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Diabetes
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DIABETES MELLITUS
AUTOINMUNE DE INICIO
EN EDAD INFANTO-JUVENIL
Y ADULTA
Bases racionales para
el diagnóstico diferencial
y el tratamiento
Dr. Gustavo D. Frechtel
Dr. Edgardo Poskus
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Diabetes mellitus autoinmune de inicio en edad infanto-juvenil y adulta
INDICE
PRÓLOGO
SECCIONES
1. GENÉTICA GENERAL.
2. DIABETES TIPO MODY: MODELOS DE ENFERMEDADES
MONOGÉNICAS.
3. POLIMORFISMOS EN SALUD Y EN ENFERMEDAD.
DIABETES ENTRE LAS ENFERMEDADES POLIGÉNICAS.
4. BASES DE INMUNOLOGÍA GENERAL Y AUTOINMUNIDAD.
5. INMUNOGENÉTICA Y DIABETES MELLITUS AUTOINMUNE.
6. LOS MÉTODOS ANALÍTICOS PARA EL APOYO DIAGNÓSTICO
DE DIABETES.
7. LA DIABETES AUTOINMUNE EMERGENTE EN EDAD
INFANTO-JUVENIL Y ADULTA.
8. CASOS MODELO.
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PRÓLOGO
La historia de la diabetes mellitus es tan vieja como la propia
historia del hombre. Sin embargo se tardó bastante, aún dentro de la Era Contemporánea cuando la Medicina ya alcanza
un grado de considerable desarrollo, para comprender que la
diabetes constituye una patología más heterogénea que lo
sospechado inicialmente. Las dos variantes mayores, reconocidas formalmente desde la década de 1930, eran la diabetes insulinodependiente (denominada actualmente diabetes tipo 1),
típica de los niños y jóvenes y la diabetes no insulinodependiente (denominada actualmente diabetes tipo 2), típica de los
adultos. Desde entonces los nuevos nombres incorporados para las formas “atípicas”, y la anarquía en la nomenclatura para las formas intermedias, condujeron a una confusión clasificatoria que en buena medida perdura en la actualidad. Así,
fueron surgiendo sucesivamente nombres alternativos para las
nuevas variantes genéticas: en los MODY se reconocieron 6 tipos; en las variantes de diabetes emergentes en los adultos,
asociadas con autoinmunidad, las de tipo 1 se separaban penumbrosamente de las de “tipo 1.5”. De ahí que surgiera inicialmente el nombre de diabetes tipo 2-IR (insulinorrequiriente), aunque después quedara comprendido en la definición general de “LADA”. Posteriormente esta nomenclatura pareció
imprecisa y se propuso la subdivisión en LADA-tipo 1 y LADAtipo 2. El problema central no reside en los formalismos de nomenclatura, sino en la incertidumbre diagnóstica, la cual a su
vez se propaga en intervenciones terapéuticas erróneas o instaladas a destiempo. La administración indebida de antidiabéticos orales, principalmente del tipo sulfonilureas y la postergación del pase al tratamiento insulínico en los pacientes con
agresión inmunológica en curso hacia los islotes, son los casos
más representativos de desaciertos terapéuticos. La única luz
tendiente a despejar ese panorama parece ser el establecimiento firme de las bases etiopatogénicas que conducen a los
distintos fenotipos.
Los intentos clasificatorios más recientes, y por ende el enfoque terapéutico preciso de los distintos modelos de diabetes,
ya no provienen de supuestos refinamientos en el estudio “clásico” de los fenotipos, sino en la incorporación de los elementos de apoyo diagnóstico que provee la Genética y la Inmunología. Dentro de ésta última se ha producido un notable avance, principalmente en el área de la autoinmunidad. A partir de
esa evolución del conocimiento hoy se sabe, por ejemplo, que
la diabetes asociada a autoinmunidad, tradicionalmente asimi-
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lada a la diabetes tipo 1 infanto-juvenil, se encuentra mayoritariamente expresada entre los pacientes diabéticos diagnosticados en edad adulta, aunque su prevalencia relativa sea menor que la registrada en pediatría. Inversamente, la diabetes
no insulinodependiente, con un grado variable de insulinorresistencia periférica y defecto secretorio de las células beta, se
manifiesta no sólo entre los adultos, sino en forma creciente
entre niños y jóvenes, asociada con sobrepeso y obesidad. Esa
recíproca “invasión” de las fronteras de la clasificación original
en diabetes tipo 1 y tipo 2, no sólo torna cada vez más penumbrosa la intersección del diagrama epidemiológico, sino que
explica la existencia frecuente de incertidumbres diagnósticas
en la práctica asistencial y los errores en los tratamientos.
El esfuerzo que deben realizar los profesionales involucrados
en la medicina asistencial de la diabetes para actualizarse en
esta área es considerable. Ello resulta perentorio sobre todo si
tales profesionales se sienten llamados a incorporar a la práctica cotidiana de la Medicina Diabetológica los avances consensuados de la Genética y de la Inmunología en esa subárea.
La profusa bibliografía internacional en el tema torna dificultosa no sólo la lectura de actualización, sino su interpretación
acabada, ya que la jerga técnica se torna cada vez más compleja. En la actualidad solicitar análisis como los de genotipificación de ADN para alelos HLA del locus DQB, o seleccionar criteriosamente los análisis mínimos de marcadores de autoinmunidad, significa manejar fluidamente los algoritmos analíticos
y poder interpretar los informes de laboratorio correctamente.
En forma coincidente con esta percepción de la realidad vigente, el presente artículo intenta facilitar el acceso de los profesionales médicos a las fronteras del tema, haciendo una revisión crítica de la bibliografía más actualizada y transfiriéndola
en términos de divulgación. Además incorpora las experiencias
recogidas en un proyecto de investigación en curso, Programa
prospectivo de Autoinmunidad en el Diabético Adulto (Programa ADA), propuesto y administrado por la Sociedad Argentina de Diabetes a través de su Comité de Genética Inmunología y Prevención de la Diabetes*. Para ello este volumen incorpora una breve revisión de los capítulos básicos de Genética e
Inmunología, con un glosario práctico mínimo, antes de abocarse al desarrollo principal del tema y a los algoritmos recomendados.
* Nota: El mencionado Comité ha recibido para el Programa ADA el valorable apoyo
financiero inicial de Química Montpellier y de Novo Nordisk. En la etapa siguiente los
autores de esta Separata han conseguido el soporte económico de la Universidad de Buenos
Aires a través del subsidio UBACYT 2004-2007, Urgencia Social código B708.
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Finalmente, se incorporan algunos casos modelos, escogidos
entre las fichas de la actividad multiprofesional que realizan
conjuntamente los autores desde hace varios años, en los ámbitos de los centros asistenciales y de investigación en los cuales actúan: el Dr. G. D. Frechtel en la División Genética del Hospital de Clínicas, J. de San Martín, UBA y el Dr. E. Poskus, en la
Cátedra de Inmunología e Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA.
1. GENÉTICA GENERAL
EL ESTADO ACTUAL DEL DESARROLLO DE LA GENÉTICA MOLECULAR
Las herramientas con que cuenta la Biología Molecular para el
estudio de las enfermedades hereditarias han ido avanzando
desde fines de la década del 70 hasta la actualidad. Desde la
técnica de Southern Blot en 1975, con la utilización de enzimas
de restricción, transferencia de ADN a soporte sólido, e hibridización con sondas marcadas con 32P, se posibilitó el estudio de
grandes tramos de secuencia de ADN. La técnica denominada
PCR, desarrollada a partir de 1990, permitió la amplificación en
millones de veces de una pequeña secuencia de ADN y también
facilitó el estudio de mutaciones. Las técnicas de clonado y cultivo para permitir la multiplicación de fragmentos de ADN también han facilitado enormemente el trabajo en el laboratorio.
La irrupción de estas diferentes metodologías acopladas a PCR
permitieron el estudio de mutaciones puntuales, pequeñas inserciones o deleciones, e incluso el screening masivo de grandes poblaciones de enfermos con una determinada patología. El avance en las técnicas de secuenciación, incluyendo la utilización actual de la secuenciación automática de nucleótidos, también ha
facilitado en muchos casos la búsqueda directa de mutaciones.
El desarrollo del conocimiento en el genoma humano favorece la identificación de la secuencia de nuevos genes y la determinación de nuevos polimorfismos, con el objetivo final de conocer la secuencia completa de las 6.000 millones de pares de
bases (pb) que constituyen el genoma humano diploide.
Las actuales técnicas de clonado en vectores de expresión y
luego el estudio funcional de la proteína expresada, permiten
clarificar con exactitud si una alteración genética tiene repercusión sobre la actividad funcional de la proteína. De esta manera, con la actual contribución de la tecnología y las metodologías con que cuenta la Biología Molecular se están estudiando los aspectos estructurales y funcionales de los genes. En
particular, los trabajos de la última década aplicados al estudio
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de la diabetes, tanto de tipo 1 como de tipo 2, han contribuido a develar algunos de los mecanismos básicos implicados en
este grupo heterogéneo de enfermedades.
Para una comprensión más acabada de todos los temas reseñados, abordaremos someramente los contenidos elementales de
la Genética Molecular, para luego introducirnos en las enfermedades poligénicas, entre las cuales se encuentran las distintas formas de diabetes mellitus.
LAS BASES DE LA GENÉTICA MOLECULAR
El ADN es una estructura de doble hélice, que se encuentra en
el núcleo de la célula, constituido por unidades de nucleótidos
(Base nitrogenada + Desoxirribosa + Fosfato), unidos entre sí
por puentes fosfodiester. Las cuatro bases nitrogenadas son:
Adenina (A), Guanina (G), representan las bases púricas, Citosina (C) y Timina (T), las bases pirimídicas. Las dos cadenas de
ADN entre si se encuentran unidas por puentes de hidrógeno,
que unen una base púrica a una pirimídica. Dos puentes de hidrogeno unen A a T y tres puentes de hidrógeno unen C a G.
Cada célula posee una versión del genoma completo en su
ADN, lo cual significa la existencia de una copia completa de
todos los genes y las correspondientes regiones intergénicas.
Luego cada gen ejerce su acción a través de su expresión regulada a través de la maquinaria de biosíntesis celular, la cual
produce la traducción de la secuencia nucleotídica en términos
de la secuencia aminoacídica de la proteína correspondiente.
De ese modo la expresión de los genes se logra de manera “tejido específica”: el gen codificante para la albúmina se expresa en el hígado, el gen codificante para la insulina se expresa
en las células beta de los islotes pancreáticos, etc.
El genoma humano es diploide, por lo que existen dos copias
de ADN, uno heredado del padre y otro de la madre. El ADN
se copia en otra versión duplicada, proceso denominado replicación, lo cual significa que cada cadena molde da origen a
una nueva cadena durante la división celular. Este ADN, constituido por las 6.000 millones de pb según hemos mencionado, está ordenado y dividido en 46 cromosomas: 22 autosómicos, heredados del padre, otros 22 heredados de la madre, y
2 cromosomas sexuales. Pero sólo el 10% del genoma humano así organizado codifica para la síntesis de proteínas. Esto
es, tan sólo el 10% del archivo de ADN está constituido por
genes que se traducen en un producto proteico con funciones
celulares determinadas. Un gen se define entonces como la
unidad funcional del genoma que expresa una proteína. En
otros casos, como en el de los genes que codifican para los an-
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ticuerpos y los receptores de linfocitos T, la situación es un poco más compleja y varios genes originales empaquetados en
regiones contiguas se recombinan para constituir el gen funcional que finalmente se traduce en la proteína específica.
La expresión de un gen sin embargo no se produce directamente, sino que existe un mecanismo intermedio por el cual se
produce el pasaje de la información genética a otra secuencia
polinucleotídica semejante a la del ADN, basada en el ácido ribonucleico o ARN. El tramo de la secuencia implicado en el
mensaje que finalmente se traduce como proteína se denomina ARN mensajero (ARNm). El mensajero es entonces la porción copiada a partir del ADN en un idioma ligeramente distinto, el de las bases y azúcares propios del ARN, pero que conserva estrictamente la secuencia codificante. Este proceso de
transferencia informativa entre los dos polinucleótidos se denomina transcripción. El ARNm es exportado del núcleo al citoplasma celular y a nivel del retículo rugoso, donde sa hallan
los ribosomas, sirve de molde para la síntesis de la proteína. Este proceso implica un cambio sustancial de idioma, ya que la
secuencia polinucleotídica original del gen se traduce en la secuencia polipeptídica de la proteína, por lo cual se lo denomina como traducción. Las proteínas están constituidas por cadenas cuyas unidades son los aminoácidos, por lo cual cada gen
que se expresa en una proteína tiene información codificada
para la secuencia aminoacídica en términos de sus propias unidades de lenguaje. Estas unidades son grupos de tres bases, o
tripletes, comúnmente denominadas codones. Por lo tanto el
proceso de la traducción consiste en el pasaje de un lenguaje
de palabras representados por codones agrupados secuencialmente de a tres letras en el ADN, que se transforman a un lenguaje de nuevas palabras representadas por los aminoácidos
en la proteínas. Hay 64 codones posibles (las 4 bases formando
tripletes configuran combinatorias para esos 64 codones) de
los cuales 61 codifican para los 20 aminoácidos y 3 son los denominados codones mudos o de terminación, los que señalan
con precisión el final de la síntesis de las proteínas.
El mecanismo de biosíntesis puede no terminar ahí, pues en los
organismos más evolucionados (eucariotas) muchas de las proteínas antes de dirigirse a los sitios celulares asignados sufren
un procesamiento post-traduccional. En esta etapa se adicionan componentes no peptídicos, como los denominados grupos prostéticos o los carbohidratos, los cuales les confieren las
propiedades estructurales y funcionales plenas.
Los tres procesos descriptos, replicación, transcripción y traducción constituyen el dogma central de la Biología Molecular. Pe-
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ro con esta descripción general del tema apenas nos hemos
aproximado al verdadero y complejo panorama de los procesos
involucrados en el archivo y ejecución de los mensajes genéticos.
Un gen frecuentemente está constituido por dos tipos de secuencias claramente distinguibles: los exones y los intrones. Los
exones comprenden las regiones codificantes, por lo cual representan los tramos de secuencias que dan origen al ARNm y conducen a la síntesis proteica. El nombre de exón proviene de su
naturaleza de “gen exportable” del núcleo al citoplasma. Los intrones son secuencias de ADN que se encuentran intercaladas
entre los exones, separándolos físicamente y cumpliendo funciones distintas a las de codificación para proteínas. Como son secuencias que quedan dentro del núcleo, sin una expresión traducible en la biosíntesis proteica, se les ha dado ese nombre.
En realidad el proceso de transcripción implica primero la
transferencia en bloque de toda la secuencia del gen, constituyendo el ARN premensajero o transcripto primario y luego se
produce la formación del ARNm maduro o definitivo a partir
del transcripto primario, por el proceso denominado splicing.
En esa etapa se separan los intrones y se empalman los exones
para conformar el ARNm maduro, el cual es exportado del núcleo con la secuencia que codifica para la proteína.
Cada gen tiene dos extremos, uno 5’ (denominado así por la
presencia de un grupo fosfato terminal en una cadena polinucleotídica) y un extremo 3’ (caracterizado por la presencia de un
grupo OH en el otro extremo de la cadena polinucleotídica). En
el extremo 5’ de cada gen se encuentra una secuencia de ADN
relacionada con la regulación de la expresión del gen, denominada región promotora. Sobre esta región actúan diferentes
factores proteicos, denominados factores de transcripción, que
regulan la expresión del gen, activándola o inhibiéndola, e incluso regulando su expresión tejido-específica. Por lo tanto, un
análisis del ARNm como producto directo de un gen nos permite estudiar la expresión de ese gen y la identificación del
ARNm en un tejido nos asegura que ese gen efectivamente se
está expresando en ese tejido.
2. DIABETES TIPO MODY: MODELOS DE ENFERMEDADES
MONOGÉNICAS
La diabetes tipo MODY (Maturity Onset Diabetes in Youngs) es
un subtipo de diabetes tipo 2 que habitualmente se presenta
en individuos menores de 25 años y tiene un modo de herencia autosómico dominante. Estos son pacientes que en general
son tratados con hipoglucemiantes orales.
