la liberación de mediadores tóxicos
que llevan a la lisis celular. Los CTL tipo
CD4 y CD8, se pueden observar
infiltrando los aloinjertos renales durante
el rechazo y se considera que son
efectores importantes en la pérdida del
injerto.

Se corre un CML primario con las células
del
donador
como
estimulantes
inactivados. Se cosechan las células del
paciente y se reexponen en cultivo a
células frescas del donador, marcadas con
Cr51. Por lo general, la células marcadas
se preincuban con PHA durante 6 días
(incorporan más cromo que los linfocitos
en reposo). Las CTL y las células
marcadas se colocan en relación de
blanco a efector de 100:1, 50:1 y 10:1.

Los pozos control incluyen blancos solos
para medir la liberación espontánea de la
marca y pozos de prueba que contienen
células marcadas. Después de 4 horas de
incubación se toma una muestra del
sobrenadante de cada pozo de prueba y
se cuenta. Las cuentas elevadas de 30 a
50% que exceden la actividad de fondo,
son indicativas de actividad de linfocitos T
citotóxicos. Esta prueba puede evaluar el
rechazo posterior al trasplante de riñón y
médula ósea.
Pruebas cruzadas
El propósito de las pruebas cruzadas es
detectar la presencia de anticuerpos en el
suero del paciente, dirigidos contra los
antígenos HLA del presunto donador.
 En
caso de estar presentes, los
anticuerpos dan la señal al sistema
inmune de que el receptor ha estado
sensibilizado contra estos antígenos del
donador y que por tanto, está preparado
para rechazar de manera enérgica
cualquier injerto que los posea.

Linfocitotoxicidad
manera preliminar se evalúa a
donadores potenciales utilizando el
método estándar de citotoxicidad
usando como células blanco las
células del donadores.
 En condiciones normales, los PBL
son alrededor de 80% de células T
que poseen sólo antígenos HLA clase
 De
resto son células B y
monocitos, que poseen ambas
clases de HLA.
 Una prueba positiva por medio de
citotoxicidad indica claramente la
presencia de anticuerpos contra
antígenos de clase I.
 El
Pruebas cruzadas con células T
Se realizan a 37 °C para evitar el enlace
de anticuerpos frios, que se supone, son
autorreactivos.
 Una prueba positiva
células T por
cualquier
método
contraindica
el
trasplante.

Pruebas cruzadas con células B
Las pruebas cruzadas para anticuerpos
contra antígenos HLA clase II, requiere el
uso de linfocitos B como células blanco.
 Una prueba cruzada positiva para células
B puede provenir de anticuerpos que se
enlazan a antígenos HLA clase I o II. Más
aún, las células B son un indicador más
sensible para anticuerpos débiles clase I,
ya que llevan moléculas clase I en mayor
densidad que las T.

Pruebas cruzadas por
citometría de flujo
Se ha demostrado que las pruebas
cruzadas mediante citometría de flujo
(FCC) son hasta 100 veces más sensibles
que los métodos serológicos visuales para
la detección de anticuerpos HLA en los
linfocitos
 Las células T se pueden separar de las B
por
medio
de
un
anticuerpo
fluoresceínado (anti-CD3)

Los linfocitos del donador se incuban con
el suero del paciente para permitir la
fijación
de
cualquier
anticuerpo
antidonador.
 Los anticuerpos enlazados a la población
de células T seleccionada, se detectan
mediante IgG anti-humana específica antiFc del anticuerpo F(ab´)2y se marca con
un fluorocromo distinto al que marca a las
células T