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Los pacientes con diabetes tipo MODY son delgados, diferenciándose de los pacientes con diabetes tipo 2 de comienzo en
la niñez o en la adolescencia que tienen sobrepeso u obesidad
y en los cuales predomina como alteración fisiopatológica la
resistencia periférica a la acción de la insulina. Entonces en la
práctica asistencial un problema a resolver puede ser precisamente el de la categorización de los niños, o de los adolescentes con diabetes, como tipo 1 o como tipo MODY.
La diabetes tipo 1 en general no presenta antecedentes familiares, es una enfermedad poligénica determinada por genes
del sistema HLA (usualmente con genotipo DR3 - DR4, DQB
0201 - DQB 0302) y por genes conocidos como VNTR, ubicados
cerca del extremo 5´ del gen de la insulina. En cambio el tipo
MODY presenta otras bases genéticas diferentes. Últimamente
se ha caracterizado en gran parte la etiología genética de este
subtipo de diabetes, determinándose claramente que se trata
de una forma monogénica. Esta característica determinante de
gen único y con alta penetrancia ha hecho que la diabetes tipo
MODY sea denominada el paradigma de la diabetes tipo 2 y
que se constituya en un excelente modelo de estudio. En efecto, los enormes avances logrados en esta forma de diabetes
permite mejorar el conocimiento de la genética de la diabetes
tipo 2, de presentación tardía.
La prevalencia de la diabetes tipo MODY no está claramente
determinada, en tal sentido se presentan algunas dificultades,
ya que muchas veces la enfermedad no es diagnosticada hasta
la edad adulta y otras veces no se establece fácilmente el carácter autosómico dominante por carecerse del dato familiar o
por muerte prematura de los progenitores. De las prevalencias
conocidas, se puede afirmar que en India llega al 18% de todos los casos de diabetes diagnosticada antes de los 35 años;
en negros americanos alcanza al 10% de todas las formas de
diabetes y en Francia al 13% de las familias seleccionadas para
estudios genéticos.
La diabetes MODY 1 fue determinada en una familia denominada RW, estudiada en sus diferentes generaciones por Fajans,
que fue el primero en describir este tipo diabetes. En esta familia se halló un ligamiento a un microsatélite ubicado en el
cromosoma 20. Posteriormente se secuenció el gen causante de
este subtipo de diabetes MODY y se llegó a describir un factor
de transcripción denominado factor nuclear hepático 4 (HNF 4),
el que actúa sobre el gen de la insulina activando su expresión.
Se han descripto varias mutaciones en el gen del HNF 4 , las
cuales constituyen una causa poco común de diabetes tipo
MODY. Posteriormente Fajans determina en la familia RW que
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la alteración fisiopatológica de la diabetes tipo MODY se debe
a trastornos en la secreción de la insulina y no en la sensibilidad periférica a la misma. Los individuos de esta familia con
mutaciones en el gen HNF 4α, pasaron de una etapa de tolerancia normal a la glucosa a una hiperglucemia postprandial
(intolerancia a la prueba oral a la glucosa) y por último evolucionaron a una etapa final de hiperglucemia en ayunas. Los pacientes con mutaciones en el gen HNF 4 a presentan alteración
en la secreción de insulina cuando el estímulo se produce tanto con glucosa como con secretagogos diferentes, como por
ejemplo la arginina. Con lo cual se estaría demostrando la acción del HNF4 a en la vía final común de ambos estímulos, vale decir directamente sobre la expresión del gen de la insulina.
La identificación de polimorfismos en el gen de la glucoquinasa,
facilitó los estudios genéticos en cuanto al rol de este gen en el
desarrollo de diabetes tipo MODY y aclaró el rol de la enzima
glucoquinasa en relación a la fisiología de la secreción de la insulina y su participación en la etiopatogenia de la diabetes tipo
MODY. Así, la diabetes MODY 2 se ha constituido en el paradigma de la detección de alteraciones genéticas en la diabetes,
siendo éste el primer subtipo de diabetes en el cual se determina fehacientemente una alteración genética, aunque de tipo
monogénico, pudiéndose establecer una relación lineal entre el
genotipo y el fenotipo de la enfermedad. Froguel, en su estudio
de pacientes tipo MODY en la población francesa determina
que la diabetes MODY 2 corresponde al 64% de los pacientes
con este tipo de diabetes. Por otro lado, en el estudio realizado
en Alemania la frecuencia de diabetes MODY 2 fue del 8% y en
el trabajo realizado en España la frecuencia fue del 25%.
El gen de la enzima glucoquinasa está constituido por 12 exones,
tiene 50.000 pb y mapea en el brazo corto del cromosoma 7.
Este gen se expresa en dos tipos celulares, la célula ß del páncreas y el hepatocito; además se sabe que la expresión del gen
es regulada por 2 promotores tejido específicos que regulan la
expresión en cada uno de ellos. Los exones 2-10 son comunes
a ambos tejidos, el exón 1a es expresado específicamente en la
célula β y los exones 1b y 1c se expresan en el hígado. Se conocen actualmente más de 150 mutaciones en este gen, el 80%
de las mismas se encuentran en 6 exones (1a, 4, 5, 6, 7 y 8). La
mayoría de las mutaciones corresponden a cambios de un aminoácido debido a mutaciones puntuales en el gen, y el resto
representan mutaciones en la región intrón / exón que alteran
el proceso de splicing, dando lugar a la formación de ARNm alterados. Ocho mutaciones determinan la aparición de codones
de stop tempranos, de manera tal que se sintetiza una proteí-
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na truncada. Queda abierta la posibilidad de hallar nuevas mutaciones a medida que sean estudiadas nuevas poblaciones y
otros grupos étnicos.
La enzima glucoquinasa fosforila la glucosa a glucosa 6 fosfato y, de esta manera, asegura el ingreso de la glucosa a la célula. La conversión de glucosa a glucosa 6 fosfato se produce
cuando los niveles de glucemia son altos, como por ejemplo en
el estado postprandial. La forma de herencia autosómica dominante implica que tanto la célula ß como el hepatocito expresan la forma normal y la forma mutada de la enzima. De esta manera las mutaciones en el gen de la glucoquinasa producen una disminución de la entrada y metabolización de la glucosa a la célula ß del páncreas y así una menor activación de la
síntesis y secreción de la insulina. Por otro lado se produce un
menor ingreso y metabolización de la glucosa en el hígado con
el consecuente aumento de la producción hepática de glucosa.
En general los pacientes no son totalmente deficientes en glucoquinasa ya que heredan la mutación en forma autosómica
dominante y así son heterocigotas para esa mutación. Por lo
tanto tienen niveles de glucoquinasa que se hallan alrededor
del 50% de lo normal y este nivel de actividad enzimática no
es suficiente para asegurar una función metabólica normal en
la célula ß y en el hígado. Esto determina la presentación de
una forma de diabetes moderada que puede ser controlada
con dieta o con hipoglucemiantes orales, sin llegar a necesitar
insulinoterapia. En resumen, las mutaciones en el gen de la
glucoquinasa causan hiperglucemia, la cual se presenta fundamentalmente en el período postprandial, debido a la falta de
estímulo de la glucosa en la síntesis y secreción de insulina.
Las mutaciones en el gen de glucoquinasa inciden de manera diferente en la mecánica funcional de la enzima, ya que pueden
alterar directamente su actividad catalítica, distorsionar la estructura de la enzima (causando indirectamente menor actividad enzimática), o alterar su estructura conformacional, afectando su unión a la glucosa o a la proteína reguladora de la glucoquinasa. Esta proteína alterada inhibe a la glucoquinasa intacta al actuar en forma competitiva a través de la glucosa.
Es de destacar que cuando la secreción de insulina se estimula
por otros medios, como por ejemplo el estímulo con arginina
por vía endovenosa, la repuesta pancreática al estímulo no
presenta diferencias entre pacientes con diabetes MODY 2 y el
grupo control sin diabetes.
La mayoría de las mutaciones en el gen de la glucoquinasa se
hallan en los exones comunes que se expresan en el hígado y
en la célula ß del páncreas, por lo tanto es de esperar que la ac-
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tividad enzimática de la glucoquinasa hepática también se halle alterada. Por ello, se ha investigado el efecto de las mutaciones sobre la enzima en el hígado y su efecto en la patogénesis
de la diabetes. Así, se demostró que los pacientes diabéticos
MODY 2 tienen un menor contenido de glucógeno hepático
que los individuos controles y además tienen una mayor producción hepática de glucosa a través de la gluconeogénesis. Los
pacientes con diabetes subtipo MODY 2 desarrollan diabetes
antes de la pubertad y presentan un descontrol metabólico leve. Además, estos pacientes en general no desarrollan complicaciones crónicas tanto microvasculares como macrovasculares.
A principios de la década de 1990 en pacientes con diabetes tipo MODY que no habían sido clasificados dentro de los subtipos 1 o 2, se llevó a cabo un estudio de ligamiento en diferentes cromosomas del genoma, hallándose un ligamiento positivo de estos enfermos con un microsatélite ubicado en el brazo
corto del cromosoma 12. Así quedó establecido el tercer locus
genético relacionado a diabetes tipo MODY, por lo cual los pacientes con esta alteración se encuadran bajo la denominación
de subtipo 3. En esta región genómica fueron secuenciados 14
genes diferentes, entre ellos el gen del factor nuclear hepático 1a (HNF 1 a), un factor de transcripción que activa la expresión del gen de la insulina. En este gen se han reconocido más
de 45 mutaciones que, consecuentemente, producen disminución en la secreción de insulina, con un cuadro clínico similar al
de la diabetes MODY 1. La clínica de esta forma de diabetes es
más severa, ya que la hiposecreción de insulina, y por lo tanto
la hiperglucemia, tanto de ayunas como post-prandial, es mayor en los MODY 3 que en los MODY 2. Además, los primeros
tienen tendencia a las complicaciones microvasculares y es necesario el tratamiento con insulina para obtener un adecuado
control metabólico, lo que no ocurre habitualmente con los
pacientes MODY 2.
Otra diferencia clara entre MODY 2 y MODY 3 parece ser la
edad de presentación de la enfermedad. Los pacientes con diabetes MODY 3 inician la diabetes después de la pubertad,
mientras que los pacientes con diabetes subtipo MODY 2 lo hacen, como fue dicho, antes de la pubertad.
El HNF 1 α tiene una función de activación sobre la expresión
de genes que codifican enzimas claves de la glucólisis. Por lo
tanto, al presentar la proteína HNF 1 α una secuencia aminoacídica alterada, debido a la presencia de mutaciones presentes
en el gen, se ve disminuida la expresión de estas enzimas claves de la glucólisis y en consecuencia se ve alterada la vía oxidativa de la glucosa, que es clave en la activación de la secre-
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ción de insulina. Así, como fue mencionado, los pacientes con
diabetes MODY 3 con mutaciones en el gen HNF 1α tienen hiposecreción de insulina que se presenta en forma más severa,
comparada con los pacientes MODY 2.
Frayling y col. demostraron que las mutaciones en el gen HNF 1α
son una causa frecuente de MODY en pacientes de origen británico, ya que se encontraron mutaciones en el 73% de los pacientes con diabetes tipo MODY estudiados. Esta mayor prevalencia
también fue hallada en la mayoría de las poblaciones estudiadas.
Los pacientes con diabetes MODY 3 tienen una alteración en la
secreción de insulina más severa que los MODY 2, por lo cual en
la mayoría de los casos los pacientes deben ser tratados con insulina a lo largo de la evolución de la enfermedad.
La diabetes MODY 4 se debe a la presencia de mutaciones en
el gen del factor promotor de la insulina 1 (IPF 1). Los ratones
knock-out para este gen tienen agenesia pancreática, situación
que podría ser reproducida en humanos con mutaciones en
forma homocigota en el gen IPF 1. Cuando las mutaciones se
presentan en forma heterocigota causan diabetes tipo MODY 4.
Ha sido publicado un caso de un paciente con diabetes y agenesia pancreática con mutaciones en forma homocigota en este gen. De esta manera se demuestra que el IPF 1 está implicado como factor de transcripción no sólo en el gen de la insulina, sino en la regulación de la expresión de otros genes relacionados con el desarrollo de la célula ß del páncreas. La forma de diabetes MODY 4 ha presentado una baja frecuencia en
las diferentes poblaciones de diabéticos MODY estudiadas.
En el reconocimiento de la participación de 3 factores de transcripción en la génesis de la diabetes tipo MODY, un grupo de investigadores japoneses estudió las mutaciones en otro factor de
transcripción que activa la expresión del gen de la insulina, el
denominado factor nuclear hepático 1 ß (HNF 1 ß). Hallaron mutaciones en este gen en dos familias de origen japonés que tenían hiposecreción de insulina, por lo cual a esta alteración se la
denominó como diabetes MODY 5. Los pacientes con mutaciones en el gen HNF 1 ß desarrollan, además de diabetes, nefropatía e hipertensión arterial. La forma de diabetes MODY 5 resultó ser muy poco frecuente en otras familias de origen caucásico con diabetes tipo 2 de origen indeterminado.
El MODY subtipo 6 se produce por la presencia de mutaciones
en otro factor de transcripción denominado Neuro D1. Es un
subtipo de diabetes recientemente descripto, por lo que no
hay mucha experiencia clínica sobre el mismo. Neuro D1 es un
factor de transcripción que regula el desarrollo pancreático y
la expresión del gen de insulina. Se han diagnosticado pacien-
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tes entre los 17 y los 60 años. Algunos de estos pacientes tienen obesidad, resistencia a la insulina e hiperinsulinemia, características de la diabetes tipo 2 tardía. De acuerdo al tipo de
mutación hallada se decidirá el tratamiento más adecuado con
insulina o antidiabéticos orales.
En conclusión, la diabetes tipo MODY es un síndrome heterogéneo, desde un punto vista genético, metabólico y clínico,
constituyendo una forma monogénica dentro de una enfermedad poligénica como es la diabetes. El denominador común
es que todos los pacientes con diabetes tipo MODY tienen hiposecreción de insulina como factor desencadenante primario.
Estos hallazgos abren un nuevo camino en el entendimiento
de la diabetes MODY y posiblemente de algunas formas de
diabetes tipo 2 de aparición tardía.
3. POLIMORFISMOS EN SALUD Y EN ENFERMEDAD.
DIABETES ENTRE LAS ENFERMEDADES POLIGÉNICAS
POLIMORFISMOS GENÉTICOS EN SALUD Y EN ENFERMEDAD
Ya hemos mencionado que sólo el 10% del genoma tiene secuencias correspondientes a las unidades funcionales del mismo, o sea los genes que codifican para proteínas. ¿En que
consiste entonces el resto mayoritario del archivo genético?
Se sabe que esa porción de ADN contiene secuencias intergénicas, entre las cuales hay un importante número de las denominadas secuencias polimórficas. El polimorfismo significa
una secuencia de ADN que varía de individuo a individuo y
que es transmitida de padres a hijos. Estas secuencias polimórficas son las permiten la identificación de individuos y la determinación o exclusión de paternidad, constituyendo las huellas digitales genéticas de un individuo. Estos polimorfismos
constituyen, en su mayoría, secuencias repetitivas que se ubican tanto en regiones intergénicas como en los genes, ya sea
en sus intrones o en sus exones. Tales secuencias repetitivas están conformadas por unidades, las cuales se repiten en tandem un número determinado de veces. De acuerdo al tamaño
de la unidad repetitiva se los clasifica como microsatélite:
cuando la unidad repetitiva está constituida por 2 o 3 nucleótidos y en minisatélite: cuando la unidad repetitiva está constituida por más de 4 o 5 nucleótidos. Cada unidad se repite un
número variable de veces para cada polimorfismo en particular, constituyendo el tramo de secuencia completa para ese
polimorfismo. Dentro de los minisatélites se encuentran los
VNTR (la sigla inglesa significa número variable de repeticiones en tandem). Según se verá en la sección 5. Inmunogenética
14
y diabetes mellitus autoinmune, ese polimorfismo vecino al
gen de la insulina guarda relación con la susceptibilidad para
la diabetes tipo 1.
Otra forma de polimorfismo, con aplicaciones en el estudio de
las enfermedades genéticas, es el cambio de una base por otra
en una determinada región del genoma denominado SNP (del
inglés, Single Nucleotide Polymorphism). Dentro de esta categoría se incluyen las variantes polimórficas del HLA, en las cuales
pueden ocurrir más de un SNP en cada alelo. Si ese polimorfismo ocurre en un sitio específico para determinar el corte con
una enzima de restricción en particular, tal cambio determina la
pérdida de ese sitio. Eso no sólo tiene repercusión en que la enzima en cuestión no pueda cortar el ADN en ese preciso sitio, sino que un polimorfismo dado también puede crear un nuevo sitio de restricción para otra enzima diferente (existe una gran colección de estas enzimas aisladas de la naturaleza y disponibles
para el manipuleo analítico de la Biotecnología). De esta manera se permite un corte en un sitio del ADN donde anteriormente no existía la posibilidad de fragmentar la cadena con esa segunda enzima. Como se aprecia a partir de ese ejemplo, ambos
tipos de polimorfismos generan fragmentos nucleotídicos de tamaño diferente, por lo cual en ambos casos las variantes polimórficas pueden ser identificadas cortando el ADN con la enzima de restricción adecuada y utilizando la técnica denominada
Southern Blot o la de PCR (ver tales técnicas en la sección 6. Los
métodos analíticos para el apoyo diagnóstico de diabetes). Estos polimorfismos son característicos de individuos o de grupos
tales como, familias, poblaciones cerradas, etnias o razas, y muchas veces se encuentran ligados o asociados a alteraciones en
los genes, las que determinan la presencia de una enfermedad
hereditaria o genética. La asociación entre el polimorfismo y la
enfermedad se realiza a través de análisis estadísticos que permiten precisar objetivamente esta asociación o ligamiento. Actualmente se está avanzando aceleradamente en el esclarecimiento de ligamientos de polimorfismos con enfermedades
complejas como la diabetes, lo que permite identificar los genes
involucrados en la etiología de la enfermedad.
El avance en el conocimiento del genoma humano permite la
utilización de más polimorfismos con la finalidad de establecer
su ligamiento a diabetes tipo 2. Las alteraciones en los genes
ubicados en cromosomas autosómicos que producen enfermedades hereditarias son clasificadas clásicamente en dominantes y recesivas. Eso implica la presencia de una forma normal y
otra alterada de las dos versiones (alelos) del par de genes en
las células diploides del organismo. Por ello el genotipo corres-
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pondiente a esos individuos se define como heterocigota y es
causante de las enfermedades autosómicas dominantes.
Las enfermedades autosómicas recesivas están determinadas
por la presencia de una forma patológica en ambos alelos, si la
mutación es exactamente la misma en ambos alelos, el genotipo es homocigota. Si la mutación es diferente en un alelo respecto del otro, el genotipo se denomina doble heterocigota.
La repercusión funcional será la misma en el caso de un homocigota que en el de un doble heterocigota. En las enfermedades autosómicas recesivas el genotipo heterocigota convierte
al individuo en portador.
Las alteraciones que modifican la estructura normal de ADN y
constituyen la base de una patología, pueden ser clasificadas en
macrolesiones y microlesiones. En la diabetes tipo 2 se han descripto microlesiones como factores determinantes de la etiología
genética de la enfermedad (generalmente SNPS). Estas alteraciones genéticas pueden ser de origen hereditario o producirse en
un individuo a lo largo de la vida por la acción de agentes químicos o físicos (radiaciones, radicales libres), o por errores fortuitos
en el proceso de la replicación.
Si la alteración genética se produce en un determinado órgano o tejido, la patología sólo se expresará en éstos, de acuerdo a la proteína afectada, y la enfermedad no será transmitida a la descendencia (mutaciones somáticas).
La técnica denominada Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR) es un procedimiento rápido y eficiente para amplificación in vitro de porciones predeterminadas de ADN (véase la
descripción más detallada de esta técnica en la sección 6. Los
métodos analíticos para el apoyo diagnóstico de diabetes), lo
cual permite diagnosticar directamente a nivel molecular la
presencia de microlesiones en el ADN. Según el diseño de los
oligonucleótidos “cebadores” (primers) que flanquean ambos
lados de la región escogida, se posibilita la amplificación selectiva desde pequeñas secuencias de ADN (200 a 1000 pb) hasta
tramos de 20.000 pb.
DIABETES ENTRE LAS ENFERMEDADES POLIGÉNICAS
Las enfermedades poligénicas, mejor denominadas como complejas o multifactoriales, están determinadas por alteraciones
en una cierta cantidad de genes que predisponen al desarrollo
de estas patologías, siendo los factores ambientales los desencadenantes de las mismas. Está claro que es necesaria la interacción entre el factor genético (llamado factor de susceptibilidad) y el ambiental (factor gatillo o desencadenante) para
que la enfermedad se desarrolle.
16
En general, este tipo de patologías tiene una considerable agregación familiar. El riesgo de contraer una enfermedad poligénica en los familiares de primer grado es del orden del 5 al 15%,
dependiendo este porcentaje de la enfermedad en cuestión. Entre las enfermedades poligénicas se pueden mencionar las siguientes: diabetes, esquizofrenia, enfermedad tiroidea, hipertensión, dislipemia, cardiopatía coronaria, obesidad, etc.
Además, el riesgo de contraer una enfermedad multifactorial
varía de una familia a otra, dependiendo este riesgo de la gravedad de la alteración genética, del número de individuos
afectados en esa familia y de la contribución de los factores
ambientales.
Las enfermedades complejas no siguen un modo de herencia
mendeliano simple, como ocurre en las enfermedades hereditarias monogénicas. Sin embargo en ciertas formas clínicas de las
enfermedades multifactoriales con patrones fenotípicos específicos se ha hallado la alteración de un solo gen, las que constituyen formas monogénicas dentro de las enfermedades poligénicas, como por ejemplo en la diabetes de tipo MODY, en la hipercolesterolemia familiar, el defecto familiar de Apo B 100, etc.
El tipo de herencia de las enfermedades poligénicas no está
completamente establecido. En particular se desconoce si la causa genética de las mismas está determinada por un sitio principal en el ADN (locus mayor) que, en conjunción con loci menores, ocasiona la mayoría de los casos o si, por el contrario, son varios loci menores determinantes de un porcentaje pequeño de
casos, los que determinarían una importante dispersión entre
las diferentes alteraciones genéticas. Debemos tener presente
que la complejidad deriva del importante número de moléculas
potencialmente implicadas, como enzimas, receptores, transportadores, reguladores de la actividad enzimática, reguladores
de la expresión de genes que intervienen en el metabolismo para mantener normales las concentraciones de glucosa, colesterol, triglicéridos, o los valores de presión arterial. Los desequilibrios en estos parámetros representan la manifestación fenotípica compleja de las enfermedades poligénicas más comunes.
Uno de los caminos estratégicos que se ha seguido para determinar las causas genéticas de las enfermedades complejas, es
el análisis de ligamiento de polimorfismos con la enfermedad,
es decir establecer la relación de la enfermedad con un marcador genético polimórfico, cercano al cual se encontrará el gen
afectado.
Es probable que la frecuencia de los polimorfismos haya aumentado debido a una selección positiva que actúa sobre las
variables que confieren una ventaja evolutiva. Las variantes po-
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limórficas que confieren susceptibilidad a las enfermedades hereditarias poligénicas tienen, indudablemente, una alta prevalencia en la población. Es muy probable que esos polimorfismos
hayan contribuido a mantener las concentraciones normales de
glucosa, colesterol, presión arterial, etc., en nuestros antepasados cazadores-recolectores y que esos mismos polimorfismos
respondan adversamente al sedentarismo y a la sobrealimentación (factores ambientales), propios de las sociedades contemporáneas, con una creciente predisposición a las enfermedades
multifactoriales que afectan al hombre moderno. Como fue expresado, en general los polimorfismos no representan alteraciones funcionales en los genes, pero pueden estar estrechamente ligados a una variación genética que determine un cambio en el fenotipo. Esta asociación está determinada por el desequilibrio de ligamiento entre el polimorfismo y la mutación.
Por ello se dice que existe desequilibrio de ligamiento cuando
dos polimorfismos se encuentran asociados en una población
con una frecuencia mayor a la que se esperaría sólo por azar.
Esto significa que ambos polimorfismos están estrechamente ligados y cercanos en el mismo cromosoma y co-segregan en los
estudios familiares. El hallazgo de una asociación entre una enfermedad y un polimorfismo implica que la selección natural ha
aumentado la frecuencia del alelo portador del polimorfismo
marcador y el polimorfismo causal, en una determinada familia
o población. Para que esto ocurra, se debió producir una cosanguineidad significativa en la población en la que se inició y
propagó el polimorfismo causal. Además, durante un período
de tiempo considerable debió producirse una “estabilidad poblacional”, tras la aparición conjunta de la mutación genética y
el polimorfismo marcador. Se han hallado polimorfismos marcadores asociados a mutaciones en genes que codifican proteínas importantes en la determinación de la concentración de lipoproteínas, la glucemia y la presión arterial. Estas alteraciones
genéticas producen diferentes fenotipos dentro de patologías
como las dislipemias, la diabetes y la hipertensión arterial.
El otro camino estratégico para el estudio de enfermedades
genéticas es la búsqueda de polimorfismos en genes candidatos. Se utiliza el término candidato cuando, por razones funcionales, un gen, al expresar una mutación en la proteína que
codifica, tiene amplias probabilidades de causar una determinada patología. Sobre todo se aplica en aquellas en las cuales
existen proteínas involucradas en una vía metabólica, sean
proteínas transportadoras, receptores, reguladores de vías metabólicas, o incluso proteínas relacionadas con la regulación de
la expresión de genes. Las mutaciones en genes candidatos
18
constituyen el sustrato de estudio de las enfermedades monogénicas, es muy probable que, en las enfermedades poligénicas, sea necesario el efecto acumulativo de alteraciones genéticas (polimorfismos) en diversos loci para que la enfermedad
multifactorial se desarrolle, como por ejemplo en el caso de la
diabetes tipo 2, en la que es necesario la conjunción de polimorfismos en genes relacionados con la secreción de insulina y
con la acción periférica de la misma.
Como ya se dijo, los polimorfismos en si mismos no constituyen
el resultado de errores o cambios filogénicos fallidos, sino que
resultaron del fenómeno evolutivo determinante de la diversidad genética. Esta a su vez determinó la capacidad adaptativa
del hombre y de los seres vivos en general, para hacer frente a
los desafíos del medio ambiente. Cuando las necesidades adaptativas, durante la evolución de las especies, han ejercido mayores presiones y una alta velocidad en los cambios, los mecanismos genéticos implicados en la herencia y en la defensa acompañaron el cambio con el desarrollo de otras formas de generación de diversidad. Tal es el caso de la recombinación de genes
y los ejemplos prototípicos de ello son las recombinaciones de
genes del Sistema Inmune Adaptativo, denominados V, D y J. Estos genes (unos pocos centenares) se “barajan” (shuffling) y se
recombinan para dar millones de variantes potenciales de
ARNm, lo cual conduce a su vez al exhuberante repertorio de receptores de los linfocitos B y T y de los anticuerpos (véase este
tema en la sección 5. Inmunogenética y diabetes mellitus autoinmune). La enfermedad poligénica diabetes tipo 1 está condicionada por el concurso de varios genes de susceptibilidad, entre los cuales predominan los del sistema polimórfico HLA, pero
también participan en alguna medida los genes recombinados
del Sistema Inmune que finalmente condicionan la intensidad
de la respuesta autoagresiva hacia los islotes pancreáticos.
Como puede apreciarse, a diferencia de las enfermedades monogénicas, donde los errores a nivel genético condicionan unívocamente la expresión clínica de la patología, las enfermedades poligénicas están condicionadas por una combinatoria
compleja de genes normales emergentes de multialelismo o de
recombinación que confieren una matriz de susceptibilidad.
4. BASES DE INMUNOLOGÍA GENERAL Y AUTOINMUNIDAD
EL SISTEMA INMUNE
Durante la evolución de los organismos multicelulares primitivos probablemente se seleccionaron una serie de mecanismos
constitutivos de la denominada inmunidad natural o innata,
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por medio de la cual se reconocían sustancias nocivas y microorganismos potencialmente agresores. Posteriormente la
evolución condujo a una forma de inmunidad adquirida, adaptativa, o también llamada específica.
Tal vez la función principal de este sistema “moderno” con un
amplísimo espectro de reconocimiento molecular topográfico
y profundo se consolidó como una herramienta poderosa para
la vigilancia de la identidad propia. Como una derivación de
ello, se podrían reconocer las estructuras foráneas y de alguna
manera conducir a su eliminación. Sin embargo, la alta complejidad del nuevo sistema no quedó libre de posibles errores
y al identificar los agentes infecciosos también se posibilitaría
el reconocimiento de macromoléculas muy similares dentro
del propio organismo.
El Sistema Inmune de los mamíferos actuales consta de un conjunto armónico de células y macromoléculas solubles que actúan como mensajeros intercelulares, las citoquinas, o como anticuerpos, uniéndose a los antígenos y promoviendo su eliminación. Esa división simplificada facilita la presentación de las dos
principales ramas (celular y humoral) del Sistema Inmune, involucradas en el reconocimiento de los antígenos propios y externos. En el mecanismo de presentación juegan un papel fundamental las moléculas del complejo Mayor de Histocompatibilidad
(MHC) como presentadoras de los antígenos fragmentados. Recordamos que la descripción histórica de ese sistema provenía
del papel que jugaba en los trasplantes experimentales, de ahí
que a sus componentes se los designara con el nombre de antígenos de histocompatibilidad.
Normalmente los antígenos propios, asociados a MHC Clase I,
son presentados a los linfocitos T citotóxicos (Tc). Este mecanismo de presentación normal del Sistema Inmune se lleva a cabo por células del tipo macrófagos-monocitos.
Los antígenos externos a los macrófagos son internalizados por
los mismos, procesados, y unidos a moléculas MHC Clase II. Seguidamente aparecen en la superficie celular, donde son presentados a otros linfocitos T, denominados linfocitos auxiliares (Th).
Los antígenos alternativamente pueden ser reconocidos en
forma directa e intacta por parte de otras células presentadoras, como son los linfocitos B, a través de sus receptores específicos (BCR). Millones de linfocitos B (cada una de sus líneas es
específica para un antígeno diferente) constituyen el repertorio defensivo contra otros tantos antígenos potencialmente
agresivos. Los linfocitos B, tras la unión de los antígenos a sus
BCR, pueden internalizarlos, procesarlos y presentar sus fragmentos de modo similar a los macrófagos. También la presen-
20
tación se hace por medio de moléculas MHC Clase II, a los Th.
Luego de esa interacción, de la que resulta la liberación de interleuquinas regulatorias por parte del Th, surge una diferenciación y estimulación de la línea de linfocitos B implicada, con
lo cual se transforman en células plasmáticas (PC), productoras
de importantes cantidades de BCR libres del anclaje celular. Tales moléculas circulantes son los anticuerpos específicos para
cada antígeno, constituyendo una expresión de la respuesta
humoral. Esta es la vía por la cual se sintetizan los anticuerpos
hacia los antígenos “naturales” que nos desafían en el transcurso de nuestra vida, hacia los antígenos de las inmunizaciones vacunales e incluso hacia los autoantígenos involucrados
en las enfermedades autoinmunes, como la diabetes tipo 1 y
otras variantes relacionadas. Estos últimos autoanticuerpos,
como veremos, son los marcadores séricos que se utilizan para
el apoyo diagnóstico y la detección precoz de la diabetes autoinmune.
LA AUTOINMUNIDAD
El daño a estructuras propias es un recurso defensivo natural
de los organismos inmunocompetentes y ocurre frecuentemente de manera regulada para eliminar células infectadas o
defectuosas y productos inútiles. Para cumplir con esa función
prioritaria el Sistema Inmune evolucionó hasta disponer de un
mecanismo complejo de autorreconocimiento y, como derivación de ello, desarrolló una capacidad defensiva dependiente
de la discriminación de las estructuras extrañas que potencialmente podrían agredirlo. En esos procesos participan diferentes mecanismos celulares y humorales de eliminación: las células fagocitan estructuras moleculares propias y las provenientes de microorganismos, fragmentándolas, oxidándolas y finalmente degradándolas totalmente. Los anticuerpos unen
con alta especificidad y avidez a los antígenos en solución o
particulados, generando complejos eliminables por los distintos sistemas de depuración, basados en mecanismos de opsonización, intermediados por el sistema complemento o por
otros tipos celulares dependientes de anticuerpos.