Métodos Moleculares
para HLA
Nombre
Reactivos
característicos
Procesos
característicos
Polimorfismos
detectados
RFLP
Endonucleasas de
restricción
bacteriana
Southern blot
Longitud del
fragmento de
restricción
SSP
Cebadores de PCR
específicos a
secuencia
PCR/electroforésis
en gel
Genérico a
antígenos HLA a
nível de alelo
SSOP
Sondas de
aligonucléotido
específicas a
secuencia
PCR/hibridación de Alelos HLA
sondas con
producto de la
PCR
SBT
Cebadores
marcados/terminald
ores de secuencia
marcados
PCR/establecimien Alelos a nivel de
to de secuencia del secuencia exacta
producto de la
PCR
Análisis
heterodúplex
DNA desnaturalizado de tira
simple/generador
UHG
Reunión de tiras
de DNA /electroforésis del DNA
recombinado
Complejos del DNA
característicos de
alelos
Polimorfismo en la Longitud de los
Fragmentos de Restricción (RFLP)
El DNA genómico extraído de células se
digiere con enzimas de restricción
selectiva.
 Los
digeridos se someten a una
electroforesis en gel de agarosa, el DNA
se desnaturaliza en tiras de una sola
cadena y el patrón de los fragmentos se
transfiere a una membrana de soporte,
mediante Southern blot

Los fragmentos de DNA, se hibridan con
una sonda específica para el sitio HLA,
marcado con material radioactivo (DRB1).
 Después
de la autorradiografía los
fragmentos de restricción que se han
hibridado con la sonda, aparecen como
patrones de bandas aisladas de tamaño
específico (kB) Muchos alelos HLA tienen
patrones característicos de formación de
bandas (polimorfismo en la longitud del
fragmento).

Los productos amplificados son objeto de
electroforésis y se tiñen con bromuro de
etidio y se fotografía bajo luz UV.
 Si los cebadores hibridizan con la muestra
de DNA, es visible una banda (la cual
indica la presencia del alelo HLA
particular). La falta de amplificación
implica la ausencia de esa secuencia
alélica particular en la muestra de DNA.

Primers de secuencia específica
(SSP)
Se extrae el DNA de la muestra (células,
tejidos) y se mezclan con cebadores que
tienen especificidad para las secuencias
características de cada uno de los alelos
del sitio HLA clase II que se tipifican
(DRB1,DRB3,etc.).
 Se colocan alícuotas de la muestra en
tubos separados cada uno contiene un
conjunto de cebador específico y se
amplifica en un termociclador.

Los productos amplificados son objeto de
electroforésis y se tiñen con bromuro de
etidio y se fotografía bajo luz UV.
 Si hibridizan con la muestra de DNA, se
hace visible una banda (la cual indica la
presencia del alelo HLA particular). La
falta de amplificación implica la ausencia
de esa secuencia alélica particular en la
muestra de DNA.


Todos los tubos contienen una plantilla de
DNA adicional que híbrida con todos los
primers para servir como un control en el
éxito de la PCR.
Sondas de oligonucleótidos
especifìcas de secuencias (SSOP)

Las sondas de oligonucleótido son
segmentos cortos de DNA de tira simple,
de 18 a 24 nucleótidos, cada uno de los
cuales está constituido por una secuencia
de nucleótido complementaria a un motivo
de secuencia particular que se encuentra
dentro de las regiones invariables de los
alelos HLA individuales.
Estas sondas solo hibridan con sus
secuencias exactamente complementarias
en condiciones estrictas de hibridación.
Aún la diferencia de un simple par de
bases hace que las sondas se separen del
pareado con el DNA blanco.
 Está propiedad de especificidad perfecta
de secuencia brinda a este modelo de
tipificación una mayor
resolución de
alelos del HLA

Método SSOP Dot-Blot

Se aplican las muestras de DNA (o RNA)
directo en una membrana de soporte
mediante el uso de una plantilla de
hendidura (solt-blot). Los replicados de
una sola muestra se colocan en una sola
columna de hendiduras. Después de que
se han dispersado las muestras, la
membrana se corta en líneas horizontales.
Se
preparan
sondas
individuales
especificas y diagnósticas para alelos
individuales HLA, como DR1y DR2.
 Cada banda se hibrída con una sonda
distinta de oligonucleótidos especifica de
secuencia radiomarcado (SSOP). La
membrana se reensambla y se revela por
autorradiografía o colorimetricamente.
Una banda indica la presencia en la
muestra de la secuencia del alelo HLA
correspondiente