Si alguno de los diversos mecanismos implicados en el funcionamiento defensivo del Sistema Inmune falla por alguna causa,
se instala una inmunodeficiencia parcial o total, comprometiendo la integridad de los tejidos blanco y hasta la sobrevivencia del individuo afectado. Por ello, si se altera alguno de los
delicados mecanismos del reconocimiento discriminativo entre
lo propio y lo extraño y/o la regulación supresora, resultante en
autoagresión descontrolada, extensa e irreversible, estamos an-
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Tabla 4.1
MECANISMOS ETIOLÓGICOS
DE LA AUTOINMUNIDAD
Predisposición genética
Liberación de antígenos recluidos
Exposición de epitopes crípticos
Ignorancia de lo propio por
inadecuada presentación
antigénica o de señales
coestimulatorias
Mimetismo molecular
Modificación de lo propio
Defectos en la tolerancia central
o periférica
Activadores policlonales
Disturbios inmunnorregulatorios
Mecanismos etiológicos de
la autoinmunidad, destacando
la contribución fundamental de
la predisposición genética. Para acceder
a una versión más desarrollada de estos
puntos, puede consultarse el tema
Autoinmunidad en la Separata 2001.
Diabetes e Inmunidad, E. Poskus.
te una patología autoinmune. Como estos trastornos son multifactoriales, en las diferentes enfermedades autoinmunes pueden estar comprometidos distintos mecanismos etiológicos.
Entre las diversas hipótesis propuestas, varias se destacan por
un sustancial soporte experimental, aclarándose que en muchos casos pueden ser mutuamente no excluyentes.
Las hipótesis principales de la autoinmunidad apuntan a defectos en la inducción central o periférica de la tolerancia o,
por otra parte, a la respuesta convencional disregulada hacia
moléculas propias, que en circunstancias normales no necesitan el desarrollo de un proceso de tolerancia. Además, varios
de los mecanismos propuestos que se muestran en la Tabla 4.1
son variantes de un mismo modelo, adaptados a enfermedades órgano-específicas, o a la autoinmunidad sistémica. Finalmente, como las bases de la autoinmunidad tienen una clara
conexión con la predisposición genética, los estudios familiares
y poblacionales incluyen la exploración de los factores de susceptibilidad a nivel de los genes que codifican para las macromoléculas que contactan con los antígenos (MHC, TCR y anticuerpos) y de otras implicadas en la regulación (citoquinas,
componentes del mecanismo de apoptosis, etc.).
Debido a la importancia crucial de la constitución genética en
la predisposición para la diabetes autoinmune, este tema se desarrollará a continuación con mayor amplitud. Como además la
respuesta inmune celular, responsable de la autoagresión que
lesiona a las células beta de los islotes, y la respuesta humoral,
generadora de los marcadores, son mecanismos controlados
por genes del sistema inmune, las bases etiopatogénicas de la
diabetes autoinmune y el origen de los marcadores se tratarán
consecutivamente en la siguiente sección de Inmunogenética.
5. INMUNOGENÉTICA Y DIABETES MELLITUS AUTOINMUNE
GENÉTICA DE LA DIABETES MELLITUS TIPO 1
Como se ha adelantado en las secciones anteriores, la diabetes
tipo 1 es una enfermedad heterogénea causada por la interacción de factores genéticos y ambientales, en la cual se ha demostrado una forma de herencia de tipo poligénica. De todas
maneras, las bases etiopatogénicas de la enfermedad incluyen
claramente el componente autoinmune y desde el punto de
vista hereditario existe una reconocida asociación con genes
del MHC (HLA en los humanos). En este sistema se halla entonces el factor genético más importante para la susceptibilidad
hacia la diabetes autoinmune, la que comprende a su vez a la
diabetes tipo 1 como el modelo mejor estudiado.
22
En gemelos univitelinos la tasa de concordancia del 50%, indicó inicialmente la asociación de factores genéticos predisponentes con factores ambientales desencadenantes, aunque estos últimos no estaban completamente esclarecidos. Luego se
determinó que las infecciones virales son tal vez el factor desencadenante más importante. Finalmente, el conocimiento
sobre la recombinación de los genes que codifican para los receptores T y para los anticuerpos perfeccionó la explicación sobre la discordancia en los gemelos univitelinos.
Si bien los genes del HLA son los factores genéticos más importantes que determinan susceptibilidad a diabetes tipo 1, está
bien establecido que esta predisposición es necesaria pero no
suficiente. Se han analizado varios polimorfismos distribuidos
en el genoma, en familias con varios individuos afectados de
diabetes tipo 1, relacionándose algunas de estas regiones polimórficas con la enfermedad. Entre estas regiones polimórficas
se ha asociado a la región VNTR (recordamos, según los adelantado en la sección 3. Polimorfismos en salud y enfermedad, que
la sigla significa número variable de repeticiones en tandem).
Esta región se halla vecina al extremo 5’ del gen de la insulina,
la cual constituye otro de los loci polimórficos que con mayor
frecuencia produce susceptibilidad para la diabetes tipo 1. También se ha establecido cierto grado de participación en el origen de la enfermedad de determinados polimorfismos del gen
codificante para la proteína denominada CTLA4. Cada uno de
estos tres genes (HLA, VNTR y CTLA4) y sus alelos implicados en
la diabetes tipo 1 merecen una consideración especial.
EL SISTEMA HLA
Los genes del sistema HLA se encuentran en el brazo corto del
cromosoma 6 y son clasificados en tres familias: Clase I, II y III. Específicamente los genes de Clase II son los que presentan más
fuerte asociación con la enfermedad y son altamente polimórficos. La mayoría de los residuos polimórficos se encuentran en el
dominio amino-terminal. Hay tres loci que expresan los antígenos de Clase II: DP, DQ, DR; los productos de la expresión de genes de Clase II son glicoproteínas heterodiméricas constituidas
por cadenas α y cadenas β , presentes en la superficie celular de
macrófagos y linfocitos B, codificadas respectivamente por los
genes DRA y DRB, y por DQA y DQB. El gen DRA es monomórfico, el DRB es polimórfico y es el responsable por lo tanto del polimorfismo presente en las moléculas DR. Por el contrario, tanto
el gen DQA como el DQB son polimórficos y de esta manera, ambos determinan el polimorfismo existente en las moléculas DQ.
Se ha comprobado que tanto los alelos polimórficos de genes de
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FIGURA 5.1
Organización genómica del sistema HLA
y distribución de las moléculas Clase I
y Clase II en la superficie de células
periféricas “comunes” y de células
“profesionales” (macrófagos).
Se destacan las cadenas DQβ y DQα,
asociadas con la diabetes autoinmune,
según la estructuras de sus formas
polimórficas a nivel de los aminoácidos
Asp 57 y Arg 52, respectivamente.
24
la región DR como de la región DQ predisponen o protegen para el desarrollo de la diabetes tipo 1. Desde hace varios años se
había comprobado, por tipificación serológica, la relación de los
antígenos DR3-DR4 con la enfermedad. El 95% de los pacientes
con diabetes tipo 1 poseían DR3-DR4, comparado con el 50% de
la población no diabética. En las diferentes poblaciones estudiadas los tipos serológicos HLA DR3 y DR4 determinaban susceptibilidad para padecer la enfermedad, mientras que el DR2 confería resistencia. Las variantes polimórficas halladas en pacientes
fueron también encontradas en controles sanos.
El avance de la Biología Molecular ha permitido focalizar entre
los tres loci de la región D (DP, DQ, DR) a la región DQ como la
más fuertemente asociada con la diabetes tipo 1 (Figura 5.1).
Por ello hoy se sabe que los alelos de genes DR, codificantes
para los serotipos DR3-DR4, están asociados a la enfermedad
por su participación directa y por el desequilibrio de ligamiento con alelos DQB. De la misma forma, el DR2 se halla en desequilibrio de ligamiento con las variantes alélicas de DQB que
confieren resistencia.
Con el advenimiento de la técnicas de Biología Molecular, como
el análisis de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
y la amplificación de ADN a través de la reacción en cadena de
la polimerasa, se han podido determinar los alelos que confieren susceptibilidad o resistencia para padecer diabetes tipo 1.
La hipótesis de una contribución mayoritaria del locus DQ al desarrollo de la diabetes tipo 1 surge en base a los trabajos de
John Todd, a partir de los cuales se establece claramente que la
región genómica alrededor del codón 57 del gen B de la región
DQ del Complejo Mayor de Histocompatibilidad, está indudablemente involucrada en la asociación con esa patología autoinmune. Se ha establecido que las secuencias aminoacídicas
de las cadenas ß, codificadas por el gen DQB, son comúnmente
halladas en asociación con la diabetes tipo 1, confiriendo susceptibilidad a la enfermedad cuando los residuos de aminoácido en la posición 57 son alanina, valina o serina (cualquiera de
esas alternativas se denominan como “aspártico negativo”, o
Asp-). En contraste, las cadenas aminoacídicas halladas más frecuentemente en la población no diabética, y que confieren protección para el desarrollo de la enfermedad, tienen el aminoácido aspártico en esa posición (denominadas “aspártico positivo”, o Asp+). Se ha demostrado ampliamente en diferentes poblaciones estudiadas que el haplotipo DQB Asp- homocigota
(Asp- / Asp- ) es el que tiene una correlación específica con diabetes tipo 1. Las diferentes variantes alélicas del gen polimórfico DQB se encuentran circunscriptas al segundo exón del gen y
son las que codifican la región amino-terminal de la molécula
presentadora de antígenos. Actualmente se reconocen decenas
de alelos diferentes en el gen DQB, que se diferencian por su
estructura a nivel del codón 57 y también por fuera de él. La
nueva nomenclatura individualiza cada uno de estos alelos con
cuatro dígitos: por ejemplo, entre los alelos de susceptibilidad,
el DQB 0302 y el DQB 0201 se encuentran entre los más comunes entre los diabéticos tipo 1. Además, la forma actual de expresar la constitución genética a nivel del sistema HLA que confiere la mayor predisposición para padecer la diabetes tipo 1 no
se refiere a un locus solamente. Por ello la nomenclatura completa para expresar el patrón de mayor susceptibilidad genética hacia la enfermedad es la siguiente: serotipo DR3, haplotipo
DRB 03 - DQB 0201 - DQA 0501; serotipo DR4, haplotipo DRB 04
- DQB 0302 - DQA 0301). Alrededor del 80% de los individuos
caucásicos con diabetes tipo 1 son portadores de alguno de estos dos haplotipos, aunque de todas maneras presentan una
importante variación cuando se estudian diferentes grupos étnicos. Cuando se estudió estadísticamente la forma homocigo-
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Tabla 5.1
Frecuencia de los genotipos DQB1
en la población argentina normal
y en los pacientes diabéticos,
según el codón 57 codificante
para ASP- o ASP+.
Tabla 5.2
Frecuencia de los genotipos DQB1
en la población argentina normal
y en los pacientes diabéticos,
según sus alelos.
26
ta Asp-/Asp- en nuestra población, se identificó un alto grado
de asociación a diabetes tipo 1, llegando al 78,6% en los pacientes diabéticos tipo 1 y al 46,8% en los pacientes LADA, comparados con un 20,5% en los individuos controles (Tabla 5.1).
Con estos porcentajes se confirmó, para el grupo étnico representativo de nuestro país, que esta región del sistema HLA, en
efecto, es la que predispone a la diabetes autoinmune, tanto
LADA como diabetes tipo 1, y otorga un mayor riesgo de contraerla. La población genéticamente más predispuesta es la de
los familiares de primer grado de pacientes con diabetes tipo 1
(grupo de riesgo). Además, se observó una fuerte asociación
entre diabetes tipo 1 y los diferentes genotipos del locus DQB
en distintos grupos étnicos. A pesar de establecerse áreas con
alta incidencia de diabetes tipo 1, como en Francia y en Finlandia y otras de baja incidencia, como en Japón y en Taiwan, en
todas estas poblaciones permanece la relación lineal entre alelos de susceptibilidad relacionados al codón 57 de la región
DQB y la diabetes tipo 1.
Teniendo en cuenta que los alelos polimórficos del gen DQB
se encuentran en desequilibrio de ligamiento con variantes
polimórficas de los genes DQA y DRB, se admite que sólo con
la determinación de alelos del gen DQB se establece una adecuada ponderación de la susceptibilidad o resistencia a la enfermedad.
Considerando los genotipos del estudio realizado en la población argentina (5.1), se destaca la alta proporción de dos alelos
de susceptibilidad para la diabetes tipo 1: los alelos 0201 y 0302
alcanzan el 80% entre los pacientes con diabetes tipo 1, el 51%
en los LADA y el 16% entre los controles. Cuando se analizó la
frecuencia genotípica que confiere mayor predisposición a diabetes autoinmune (la combinación alélica 0302/0201) se encontró un 38% en diabetes tipo 1, 17% en LADA y sólo 2% en los
controles. Estos porcentajes son similares a otras poblaciones,
con la diferencia que en nuestra población el alelo mas frecuente es el 0201 (similar a Italia y España), a diferencia de las
poblaciones de EEUU o centro y norte de Europa, en las que el
alelo de mayor frecuencia es el 0302. (Tabla 5.2).
Como se puede comprender a partir de los porcentajes presentados, los alelos de susceptibilidad del gen HLA DQB 1 se encuentran asociados fundamentalmente a diabetes tipo 1, presentando en el LADA un comportamiento intermedio entre
diabetes tipo 1 y controles. Como se verá en la sección 7. La
diabetes emergente en edad infanto-juvenil y adulta, el LADA
presenta un mayor peso en la predisposición genética a partir
de polimorfismos en otros genes (VNTR de insulina y CTLA 4),
Figura 5.2
mientras que en la diabetes tipo 1 los polimorfismos de genes
HLA son los que contribuyen fundamentalmente a la predisposición genética, constituyéndose en el locus mayor para este tipo de diabetes autoinmune.
El conocimiento de la frecuencia y el tipo de alelos presentes
en nuestra población permite genotipificar a futuros pacientes
y sobre todo a los familiares de primer grado de los pacientes
diabéticos tipo 1. Por otra parte, en el mismo estudio, la distribución alélica en el grupo control fue homogénea, siendo el
alelo protector DQB 0301 el más frecuentemente hallado en la
misma población: su frecuencia llega al 44,2% con respecto al
3,8% presente en los pacientes con diabetes tipo 1.
El gen DQA también ha sido relacionado a la predisposición
genética para la diabetes tipo 1. En este gen la región del codón 52 cuando codifica para arginina determina susceptibilidad y la ausencia de este aminoácido reemplazado por otro,
otorga protección para el desarrollo de la enfermedad. En la
Figura 5.2 se muestra esquemáticamente cómo la estructura
espacial de las cadenas a y b de la molécula DQ permiten el acceso de un fragmento peptídico del antígeno GAD si corresponden a variantes alélícas con Asp 57- y Arg 52+, respectivamente. Ese modelo proviene de una doble demostración experimental: 1) la interacción efectiva, en solución, de ese péptido
autoantigénico con la molécula HLA presentadora y 2) la imagen tridimensional real del complejo cristalino, obtenido por
Corper y col. mediante la técnica de difracción de rayos X (5.2).
A partir de este estado del conocimiento a nivel molecular, ha
sido posible reducir a una imagen gráfica relativamente sim-
Estructura tridimensional
del complejo MHC (HLA) Clase II /
Péptido de la GAD, obtenida por
difracción de rayos X (izquierda)
y su esquema simplificado mostrando
la factibilidad de la unión
y presentación del péptido cuando
las variantes polimórficas
corresponden a cadenas β con
Asp57- y a cadenas α con Arg52+
(derecha).
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ple, tanto las causas de la alta capacidad autorreactiva de ciertos individuos (según su HLA) como el papel que juegan ciertas moléculas propias implicadas en la ruptura de la tolerancia
(la proteína GAD de las células beta).
Independientemente del nivel académico alcanzado para descifrar la relación entre la genética y la autoinmunidad, se debe
tener cierta cautela respecto de la interpretación práctica de los
análisis de genotipificación del sistema HLA y, obviamente, respecto de la información que se brinda a la población de riesgo
eventualmente estudiada. En efecto, la presencia de alelos DQB
de predisposición, aún en la forma homocigota, no asegura la
predicción del desarrollo futuro de la enfermedad. En todo caso la información analítica indica que existe un determinado
riesgo relativo para padecerla. Justamente, debido a que la diabetes tipo 1 es una enfermedad multifactorial y poligénica, los
otros genes implicados fuera del sistema HLA, también juegan
un papel definitorio. Además, se debe tener presente que los
factores ambientales interactúan con los factores genéticos de
predisposición para desencadenar finalmente la expresión clínica de la enfermedad. Por ello la visión actual es que la diabetes
tipo 1 es una enfermedad que se halla comprendida dentro del
grupo de enfermedades autoinmunes, que a su vez también
presentan asociación con alelos específicos Clase II del sistema
HLA. Al respecto se han descripto familias que, además de presentar miembros con diabetes tipo 1, son afectadas por otras
enfermedades autoinmunes órgano-específicas y, en menor
medida, por las sistémicas. Ejemplos de ellas son la enfermedad
tiroidea autoinmune (enfermedad de Graves y el síndrome de
Hashimoto), la enfermedad celíaca, la artritis reumatoidea, el
lupus eritematoso sistémico, etc.
VNTR
En general muchas de las enfermedades autoinmunes tienen
un órgano blanco específico contra el cual se dirige la agresión
inmunológica. El conocimiento de las bases que determinan
una respuesta autorreactiva específica hacia un órgano blanco
(por ejemplo, los islotes pancreáticos y en particular las células
ß) es lo que determinará la comprensión de la etiopatogenia,
orientará las posibles intervenciones terapéuticas para la prevención y, por último, mejorará las chances de curación de esta
enfermedad. Es muy probable que ciertos genes que se encuentran fuera del sistema HLA jueguen un papel crítico para determinar la expresión de la autoinmunidad órgano-específica. Un
buen ejemplo de esto se tiene con el gen de la insulina, el cual
se encuentra ubicado en el brazo corto del cromosoma 11. Está
28
Figura 5.3
Organización genómica de los alelos
Clase I, II y III en la región VNTR,
up stream (“corriente arriba”
del extremo 5´) del gen de la insulina.
Se señala la asociación de la variante
Clase I small (corta) con la diabetes
autoinmune.
constituido por 1430 pb y tiene 3 exones separados por 2 intrones de 179 y 786 pb. El gen tiene la secuencia completa para la
codificación de las cadenas A y B de la insulina, el péptido C y
el prepéptido o péptido señal. Además, en la región genómica
vecina del extremo 5’, se ha determinado la presencia de un polimorfismo denominado VNTR, que ya hemos mencionado, el
cual ha sido estudiado en múltiples grupos poblacionales y en
diversas familias con árboles genealógicos constituidos por un
importante número de paciente diabéticos. Los polimorfismos
genéticos de ese tipo han sido extensamente usados como marcadores genéticos de las enfermedades hereditarias.
La región VNTR vecina al gen de la insulina está constituida
por segmentos de 30 a 170 repeticiones en tandem de unidades nucleotídicas formadas por 14 pb. Este VNTR genera tipos
de alelos diferentes (Figura 5.3): Clase I: 600 pb, Clase II: hasta
1400 pb y Clase III: más de 2400 pb. El alelo de Clase I ha sido
correlacionado con diabetes tipo 1 (esta asociación se denominó IDdiabetes 2), correspondiendo al 10% de la carga genética en los pacientes diabéticos tipo 1. De esta manera se distinguen del modelo antes descripto que se correlaciona con el sistema HLA (denominados IDdiabetes 1) y que constituía el 50%
de la carga genética.
La detección de varios polimorfismos relacionados a diabetes
tipo 1 en diferentes regiones del genoma confirma la característica heterogénea de la enfermedad.
Recientemente en el Hospital de Clínicas J. de San Martín, Universidad de Buenos Aires, se realizó un trabajo para la tipificación de los alelos polimórficos del VNTR vecino al gen de la insulina, con el propósito de establecer la asociación entre este
locus y la susceptibilidad para padecer diabetes tipo 1 en la po29
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Tabla 5.3
Frecuencia de alelos Clase 1, 2 y 3 del
VNTR del gen de la insulina en la
población argentina normal y en los
pacientes diabéticos.
Tabla 5.4
Frecuencia de alelos Clase I
(en particular IS), 2 y 3 del VNTR del
gen de la insulina en la población
argentina normal y en los pacientes
diabéticos.
30
blación argentina. A partir de este tipo de estudios se halló que
la presencia de los alelos polimórficos varía en los diferentes
grupos raciales. Así se estableció que los alelos de Clase II son
poco frecuentes entre los caucásicos y en cambio entre la raza
negra se observó su frecuencia más alta, llegando a un 22%.
Por otra parte, se determinó una frecuencia superior de la forma homocigota para los alelos de Clase I en el grupo de pacientes diabéticos, comparados con los controles no diabéticos, lo
cual concuerda con estudios previos realizados en caucásicos.
El 81,3% de los pacientes con diabetes tipo 1 en el estudio realizado en la Argentina (5.3) presentó el alelo de susceptibilidad
de Clase I, en relación con el 69,9% del grupo control y el 80,
6% del grupo con LADA.
El alelo de Clase III, considerado un alelo protector para la diabetes tipo 1, también mostró una diferencia significativa:
27,9% en el grupo control y 15,3% en los pacientes diabéticos
tipo 1 (Tabla 5.3).
Se ha establecido que los alelos de Clase I son los que más varían en tamaño. McGinnis y Spielman fueron los que subclasificaron los alelos de Clase I en alelos de Clase S (Small) y alelos
L (Large) de acuerdo a la longitud determinada por el número
de pares de bases que constituía cada tipo de alelo. Estos autores hallaron que los alelos S estaban más fuertemente asociados a diabetes tipo 1 en un estudio llevado a cabo con familiares de primer grado de diabéticos tipo 1. La mayor frecuencia de alelos S estuvo presente entre los pacientes con LADA,
63,4%, con respecto a diabetes tipo 1, 53,4%, y a los controles
normales, 37%, en el estudio llevado a cabo en Argentina (Tabla 5.4). Estos datos son coincidentes con los publicados por
otros autores (véase en la bibliografía recomendada los trabajos de Owerbach y col) los que compararon diabetes tipo 1 y
controles. A partir de estos datos, comparando alelos S y L entre diabéticos con autoinmunidad y controles, surge claramente que los alelos S se encuentran fuertemente asociados a diabetes autoinmune y dentro de ésta a los pacientes con LADA.
La presencia de los alelos susceptibilidad del gen DQB 0201 /
0302, junto a la forma homocigota del alelo de Clase I del
VNTR del gen de la insulina (en particular el alelo S), constituye un haplotipo que presenta una amplia diferencia estadística entre el grupo control y los pacientes con diabetes autoinmune. Este haplotipo se constituye de esta manera en un importante marcador de predisposición para la diabetes autoinmune y, fundamentalmente, el LADA.
El rol del locus polimórfico en el extremo 5’ del gen de la insulina no está completamente claro, aunque la proximidad de es-
te polimorfismo con la región reguladora del gen de la insulina sugiere que podría estar involucrado en la regulación de la
expresión de ese gen. En trabajos recientes se propone que la
expresión del gen está correlacionada con la longitud del VNTR,
flanqueante en la región 5’ del gen de la insulina. Kennedy y
col. (véase la bibliografía recomendada) encontraron una reducida expresión del gen en células productoras de insulina,
transfectadas con construcciones de promotores de insulina
que contenían el alelo de Clase I, con respecto a aquellas que
contenían el alelo de Clase III. En los individuos con la variante S la pobre expresión de la insulina a nivel del timo ha sido
implicada en la pérdida de tolerancia central (5.4).
La participación de la región VNTR vecina al gen de la insulina
sería, según la visión actual, la de un gen específico de órgano
que “dirige” la reacción autoinmune contra ese en particular.
De todas maneras, el conocimiento de otros genes, como los
que codifican para factores de transcripción o de replicación
específicos de la célula ß, permitirá en el futuro profundizar el
conocimiento de la patogénesis de la diabetes tipo 1. Así se
podrá determinar la interacción biológica entre los genes del
sistema HLA que regulan la respuesta autoinmune y los genes
órgano-específicos.
Luego de haber demostrado la fuerte asociación entre alelos polimórficos del sistema HLA y el VNTR del gen de la insulina con la
enfermedad, se debe demostrar la relación de éstos con la variación molecular de su expresión o con su función. Indudablemente al considerar una enfermedad poligénica y de etiopatogenia
heterogénea, como la diabetes tipo 1, no se puede establecer un
patrón único vinculado a la causa genética, ni se puede anticipar
el éxito de una sola terapéutica, o una simple medida de intervención con la finalidad de prevenir la enfermedad.
CTLA4
La molécula proteica CTLA4 es conocida desde hace un tiempo
en Inmunología celular por ser un marcador que se expresa en
células reactivas del tipo linfocito T. Esas células están involucradas en la activación inicial, tras la interacción con las células
presentadoras de antígenos (APC), como los macrófagos y monocitos, regulando la inmunidad celular. Se sabe que el gen codificante para CTLA4 es un candidato en la participación de
enfermedades autoinmunes, debido a sus funciones de regulador negativo del mecanismo coestimulatorio durante la interacción de linfocito B y T. El gen CTLA4 integra el grupo de genes de susceptibilidad para la diabetes tipo 1, clasificándoselo
como IDDM12. Actualmente se sabe que en la posición 49 del
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Figura 5.4
Esquema de la presentación antigénica
de una célula tipo APC a un linfocito T
con regulación positiva (coestimulación)
y negativa (inhibición), en este último
caso mediada por CTLA4. Se indican
las variantes polimórficas A y G
que probablemente se asocian
con la distinta velocidad de evolución
a la diabetes tipo 1.
32
pacientes con marcadores humorales de autoinmunidad, también pueden modular el desarrollo del proceso autoinmune a
nivel del modo de aparición.
Debido a que las distintas formas en que se puede presentar
la diabetes autoinmune es tratada especialmente en la sección 7. La diabetes autoinmune emergente en edad infantojuvenil y adulta, en la presente sección sólo se proporcionan
los elementos conceptuales elementales, de modo de adelantar cuáles son las bases genéticas condicionantes para la expresión diferencial de las variantes prototípicas de la diabetes
tipo 1 “clásica”, infanto-juvenil, y de las subvariantes de aparición en edad adulta.
exón 1 del CTLA4 existe un polimorfismo de transición denominado por las bases participantes, A-G (Figura 5.4).
En un trabajo efectuado sobre individuos japoneses se demostró que los pacientes diabéticos adultos de evolución progresiva y lenta a las forma tipo 1, con el marcador humoral GADA
positivo, estaban asociados con el alelo A, mientras que los pacientes que manifestaban la evolución abrupta se asociaban
preferentemente con el alelo G.
Se ha demostrado que la presencia de la variante G disminuye
la síntesis de CTLA4 y altera su procesamiento postranscripcional
(glicosilación de la proteína), por lo tanto los portadores del alelo G tienen una alteración en el CTLA4 que determina una menor capacidad para frenar la respuesta autoinmune, derivando
en una forma más abrupta en el desarrollo de la enfermedad.
En el trabajo que se realizó en la Argentina sobre tipicación de
ese polimorfismo en el gen CTLA4, se encontró una diferencia
estadísticamente significativa en la presentación de la forma
heterocigota AG cuando se compararon pacientes diabéticos
tipo 1 y LADA: 39,8% vs. 55,3% respectivamente (Tabla 5.5).
Luego otro grupo demostró que los heterocigotas expresan
preferencialmente el alelo A. De ahí que el LADA está más protegido que los diabéticos tipo 1 (5.5).
Si bien estos estudios sirven de orientación preliminar, existe
una fuerte presunción que en otros grupos étnicos, como los
caucasoides, los cambios polimórficos en el gen CTLA4 en los
En resumen, respecto de lo expuesto sobre la predisposición genética a diabetes autoinmune, los polimorfismos en genes HLA
(fundamentalmente DQA y DQB) son los que condicionan principalmente para la diabetes tipo 1 y tienen menos peso en la susceptibilidad para LADA, donde cobran mayor protagonismo los
polimorfismos en genes como el VNTR de la insulina y el CTLA4.
La Figura 5.5 muestra un esquema integrado del patrón genético predisponente para la diabetes autoinmune, incluyendo el
sistema HLA, la recombinación de genes codificantes para los
receptores T, los genes CTLA4 y la región VNTR.
Tabla 5.5
Frecuencia genotípica de alelos
del gen CTLA4 en la población
argentina normal y en los pacientes
diabéticos.
Figura 5.5
Esquema integrado del patrón genético
predisponente para la diabetes
autoinmune, incluyendo el sistema
HLA, la recombinación de genes
codificantes para los receptores T,
los genes CTLA4 y la región VNTR
del gen de la insulina.
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LOS MARCADORES INMUNOLÓGICOS DE LA DIABETES AUTOINMUNE
La Figura 5.6 muestra un esquema simplificado sobre la agresión celular hacia las células beta de los islotes y el surgimiento del la respuesta humoral específica, esto es, la síntesis de los
autoanticuerpos o marcadores de la diabetes tipo 1. Los marcadores aparecen en la circulación mucho antes de la expresión clínica de la enfermedad. Por ello son importantes elementos predictivos, denunciando el período prodrómico en
curso de la patología autoinmune y además representan valiosos parámetros de apoyo diagnóstico. A continuación haremos
una breve reseña de los marcadores más importantes.
Figura 5.6
Esquema representativo de la agresión
inmune celular a la célula β (izquierda)
y respuesta inmune humoral hacia
los componentes celulares, con la
generación de los autoanticuerpos
marcadores de la diabetes tipo 1
(derecha).
34
Anticuerpos anti-células del islote (ICA): Desde hace más de un
cuarto de siglo los ICA han sido los marcadores más usados para el apoyo diagnóstico y la prospección de la diabetes tipo 1
(5.6). Preceden en años a la aparición de los síntomas clínicos y,
luego de instalada la enfermedad, desaparecen paulatinamente. La detección de los ICA se lleva a cabo mediante una técnica
de microscopía basada en la inmunofluorescencia indirecta (IFI).
Se utilizan cortes de páncreas humano fresco de grupo sanguíneo cero, para evitar las posibles interferencias de las aglutininas de los grupos sanguíneos. Aunque la determinación de ICA
por IFI fue importante para la predicción de la diabetes tipo 1,
las limitaciones prácticas que se presentaron durante su implementación impulsaron el desarrollo de mejoras para su sistema-
tización y expresión semicuantitativa en unidades arbitrarias
(UJDF). Si bien este marcador ha tenido un papel relevante en el
curso histórico reciente del tema, en la actualidad está siendo
reemplazado con ventajas por parte de las técnicas prospectivas
de marcadores individuales que utilizan antígenos recombinantes clonados y sistemas analíticos cuantitativos (tests radiométricos e inmunoenzimáticos). Inclusive inicialmente estos métodos
específicos para marcadores individuales se utilizaron complementariamente con los de inmunofluorescencia para determinar ICA. De ese modo existen muchos estudios en los que se han
computado datos mixtos de ICA en conjunción con uno o más
de los otros marcadores. Esto desde la visión actual puede objetarse, pues se sabe que los autoantígenos involucrados en la detección por IFI incluye GAD e IA-2. Por lo tanto la complementación de los ICA con otros métodos diferentes que superponen
los mismos analitos, con diferente sensibilidad, es de dudoso significado. Por ello últimamente la prospección de marcadores se
limita a la aplicación de tests individuales, con exclusión de los
ICA. La sensibilidad combinada de tests para GADA, IA-2A e IAA/
PAA supera ampliamente a la del test clásico de ICA y disminuye las incertidumbres sobre eventuales falsos positivos.