SSOP Dot-Blot reversa

Un método más simple consiste en fijar
las sondas específicas de secuencia a la
membrana de soporte y se aplican gotas
del DNA de la muestra en las sondas. Se
permite que la muestra de DNA hibríde, se
lava la membrana y se revelan las
manchas de la sonda de hibridación con la
muestra
del
DNA
por
métodos
colorimétricos
Tipificación basada en
secuencia (SBT)

Se aisla el DNA de una célula o tejido y se
amplifica mediante la PCR con el uso de
cebadores de sitio o especifícos a grupo.
El producto amplificado se distribuye en
cuatro tubos, cada uno de los cuales tiene
polimerasa, dNTP y mezclas de
establecimiento de secuencia . Cada una
de estas mezclas esta marcada con un
terminador de secuencia marcado con
fluorescencia.
El tubo 1 contiene citosina marcada;el
tubo 2, guanina marcada; el tubo 3, timina
marcada y el tubo 4, adenina marcada. El
producto se amplifica mediante la PCR
para
incorporar
los
terminadores
marcados.
 Los cuatro tubos de muestra se mezclan y
se sujetan a electroforésis para formar
una escalera de secuencia, la cual se
rastrea por un láser para generar un
electroferograma de secuencia del DNA.


Con el uso de programas de computadora
se compara la secuencia con la biblioteca
de secuencias de antígenos HLA y se
asignan los antígenos HLA
Análisis heterodúplex
Polimorfismo conformacional de tira
única (PCR-SSCP)

Método rápido que usa la propiedad que tienen
las tiras desnaturalizadas del DNA para reunirse
nuevamente en heterodúplex (formar la doble
hélice). Sí los individuos son genéticamente
distintos para alelos HLA, la desigualdad en las
bases polimorfas modifica la desviación o
aumenta el diámetro superhelicoide del DNA y
causa retardo en la movilización electroforética.
Cuando se mezcla DNA desnaturalizado
de dos individuos diferentes se forman
nuevos heterodúplex con generación de
nuevos patrones de banda en la
electroforesis.
 Puede evaluarse rápidamente la identidad
genética entre dos indiciduos mezclandop
DNA de la PCR de sus genes HLA.


De manera alterna, puede agregarse DNA
de referencia para un alelo simple o una
molécula
generadora
heterodúplex
universal sintética (UHG) a la muestra de
la
PCR.
Esto
forma
complejos
heterodúplex singulares para cada alelo y
de esta manera se generan bandas
características que ayudan al diagnóstico.
Tipificación VNTR

El genoma humano contiene trechos de
secuencias sumamente repetitivas, que a
menudo se presentan en agrupamientos.
El numero de repeticiones en un
agrupamiento varia entre individuos y da
lugar a un número variable de duplicados
colocados en tándem (VNTR).

Este polimorfismo puede traducirse en
fragmentos de amplitud variable para
amplificación con la PCR mediante
primers diseñados para amplificar la
región de la repetición. Los VNTR tienen
clásicamente una longitud de 10 a 50
bases, también se usan polimorfismos
genéticos de secuencias cortas conocidas
como duplicados cortos en hilera (STR) de
4 a 9 pb de longitud, para la determinación
de “huellas digitales” de DNA.
Los VNTR pueden analizarse con
electroforesis del DNA ya sea genómico o
amplificado por la PCR.
 Una aplicación de los VNTR
es la
vigilancia del establecimiento del injerto en
receptores de transplante
de médula
ósea.
 Los análisis de VNTR se usan como un
marcador genético con aplicaciones tanto
clínicas como forenses.