Autoanticuerpos anti-insulina (IAA) y anti-proinsulina (PAA):
Desde 1983 se sabe que una fracción considerable de los pacientes debutantes con diabetes tipo 1 tienen anticuerpos específicos hacia la insulina (5.7). Para ello se utilizó un ensayo
de unión de radioligando, o RBA (de Radioligand Binding Assay). Cuando la aparición de estos anticuerpos en la circulación es anterior al tratamiento con insulina exógena existe
certeza de su origen autoinmune, de ahí que se los identifique como IAA (de insulin autoantibodies). La tolerancia normal hacia la hormona se quiebra probablemente como consecuencia de la liberación de insulina en concentraciones locales
anormalmente altas desde los gránulos donde se almacena,
tras la lisis de las células beta. Además, la agregación molecular de la insulina en los gránulos y la existencia de los precursores hormonales, como la pre-proinsulina y la proinsulina,
factibilizan su reconocimiento como neoantígenos, no sometidos a la tolerancia.
Por otro lado, a los pocos días de la administración terapéutica de insulina (aún las de mejor calidad y pureza), pueden aparecer anticuerpos específicos, los cuales se denominan operativamente como IA (de Insulin Antibodies). La inducción de los
IA, indistinguibles analíticamente de los IAA, genera una interferencia que impide determinar este último marcador una vez
iniciada la insulinoterapia.
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Mediante RBA se detectaron IAA aproximadamente en el 50%
de los sueros provenientes de pacientes debutantes con diabetes tipo 1, observándose que el marcador se correlaciona inversamente con la edad. Esto es, los IAA muestran mayor prevalencia entre los pacientes que debutan con diabetes tipo 1 a
edades más tempranas, sin embargo, en algunos pacientes
adultos diabéticos los IAA parecen tener un origen y una prevalencia diferentes.
La deteminación del marcador relacionado a los precursores
de la insulina, fundamentalmente la proinsulina (PAA), merece una consideración aparte. Además de la esperable inmunorreactividad cruzada entre la insulina y la proinsulina frente a
los anticuerpos inducidos por cualquiera de ellas, existe la posibilidad que existan anticuerpos exclusivos hacia la proinsulina entre la mezcla policlonal de los sueros positivos para el
marcador “IAA/PAA”. En esos casos el marcador sería estrictamente PAA y sus implicancias serían claras respecto del verdadero autoantígeno inductor durante los eventos que conducen al reconocimiento de las estructuras moleculares propias
(en este caso la familia de la insulina, sus precursores y sus intermediarios inmaduros en los gránulos de secreción).
Autoanticuerpos anti-GAD (GADA): En 1982 se había descripto
un autoantígeno de las células beta reconocible por radioinmunoprecipitación y se lo denominó 64K. En 1990 se lo identificó como GAD (5.8), la enzima conocida en Neurobiología por
su capacidad de sintetizar el neurotransmisor inhibitorio GABA a partir de ácido glutámico. Ese hallazgo se produjo como
consecuencia de la alta incidencia de la diabetes tipo 1 en pacientes con el síndrome Stiff-man (hombre rígido), una enfermedad neurológica rara asociada a la presencia de GADA. Se
sabe que existen dos formas de la enzima, identificables por
sus pesos moleculares de 65 kDa y 67 kDa (GAD65 y GAD67,
respectivamente). En el hombre la GAD65 se localiza principalmente en el sistema nervioso y en las células beta pancreáticas,
mientras que la GAD67 está sólo en el primero, por lo cual el
antígeno reconocido por los GADA en la diabetes tipo 1 es
fundamentalmente la GAD65. Por distintos talleres intenacionales y programas de estudios epidemiológicos se sabe que la
prevalencia del marcador GADA en los pacientes debutantes
con diabetes tipo 1 es del 70-80%. Si se determinan GADA juntamente con otros marcadores, la sensibilidad combinada supera el 90% (5.9).
Los GADA constituyen el marcador más precoz de la diabetes
tipo 1, ya que se detectan hasta 8-10 años antes de la aparición
36
de los síntomas clínicos de la enfermedad. Además, este marcador no varía con la edad de los debutantes, ni decae demasiado con el tiempo. En la predicción de la diabetes tipo 1 se
destacan por su alta especificidad: Un 0-1% de los individuos
sanos exhiben datos aparentemente positivos para GADA,
mientras que entre los parientes en primer grado de un paciente con diabetes tipo 1 la prevalencia supera el 10%. Entre
los que contraen la diabetes este valor asciende al 90%.
Como los GADA pueden aparecer en otros desórdenes autoinmunes endócrinos, no siempre debe tomárselos como marcadores de la diabetes tipo 1 y por ello es conveniente asociarlos
con otras determinaciones complementarias.
Anticuerpos anti-tirosina fosfatasa IA-2 (IA-2A, o ICA512A): Este
marcador fue descripto en 1995, resultando parcialmente coincidente con otro definido en 1990 como 37/40K (5.10). En 1996
se identificó que en realidad el componente de 37K corresponde a otra tirosina fosfatasa homóloga, denominada IA-2β
(5.11). El componente 40K es entonces el que corresponde a la
fosfatasa IA-2 localizada en los gránulos de secreción y en la
membrana citoplasmática. A diferencia del domino extracelular, sometido a tolerancia, esta porción normalmente no está
accesible al sistema inmune, integrando las estructuras intracelulares crípticas que se exponen tras la lisis de la membrana.
Además, se ha especulado respecto a que la tolerancia hacia la
porción de IA-2 intracelular yuxtapuesta a la membrana plasmática se puede perder por procesamiento alternativo a nivel
del ARNm. Esto se basa en que se han detectado productos de
expresión que carecen de ese sector y tal vez las células del sistema inmune sean las que en ciertas circunstancias “ignoran”
esa porción del dominio intracelular de IA-2 como una estructura propia.
Aunque los IA-2A se detectan en el 7% de los familiares en primer grado de los pacientes con diabetes tipo 1, ese valor se eleva a 64% si se toman en consideración sólo los que se tornan
diabéticos en los años siguientes.
VALOR PREDICTIVO POSITIVO DE LOS MARCADORES APLICABLES
A GRUPOS DE RIESGO
El valor predictivo positivo (VPP) es una estimación estadística
aplicada a cada test para marcadores, que guarda relación con el
riesgo para padecer diabetes durante el seguimiento longitudinal durante intervalos determinados. En la Figura 5.7 se muestra
la ecuación usualmente aplicada para calcular el VPP a partir de
la información epidemiológica y de los datos analíticos provenientes del screening de los marcadores de diabetes tipo 1.
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Figura 5.7
El valor predictivo positivo (VPP) se
calcula por la fórmula recuadrada. Los
valores de sensibilidad y especificidad
para cada marcador se obtienen luego
de analizar un número suficientemente
grande de individuos enfermos y
controles sanos, respectivamente.
Tabla 5.6
Valores representativos de VPP para
marcadores de la diabetes tipo 1
individuales y en algunas combinatorias
simples o con tests funcionales, como
la determinación del primer pico
de secreción de insulina. Los estudios se
efectuaron sobre un grupo de riesgo,
como son los familiares en primer
grado de pacientes con diabetes tipo 1.
Datos tomados del trabajo de Verge
y col. (5.9).
38
Uno de los estudios más representativos sobre predicción de diabetes tipo 1 en familiares en primer grado de pacientes diabéticos, expresando los riesgos en términos de VPP, es el de Verge y
col. (5.9). En ese trabajo se determinaron los marcadores GADA,
IA-2A e IAA en 882 familiares sanos de diabéticos tipo 1, 50 de
los cuales se tornaron diabéticos tras el seguimiento de control
durante más de 10 años. Entre ellos, 98% presentaron positividad en los estudios de RBA para uno o más de los marcadores y
80% eran positivos para dos o más de los mismos marcadores,
comparados con tests negativos para casi todos los controles. Los
valores de VPP a 3 y 5 años y para algunas combinaciones de dos
o más marcadores, se muestran en la Tabla 5.6. Esos perfiles explican por qué se han desarrollado variantes analíticas combinadas para dos marcadores en un solo test, como GADA/IA-2A.
Además en el mismo trabajo de Verge y col. se pudo demostrar
para algunos de los marcadores una asociación significativa con
HLA-DR4-DQ8 (nótese que la nomenclatura citada, DQ8, corresponde a la emergente de la detección serológica del antígeno,
hoy tipificado desde el ADN en términos del alelo DQB1 0302).
Esos datos y otros provenientes de varios estudios independientes, ilustran suficientemente sobre el valor potencial de la deter-
minación de marcadores en los grupos de riesgo, así como el
eventual apoyo que brindan los tests de genotipificación HLA.
Los grupos de riesgo para diabetes tipo 1 están integrados no sólo por los familiares en primer grado de los pacientes diabéticos,
sino por los individuos con otras patologías autoinmunes restringidas por los mismos HLA: enfermedad tiroidea autoinmune
(Graves- Basedow, Hashimoto), enfermedad celíaca, artritis reumatoidea, etc. En un estudio local realizado en el Hospital de Clínicas J. de San Martín, UBA, División Endocrinología, (Dr. H. Niepomniszcze y Dr. O. D. Bruno), junto al Instituto de Estudios de la
Inmunidad Humoral (IDEHU, CONICET-UBA), se determinó que el
6.5% de los 425 pacientes con tiroideopatías mostraban al menos un marcador positivo de autoinmunidad hacia las células beta, frente al 0% de los 100 controles normales. Además, uno de
los pacientes exhibía el perfil de positividad para GADA e IA-2A
y, por ende, alto índice de riesgo para desarrollar diabetes
autoinmume (trabajo aún inédito, divulgado en su versión preliminar: “Diabetic immune markers in thyroid diseases. Preliminary studies on autoantibodies to glutamic acid decarboxilase
(GADA)”. 45èmes Journees Internationales d´Endocrinologie Clinique. Edit. En Memoria. Paris, Francia. 23-24 de mayo de 2002).
También integran grupos de riesgo las pacientes con diabetes
gestacional, 5% de las cuales poseen serología positiva para
marcadores y evolucionan a diabetes tipo 1. En un trabajo realizado en 1994 por los grupos dirigidos por el Dr. J. Alvariñas
(Hospital Durand) y el Dr. E. Poskus (IDEHU, CONICET-UBA) se
demostró que en nuestra población el 5% de las pacientes diabéticas gestacionales eran GADA+.
Los pacientes diabéticos con debut en edad adulta han mostrado una prevalencia considerable de marcadores de autoinmunidad (5.12), por lo cual también integran grupos de riesgo para la insulinodependencia. En este caso el riesgo se expresaría
como una “insulinorrequiriencia” asociada a autoinmunidad,
con evolución frecuentemente más lenta que la de los pacientes con diabetes tipo 1 o latente (LADA). En un estudio recientemente publicado, el grupo del IDEHU (CONICET-UBA) demostró que el 90% de los pacientes adultos (tipo LADA y tipo
2 con evolución lenta al déficit funcional), positivos para un
test combinado GADA/PAA, pasaron al requerimiento insulínico, sugiriendo que ese tipo de análisis es útil para la ponderación del proceso autoinmune asociado al deterioro progresivo
de la secreción de insulina (5.13).
Para todos estos casos, los valores predictivos positivos deberían
generarse de estudios ad hoc, ya que los VPP derivados de trabajos como el de Verge y col. provienen de familiares en primer
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grado, sanos, de pacientes con diabetes tipo 1 y no de individuos
con patologías endócrinas autoinmunes, diabetes gestacional,
o con diabetes presuntivamente clasificada como de tipo 2. Además, los grupos étnicos involucrados en todos esos casos no son
iguales. Por todo lo comentado, la utilización de datos de VPP
de estudios de referencia sólo debería aplicarse a otros modelos
diferentes de investigación clínica de manera tentativa.
IMPORTANCIA DE LA PONDERACIÓN CUANTITATIVA DE LOS MARCADORES
Los primeros intentos por cuantificar el nivel de los marcadores en el suero provienen de la determinación de los ICA. A través de la labor de talleres internacionales especializados, se logró disminuir la variabilidad de los resultados y asignarles el
carácter de “cuantitativos”, mediante la normalización de procedimientos de titulación (5.14). Estos últimos consisten en la
utilización de diluciones seriadas de los sueros sometidos a
análisis, frente a sueros patrones de referencia y de un procesamiento especial de cálculo. Las unidades arbitrarias con que
se expresan estos análisis de ICA se designan como “UJDF” (de
Unidades de la Juvenile Diabetes Foundation). Así, por ejemplo, 5 ó 10 UJDF, según el laboratorio, puede significar el valor
límite de negatividad y 20, 40 u 80 UJDF, representarían respuestas progresivamente más intensas para ese marcador.
Para los marcadores determinados en la actualidad por los métodos radiométricos de referencia (RBA), las señales constituyen
de por sí expresiones cuantitativas relativas (porcentaje de binding del antígeno trazador radiactivo, B%). Como estas señales
dependen críticamente del diseño metodológico, es importante su normalización para los fines comparativos de los resultados interlaboratorios. Tales son los casos de los marcadores IAA
e IA-2A, para los cuales los estudios epidemiológicos suelen
computar simplemente los resultados como positivos o negativos. Sin embargo, en los informes de análisis individuales el valor de B% debe interpretarse como el nivel de la respuesta autoinmune humoral, lo cual a su vez es sólo un reflejo indirecto
de la respuesta autoagresiva celular. La cuestión sobre si el nivel del marcador en el suero realmente denuncia el grado de
avance del estadío prodrómico de la enfermedad es dudosa,
pues la constitución genética de cada individuo (el HLA entre
otras) condiciona su categoría de “bajo” o “alto respondedor”
para los autoanticuerpos, con cierta independencia de la intensidad del daño T-dependiente a las células beta. A pesar de ello,
es razonable suponer que las respuestas muy francas implican
mayor riesgo, al menos desde el punto de vista estadístico. Por
ello las unidades B% de los RBA también pueden acompañarse
40
de otra forma de expresión, en términos de unidades de precisión: “scores de desvíos estándar”, o sDS. Esta forma de expresión relativiza las señales respecto del nivel del valor inespecífico, computando la dispersión de los datos de los controles. Por
ejemplo, un informe analítico para un marcador puede incluir
los siguientes valores: B% = 10.0; inespecífico B% = 3.0; sDS = 10.0.
Ese valor es más convincente como indicador de positividad respecto de otro tipo de análisis que eventualmente exhibiera
proporciones comparables entre las señales brutas de la muestra del paciente y la de los controles, pero su bajo sDS disminuyera sensiblemente la significación de la positividad. Esto suele
ocurrir sitemáticamente con los métodos analíticos de marcadores basados en enzimoinmunoanálisis (ELISA).
Para el caso del marcador GADA, el método de referencia
(5.15) también conduce en principio a señales de B%, pero luego éstas se procesan en términos de unidades GAD Index. Tales unidades se obtienen por la comparación de la respuesta en
el mismo test de un suero patrón internacional, proveniente
de un paciente con Síndrome de Stiff Man, GADA positivo. Las
unidades de estos análisis normalizados varían para el universo de resultados posibles entre el valor negativo del inespecífico (controles normales) y un máximo de 2.5 GAD Index. Además estos análisis también pueden acompañarse de la expresión sDS, mejorando la consistencia y, por ende, la confiabilidad de los resultados.
Algunos autores han llegado a proponer la subclasificación de
los pacientes con diabetes autoinmune en base al nivel de los
marcadores. Lohman y col. (5.16) propusieron suclasificar a los
pacientes inicialmente definibles como LADA en los tipos LADA 1 (menor función de las células beta, rápida evolución a la
insulinodependencia, complicaciones microangiopáticas y altos títulos de GADA) y LADA 2 (similares a los diabéticos tipo
2, con presencia de insulinorresistencia, evolución más lenta a
la insulinorrequiriencia y bajos títulos de GADA). Para más detalles, ver sección 7. La diabetes autoinmune emergente en
edad infanto-juvenil y adulta.
6. LOS MÉTODOS ANALÍTICOS PARA EL APOYO
DIAGNÓSTICO DE DIABETES
Además de los métodos bioquímicos “convencionales” para el
control y seguimiento de la diabetes (determinación de glucemia, hemoglobina glicosilada, pruebas funcionales de reserva
pancreática, insulinemia, péptido C, relación insulina/proinsuli-
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na, etc.), actualmente existe un panel de pruebas genéticas e
inmunológicas que sirven para el apoyo diagnóstico preciso de
la diabetes con componente autoinmune. En las secciones anteriores se describieron las bases genéticas e inmunológicas de
la diabetes autoinmune, independientemente que se trate de
la diabetes tipo 1 típica o se asocie a otras formas. Entre ellas se
describieron los casos en los que la diabetes autoinmune se asocia a otras formas definidas o, contrariamente, a formas indeterminadas, en los individuos diagnosticados en edad adulta.
En esta sección describiremos con mayor detalle cuáles son esas
determinaciones y sus fundamentos, ya que su comprensión resulta conceptualmente importante. La indicación de aplicación
de esos tests, así como la correcta interpretación de los resultados producidos en los laboratorios de genética e inmunoserología, es de gran importancia para la interlocución médico-bioquímica, así como para el ejercicio racionalizado de los algoritmos diagnósticos y la instalación de las terapias correctas.
PCR
Para poder amplificar fragmentos de ADN por PCR se debe contar con dos oligonucleótidos de alrededor de 20 pb, o primers,
complementarios a los extremos 5’ y 3’ de la región a amplificar.
Estos se diseñan a partir de la secuencia conocida del ADN en
esa región y se los denomina sense y antisense, respectivamente. La amplificación del ADN entre los extremos definidos por
los primers se logra por la acción de la enzima Taq Polimerasa
que tiene la capacidad de copiar repetitivamente y en progresión geométrica la secuencia del molde (templado) a partir de
los nucleótidos agregados en el medio de reacción. De este modo se genera primero una cadena hija por cada hebra del templado. La progresión de la amplificación se hace exponencial,
pues si se parte de las 2 hebras originales de ADN en el paso siguiente se obtienen 4, luego 8, 16, etc. Si esta serie se repite en
forma cíclica 30-40 veces, se obtiene una amplificación que supera el millón de cadenas sintetizadas a partir de las 2 originales. Estos pasos repetitivos de síntesis requieren cambios cíclicos
de temperatura (con un equipo denominado ciclador térmico)
para favorecer sucesivamente la separación de las dobles cadenas complementarias del ADN (94-96 ºC), la unión de los primers
(annealing, a 50-55 ºC), la elongación de cada cadena durante la
copia bidireccional con la polimerasa (72 ºC) y el rearmado de las
cadenas por establecimiento de los puentes de hidrógeno entre
las bases complementarias de las respectivas cadenas. Una vez
amplificado el fragmento de interés, se utilizan técnicas complementarias que permiten la tipificación del producto. Éstas se se-
42
leccionan según el caso, según se necesite tipificar las variantes
polimórficas de un individuo entre el repertorio de alelos naturales en la población general (genotipificación PCR-ASO), o se
trate de la detección de una secuencia alterada por pequeñas
mutaciones o lesiones mayores en los genes (PCR-RFLP). Para
mayores detalles sobre estos remas, véase más adelante el subtítulo Genotipificación HLA.
SOUTHERN BLOT
La técnica de Southern blot permite identificar secciones determinadas de ADN, por lo cual es de suma utilidad para la detección de polimorfismos genéticos. Esta técnica consiste en la
fragmentación del ADN con enzimas de restricción, las que cortan en sitios específicos. Luego se separan electroforéticamente los fragmentos generados, seguidamente se transfieren a un
soporte sólido apropiado (membrana de Nylon) en forma desnaturalizada (con sus cadenas separadas) y por último se las hibridiza (lo cual significa que se permite su unión) a sondas específicas. Estas sondas son fragmentos de ADN complementario
a la región que se quiere identificar y que fueron radiomarcadas con 32P. Una vez producida la hibridización entre el ADN y
la sonda, se coloca una placa radiográfica en contacto con la
membrana de Nylon. Así se detecta por fotorreacción el fragmento oligo o polinucleotídico de interés, el cual exhibe diferente movilidad electoforética y, por ende, un posicionamiento
determinado en la matriz del soporte. Los mapas de bandas obtenidos muestran los diferentes fragmentos generados por corte con las distintas enzimas de restricción.
GENOTIPIFICACIÓN HLA
La genotipificación de los diferentes alelos polimórficos de los
genes del HLA se basa en la detección de la variación de la secuencia nucleotídica presente en el segundo exón de los genes
de Clase II, como por ejemplo el gen DQB1. A tal fin se cuenta
con las siguientes técnicas de Biología Molecular:
PCR-ASO (allele specific oligonucleotide): luego de la amplificación por PCR del gen B de la región DQ se obtiene un producto de 260 pb, el cual se transfiere a una membrana de Nylon por medio de Dot Blot. El producto en la membrana se hibridiza contra probes, o segmentos oligonucleotídicos, que incluyen las distintas variaciones en las bases según los diferentes alelos conocidos del gen DQB.
PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism): en esta
técnica el producto de amplificación de PCR es cortado por enzimas de restricción que reconocen diferentes secuencias. Co-
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mo se dijo anteriormente, en el caso de las genotipificaciones
HLA de Clase II aplicadas a diabetes autoinmune, se estudia el
segundo exón del gen DQB, por lo cual se requiere la utilización de alrededor de 6 o 7 enzimas diferentes. Luego se efectúa la corrida electroforética en geles de agarosa, que permite reconocer los diferentes alelos a través del mapa de bandas
obtenidas.
DOT BLOT reverso: los productos de amplificación de PCR son
utilizados como sondas o probes, las que son hibridizadas bajo
condiciones muy estrictas, en una membrana de Nylon que
contiene los probes representativos de los diferentes alelos. El
análisis de los diferentes puntos positivos de hibridización permite establecer los alelos de cada individuo.
Secuenciación: la secuenciación directa del producto de amplificación por PCR permite establecer el tipo de alelo en base al
conocimiento directo de la secuencia nucleotídica.
DETERMINACIÓN DE MARCADORES
Los IAA fueron los primeros marcadores medidos por RBA como inmunocomplejos mediante un método físico de alta sensibilidad, basado en la determinación de la radiación gamma
que emite el radioisótopo 125I introducido en la molécula de insulina (trazador) (6.1). La insulina radiomarcada se prepara en
el laboratorio a partir de Na125I y de la insulina recombinante
humana, disponible fácilmente a partir de las preparaciones
farmacéuticas, o se obtiene directamente de fuentes comerciales. Los resultados se expresan en términos porcentuales de la
radiactividad unida (B%) por los anticuerpos específicos, luego
de la separación de la marca no unida mediante polietilenglicol, o por otros procedimientos (proteína A o G-Sepharose). La
corrección de la unión inespecífica se establece por un test paralelo donde se desplaza la marca con antígeno frío en concentración virtualmente infinita. El valor de corte se establece habitualmente a partir del valor de B% de la media más 3 desvíos
estándar para un número abundante de controles normales.
Para el caso de los GADA, conocida la naturaleza de la proteína 64K como GAD, fue factible la obtención de trazadores radiactivos, tal como se había hecho para la insulina. La fuente
de GAD al comienzo era la enzima natural extraída del cerebro
de animales, como el cerdo, y la marcación se efectuaba también con 125I. Luego, con el desarrollo de los métodos de Biología Molecular, se pudo obtener por la vía recombinante, con la
ventaja adicional que los sistemas de transcripción y traducción in vitro posibilitaron la preparción a voluntad de los tra-
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zadores isotópicos agregando un aminoácido radiactivo a elección dentro del cóctel de los aminoácidos normales (6.2). Resumidamente, en esta técnica se aisla el gen codificante de la
GAD65 humana y se lo expresa en un sistema eucariota (lisados de reticulocitos), con la polimerasa y los otros ingredientes
necesarios para la biosíntesis de proteínas. Entre ellos están todos los aminoácidos naturales, menos el que se sustituye por
una variante radiactiva (en general, la 35S-Metionina). Así es
posible obtener GAD65 radiactiva prácticamente intacta para
efectuar un RBA parecido al descripto para los IAA. Los GADA
son determinados en este caso tras una inmunoprecipitación
más refinada, con proteína A-Sepharose, tras lo cual la emisión
beta del radionucleido se mide en un contador de centelleo líquido. Los resultados se suelen comparar con un suero patrón
internacional de referencia y las unidades de expresión se informan como un índice numérico relativo (GAD index).
Para la determinación de IA-2A, o ICA512A, también se efectúan análisis de inmunoprecipitación específica del tipo RBA,
tal como se describió para los GADA, utilizando de manera indistinta construcciones genéticas que codifican para la proteína tirosina fosfatasa IA-2 completa, o para el dominio intracelular, como el fragmento ICA512bdc (6.3).
Un aspecto importante a tener en cuenta en la analítica de los
marcadores es el control de calidad inter-laboratorios que asegure la adecuada sensibilidad, exactitud y reproducibilidad de
los resultados. Los procedimientos de RBA para determinar
IAA han sido controlados frecuentemente por los programas
International Proficiency Tests, Immunology Diabetes Workshop,
University of Florida, USA y los análisis para GADA e IA-2A o
ICA512A por los respectivos Proficiency Tests, Research Institute
for Children, Harahan, Los Angeles, USA.
La relativa complejidad de estos análisis exige que se los ejecute
bajo normas estrictas, las cuales se alcanzan en pocos centros especializados, causando que sus costos sean relativamente elevados. Eso a su vez causa una baja demanda y una accesibilidad restringida dentro de la rutina asistencial. La combinación de dos
ensayos radiométricos en un mismo test (método combinado),
donde se colocan simultáneamente los trazadores de GAD65 y
de IA-2, ha sido propuesta como una estrategia ventajosa y a la
vez como una solución parcial para reducir los insumos, ya que la
costosa etapa separativa con proteína A-Sepharose se ejecuta en
común para ambos marcadores (6.4). Sin embargo, el grupo del
IDEHU de la Facultad de farmacia y Bioquímica (CONICET-UBA),
demostró que la aplicación de ese método combinado sólo es recomendable para el estudio de la diabetes de tipo 1, ya que en
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los individuos diagnosticados en edades adultas los perfiles diferenciales de los distintos marcadores pueden ser distintos, exigiendo su ponderación individualizada (6.5). Recientemente el
mismo grupo logró la biosíntesis in vitro de un trazador 35S-Proinsulina, apto para la determinación de PAA (6.6) y la eventual
combinación GADA/PAA (6.7- 6.8), apta para el screening rápido
de autoinmunidad en los pacientes diabéticos detectados en
edad adulta y con evolución al requerimiento insulínico.
Por otra parte, los análisis de ICA mediante IFI convencional no
han evolucionado mucho después de su estandarización. Su
uso sistemático se ha desalentado por la dificultad en la provisión de páncreas frescos con inmunorreactividad reproducible
y por la inevitable subjetividad en la apreciación de los títulos
bajos. Sin embargo, debido a que la ejecución de las IFI necesita baja complejidad de equipamiento y prescinde de las exigencias de las radiometrías, el grupo del IDEHU (CONICETUBA) ha desarrollado una alternativa original para determinar
los GADA, preservando las ventajas de la inmunofluorescencia
y sorteando las limitaciones de los cortes histológicos pancreáticos frescos, al reemplazarlos por un sistema artificial de células CHO de hamster transfectadas con el gen de la GAD65 humana (CHO-GAD) (6.9). A pesar que este sistema presenta solamente el autoantígeno GAD65 hiperexpresado, su sensibilidad en el test de IFI es aceptable, abriendo la posibilidad futura de crear sistemas co-transfectados, o combinados, con
ICA512. Además, la GAD65 humana expresada en las células
CHO-GAD se halla en un contexto celular, exhibiendo el plegamiento nativo y la asociación normal a estructuras membranosas sináptico-símiles. Ese diseño alternativo explica algunos resultados GADA+ obtenidos por IFI para algunos sueros de diabéticos tipo 1 que son GADA- por RBA, donde el antígeno se
halla puro y en solución.
Otro intento para transformar a los tests para marcadores en
pruebas de bajo costo y accesibles a laboratorios comunes fue
encarado por el grupo del IDEHU (CONICET-UBA) en base a inmunobiológicos recombinantes producidos en sistemas procariotas y a tests enzimáticos (Depletion ELISA, o DELISA). Para ello la
obtención de GAD en E. coli, como proteína soluble y con alto
rendimiento, fue resuelta por primera vez en base a la creación
de una construcción genética que expresa la GAD65 humana fusionada a la proteína bacteriana tiorredoxina (Trx). La quimera
Trx-GAD presenta propiedades enzimáticas e inmunoquímicas intactas (6.10), permitiendo su aplicación exitosa en un test tipo
DELISA para GADA (6.11). Recientemente ese emprendimiento
biotecnológico fue perfeccionado por el mismo laboratorio, de-
46
sarrollándose otra construcción modificada por ingeniería genética (la mutación M161T) que mejora la calidad del producto de
expresión evitando la síntesis simultánea de una proteína contaminante truncada, iniciada en la metionina 161, sin alterar las
propiedades inmunoquímicas de la GAD65 completa (6.12-6.13).
Todos estos desarrollos se han encarado en el intento de reemplazar las complejas y onerosas técnicas radiométricas, hallándose algunos de ellos en la fase de control de calidad comparativo respecto de los métodos RBA de referencia.
7. LA DIABETES AUTOINMUNE EMERGENTE EN EDAD
INFANTO-JUVENIL Y ADULTA
DEFINICIÓN Y PATOGÉNESIS DE DIABETES
La reciente clasificación de diabetes es un nuevo intento por
encontrar una forma adecuada de incluir las diferentes variantes patogénicas incluidas bajo el término diabetes (7.1). La anterior clasificación de los años 70 se basaba en la edad como
criterio fundamental para agrupar las diferentes formas de
diabetes, pero esto debió ser dejado de lado, ya que estas pueden presentarse a diferentes edades a lo largo de la vida, aunque algunas son características de la edad infanto-juvenil y
otras de la edad adulta.
La insulinodependencia fue un criterio utilizado posteriormente para caracterizar aquellas formas con patogénesis autoinmune, pero este término no era conveniente en un determinado
número de casos. Debido a esto se llega a la última clasificación, que fija un criterio eminentemente etiológico, denominando diabetes tipo 1 a la diabetes producida por un mecanismo autoinmune. En la diabetes tipo 1 la agresión T-dependiente contra las células ß del páncreas lleva a la destrucción de los
islotes de Langherans con escasa o nula producción de insulina
y, como se ha referido, la enfermedad está determinada principalmente por alelos de susceptibilidad del sistema HLA.
La diabetes tipo 1 se presenta frecuentemente en niños o adolescentes, aunque lo puede hacer a cualquier edad y requiere
tratamiento con insulina. La diabetes tipo 2, es producida por
una alteración en la secreción de insulina con o sin insulinorresistencia, habitualmente está presente en la edad adulta, pero
también se puede presentar en la edad infanto-juvenil. De esta manera se pueden analizar las diferentes formas de diabetes de acuerdo a la edad de aparición.
Queda entonces bien establecido que la diabetes tipo 1 es la
forma de presentación característica en la edad infanto-juvenil,
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además tiene como característica fisiopatológica la autoinmunidad contra las células ß del páncreas, la asociación con alelos
de susceptibilidad del sistema HLA y finalmente el fenotipo característico de los pacientes es el peso normal o disminuido.
Es importante la repercusión clínica de los síntomas clásicos de la
enfermedad: poliuria, polidipsia, pérdida de peso, altos niveles
de glucemia con marcada tendencia a la cetoacidosis diabética y
una rápida progresión a la dependencia de insulina. La complicación crónica más frecuente es la microangiopatía diabética.
Otro tipo de pacientes también desarrolla diabetes tipo 1, pero
no presentan niveles tan altos de glucemia como el grupo anterior, los síntomas no son tan marcados y muchas veces se hace necesario diferenciarlos de los pacientes MODY, sobre todo
con los MODY 3. Los pacientes MODY tienen peso normal como los diabéticos tipo 1, pero tienen antecedentes familiares
de diabetes, lo que no ocurre con diabetes tipo 1. Nunca desarrollan cetoacidosis diabética, aunque pueden requerir insulinoterapia con la progresión de la enfermedad, incluso desde el
comienzo de la misma, dependiendo del gen afectado y del tipo de mutación presente. Es en esta situación, en que se plantea un diagnóstico diferencial entre diabetes tipo 1 y MODY,
cuando la determinación de anticuerpos contra la célula ß toma real importancia. Luego si los anticuerpos resultan negativos, un estudio de genética molecular para determinar el subtipo MODY es de suma utilidad para establecer el tratamiento
adecuado y el pronóstico de la evolución. Tanto en la diabetes
tipo 1 como en el MODY el mecanismo fisiopatológico presente es la alteración en la secreción de insulina sin resistencia periférica a la acción de la hormona.
Una cuarta posibilidad de diagnóstico de diabetes en la edad
infanto-juvenil es la presencia de diabetes tipo 2. Son pacientes
con sobrepeso u obesidad en los que predomina la resistencia
a la insulina por sobre la alteración en su secreción. Estos pacientes no tienen asociación con genes de HLA, no exhiben una
forma de presentación autoinmune y los niveles de hiperglucemia suelen ser moderados con repecto a la diabetes tipo 1.
Como se desprende de lo anterior, es de fundamental importancia un diagnóstico correcto de la forma de diabetes que se
presenta en la edad infanto-juvenil, con el objetivo de llevar a
cabo estrategias terapeúticas adecuadas en cada paciente. A
modo de integración, en la Figura 7.1 se presenta un algoritmo de diagnóstico de diabetes en la edad infanto-juvenil.
En la edad adulta la forma mas frecuente de presentación es
la diabetes tipo 2, con resistencia a la insulina predominante
sobre la alteración en la secreción de insulina. Estos pacientes
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tienen características clínicas propias del Síndrome Metabólico,
con sobrepeso u obesidad, en los cuales generalmente no se
presentan los síntomas clásicos de la enfermedad, ya que los
niveles de hiperglucemia suelen ser moderados.
Se considera que entre el 70% y el 80% de los individuos que
desarrollan diabetes tipo 2 en la edad adulta lo hacen con las
características clínicas arriba señaladas. Alrededor del 40% de
los mismos desconoce su enfermedad y, en muchas oportunidades, el diagnóstico surge tras un análisis de rutina o por la
detección de complicaciones crónicas.
Entre el 20% y el 30% de los casos de diabetes tipo 2 que se
presentan en la edad adulta, corresponden a una forma en la
cual predomina la alteración en la secreción de insulina sobre
la resistencia periférica a la misma. Estos pacientes generalmente tienen peso normal o un sobrepeso leve, además la repercusión sintomatológica es mayor, acompañada por mayores
niveles de hiperglucemia con respecto al diabético tipo 2 obeso. Es en esta forma de presentación donde se debe pensar en
la posibilidad de una diabetes de origen autoinmune y donde
la determinación de autoanticuerpos contra la célula ß, y eventualmente la genotipificación del HLA DQB, cobra importancia
como apoyo diagnóstico para una correcta interpretación fisiopatológica de la enfermedad.
Debemos considerar desde el punto de vista clínico la importancia de identificar a los pacientes adultos con diabetes autoinmune (LADA) para poder establecer un tratamiento adecuado desde el comienzo de la enfermedad, incluyendo la utilización de insulinoterapia precoz, cuando el control metabóFigura 7.1
Algoritmo sugerido para el diagnóstico
de diabetes en edad infanto-juvenil.
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lico o las circunstancias clínicas así lo determinen. Este punto
será desarrollado especialmente en el apartado Tratamiento
del LADA.
En los pacientes LADA no sólo la determinación de autoanticuerpos puede resultar de utilidad clínica, sino que el dosaje
de péptido C en ayunas, o post estímulo con glucagon, nos
permite establecer el grado de compromiso de la secreción de
insulina. De todas maneras, la decisión de iniciar la terapia con
insulina cuenta con componentes clínicos de indudable valor.
Estos se presentan cuando hay un severo deterioro en la masa
de células ß producido por la autoinmunidad, como son el descenso de peso y el descontrol metabólico que no se justifica
por otras causas. Hoy se está tratando de evitar ese deterioro
en la masa de células ß, tanto en la edad infanto juvenil como
en la edad adulta, interviniendo precozmente con insulina,
desde que la autoinmunidad es detectada.
Se debe tener presente que aproximadamente la mitad de los
individuos adultos con características clínicas similares al LADA
(peso normal, disminución en la secreción de insulina, etc.)
presentan autoinmunidad negativa, por lo tanto en ellos la alteración que produce la falla en la secreción tal vez no es de
origen inmunológico, ni está asociado con genes del HLA.
Por último, hay un escaso número de diabéticos adultos que debutan con cetoacidosis en forma similar a los pacientes diabéticos tipo 1 de edad infanto-juvenil. Como se ve, en muchas oportunidades se hace dificultoso para el clínico distinguir entre diabetes tipo 1 o diabetes tipo 2, tanto en la edad infanto-juvenil
como en la adulta. Por ello, principalmente para los pacientes
diabéticos adultos, se ha producido cierta anarquía en la nomenclatura (LADA, diabetes tipo 1.5, diabetes autoinmune del
adulto, o tipo 1 en el adulto, etc.). En estos casos la determinación de las bases etiológicas, a las cuales contribuye la detección
de anticuerpos contra la célula ß del páncreas, es de fundamental importancia para establecer el diagnóstico y el tratamiento
adecuado (7.2). Precisamente, el término LADA o diabetes latente autoinmune del adulto fue introducido para distinguir a
aquellos individuos adultos que desarrollan la enfermedad, al
igual que la diabetes tipo 1, por la producción de marcadores séricos contra la célula ß del páncreas, entre los cuales los anticuerpos contra la enzima glutamato decarboxilasa (GADA) son los
más característicos (7.3). Estos individuos adultos generalmente
no requieren insulina al comienzo de la enfermedad para mantener un adecuado control metabólico, pero con el transcurso
de los años, muchos llegan al requerimiento insulínico. Este tardío requerimiento de insulina está determinado por un lento y
50
progresivo proceso autoinmune que lleva a la destrucción de las
células ß del páncreas, lo cual conduce finalmente a una escasa
o nula producción de la hormona y la necesidad finalmente de
instalar insulinoterapia sustitutiva (7.4).
En base a lo anterior, es indudable que tanto la diabetes tipo 1
como el LADA tienen en común la autoinmunidad, pero se trata de dos procesos patogénicos con características propias. Así,
el LADA tiene una menos marcada predisposición asociada a
los genes del sistema HLA que los individuos jóvenes que desarrollan diabetes tipo 1, lo cual está fehacientemente documentado. Además es muy probable que exista una mayor participación de polimorfismos de otros genes (VNTR del gen de insulina y CTLA4), los cuales tienen una participación menor en
la diabetes tipo 1 (7.5).
Aunque en el LADA pueden estar involucrados otros mecanismos inmunogenéticos, como una mayor tolerancia inmune,
una mayor capacidad de regeneración de la masa de células ß,
o una menor o diferente exposición a factores ambientales
desencadenates, la hiperglucemia que se presenta tanto en el
LADA como en la diabetes tipo 1, es la consecuencia y la etapa final de un mecanismo autoinmune de destrucción de los
islotes (7.6). Indudablemente en muchos casos el LADA cuenta con una mayor conservación de la masa critica de células ß,
lo que permite preservar una adecuada secreción de insulina
para mantener un buen control metabólico, sin necesidad inicial de insulinoterapia.
A pesar de estas diferencias, por otro lado también hay francas características comunes entre diabetes tipo 1 y LADA, como
por ejemplo la insulitis con infiltración de células T. Esto ha sido demostrado al menos en algunos pacientes diabéticos adultos, GADA positivos, a través de la biopsia de páncreas. Estas
evidencias lo que indudablemente sugieren es la existencia de
un mecanismo fisiopatológico común, aunque con mayor tolerancia inmune en el caso del LADA, lo que a su vez es determinante para que no haya una destrucción completa y rápida de
la masa de células ß (7.7).
Además, los pacientes LADA, al igual que los diabéticos tipo 1,
pueden presentar asociación con otras endocrinopatías autoinmunes, lo cual refleja otro mecanismo etiopatogénico común entre ambas formas de la enfermedad.
En resumen, el deterioro en la secreción que lleva a la necesidad de utilizar insulinoterapia en individuos genéticamente
susceptibles, depende de la destrucción de la masa de células
ß por un mecanismo autoinmune. Dicho deterioro en la secreción de insulina es sumamente rápido en la infancia, más len-
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to en la adolescencia, latente y de progresión variable en adultos jóvenes y más lento aún en la edad adulta (7.8) (Figura 7.2).
CARACTERIZACIÓN DE LADA
Como ya se definió, el tipo LADA tiene características similares
a la diabetes tipo 1, como autoagresión del sistema inmune celular contra las células ß del páncreas (insulitis), autoanticuerpos positivos (GADA, IA-2A, IAA/PAA), asociación a ciertas formas polimorficas de genes del sistema HLA de Clase II (DQB1
0201-0302) y necesidad de tratamiento con insulina, aunque
con marcadas diferencias en cuanto al tiempo de evolución de
la enfermedad (7.9-7.10).
Por otro lado los pacientes diabéticos adultos tipo 2 que presentan marcadores requieren insulinoterapia en forma más
temprana que aquellos que no presentan autoanticuerpos. El
marcador GADA se encuentra presente en el 75% de los pacientes diabéticos tipo 2 que son insulinodefecientes, de acuerdo al
dosaje de péptido C post estímulo con glucagon, y sólo en el
10% de aquellos que no presentan insulinodeficiencia (7.11).
Los pacientes con diabetes tipo 1 presentan un mayor número,
y un mayor título, de autoanticuerpos (principalmente GADA,
Figura 7.2
Destrucción de la masa de células
y al mecanismo patogénico.
52
β de acuerdo a la edad
IA-2A, IAA/PAA), lo cual es producto de una mayor autoagresión
del sistema inmune celular sobre las célula ß, en términos de
pérdida de la autotolerancia. Este fenómeno es el denominado spreading, o ampliación de la respuesta inmune, hacia
otros epitopes (determinantes antigénicos) de las mismas moléculas inicialmente implicadas (spreading intramolecular) o
hacia otras moléculas diferentes de la misma célula β (spreading intermolecular).
En los LADA el autoanticuerpo predominante es el GADA, lo
que está determinando una menor agresividad del sistema inmune por la presencia de ese solo marcador y en títulos generalmente bajos. Eso coincide con una necesidad de insulinoterapia más demorada respecto de la diabetes tipo 1. Por otra
parte, la presencia de IA-2A parece asociarse con un fenotipo
de comienzo agudo e insulino-requiriencia temprana (7.12).
Otra característica es que, a diferencia del paciente con diabetes tipo 1 que no tiene resistencia a la insulina, el paciente LADA puede o no tener insulinorresistencia. Eso ocurre en forma
similar a los casos de diabtes tipo 2, pero en el LADA en general existe una mayor alteración en la secreción de insulina.
En un estudio en particular se ha separado a los LADA en dos
subtipos: se denominaron LADA tipo 1 o LADA 1 a aquellos pacientes que presentaban características metabólicas y clínicas
similares a la diabetes tipo 1, vale decir con insulinopenia sin
resistencia periférica a la insulina, con necesidad de insulinoterapia precoz y con complicaciones microvasculares. Por otro lado se denominaron LADA tipo 2 o LADA 2 a aquellos pacientes
que presentaban similitud con los pacientes diabéticos tipo 2
(7.13). Además los pacientes LADA 2 tenían insulinopenia con
resistencia periférica a la insulina y por lo tanto características
del Síndrome Metabólico, hipertrigliceridemia con descenso
del colesterol HDL, hipertensión arterial, complicaciones macrovasculares y requerimiento de insulinoterapia a más largo
plazo.
En los diferentes trabajos realizados la prevalencia de LADA
varía entre el 10% al 20% de los pacientes diabéticos tipo 2, de
acuerdo a las características clínicas de los individuos reclutados, a las restricciones impuestas sobre los pacientes estudiados y a los métodos analíticos aplicados. Los criterios de inclusión se basan en especificaciones variadas, como el índice de
masa corporal (IMC), la edad, el tiempo de evolución de la diabetes, la reserva insulínica medida por péptido C, la presencia
o no de resistencia a la insulina, el grupo étnico analizado y la
sensibilidad y especificidad de los métodos para la determinación de los marcadores (7.14-7.15).
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En un estudio realizado en Italia sobre 2076 individuos, se los
clasificó como diabéticos tipo 2, intolerantes a la glucosa y normales. La prevalencia de GADA fue de 2.8% en aquellos pacientes diagnosticados como diabéticos tipo 2. Esta menor prevalencia de LADA en Italia con respecto a otros estudios europeos
fue interpretado por los autores como debido a la menor susceptibilidad genética a la diabetes tipo 1 que presenta la población italiana que vive en la región continental (7.16). Por el contrario, el 16% de los pacientes diabéticos tipo 2 de origen chino presentaron GADA positividad, independientemente de la
antigüedad de la enfermedad (7.17). En otro estudio hecho en
Japón, sobre 289 individuos clasificados como diabéticos tipo 2,
la GADA positividad estaba presente en el 47% de los pacientes insulinorrequierentes y en el 10% de los pacientes que no
requirieron insulina. En estos últimos la duración de la diabetes tipo 2 era de menos de 5 años (7.18). Gottsäter et al, hallaron en población sueca que el 24% de los pacientes diabéticos
tipo 2 de reciente comienzo presentaban GADA positividad
(7.19). En el estudio UKPDS se analizaron más de 3600 individuos con diabetes tipo 2 no requiriente de insulina. El 16% de
esta población presentó GADA o ICA positividad, siendo predictores ambos de insulinorrequiriencia (7.20).
En el estudio local llevado a cabo por el Comité de Genética,
Inmunología y Prevención de la Diabetes, de la Sociedad Argentina de Diabetes (Programa ADA), se halló una prevalencia
del 24% de marcadores, principalmente GADA, en pacientes
diabéticos tipo 2 de reciente diagnóstico y con IMC igual o inferior a 30 (7.21).
En resumen, resulta claro que en el momento del diagnóstico,
tanto el marcador clásico ICA, como el GADA, han demostrado
ser predictores de insulinodepedencia para los pacientes
LADA. Actualmente se acepta que el marcador GADA es el que
exhibe mayor sensibilidad.
De todos los estudios efectuados ha surgido como experiencia
que se deben tomar estrictas medidas de estandarización metodológica para la determinación de los marcadores. Además
es esencial definir el tamaño de la muestra a analizar y las características clínicas de los individuos para establecer la real
prevalencia de LADA en los diferentes países, como se hizo
oportunamente con la diabetes tipo 1 en menores de 15 años.
Es indudable que la prevalencia de LADA representa una considerable proporción de pacientes diabéticos, por lo menos tan
importante como la diabetes tipo 1. La determinación precisa
de esta prevalencia, además de contribuir a una correcta clasificación etiopatogénica de la diabetes, permitará llevar a cabo
54
estrategias de intervención temprana y determinar el real impacto de la enfermedad en la salud pública.
SCREENING DE LADA
La determinación de GADA en pacientes diabéticos tipo 2 de reciente comienzo es, en términos prácticos, el primer recurso analítico recomendado para la detección de LADA. Uno de los antecedentes que brindan soporte formal a esta recomendación es
el estudio realizado en el Reino Unido (UKPDS), en el cual se determinó que los pacientes GADA positivos en el rango de edad
de 35 a 45 años eran los que rápidamente progresaban a la insulinorrequiriencia debido a descontrol metabólico (7.20).
Por otro lado, existe consenso respecto de la tipificación de
alelos de susceptibilidad del sistema HLA, con lo cual se contribuye a sostener el diagnóstico de LADA. Además, la medición
de péptido C, tanto en ayunas como post estímulo con glucagon, permite determinar la reserva de insulina en la célula ß
del páncreas, por lo cual estos tests bioquímicos o funcionales
orientan respecto de la oportunidad de iniciar la insulinoterapia. Incluso en estos casos resulta recomendable realizar el seguimiento de los niveles de péptido C.
El IMC característico de LADA es aquel que se encuentra por
debajo de 25, aunque algunos pacientes con sobrepeso han sido clasificados como diabéticos con autoinmunidad del adulto
(7.22). De todas maneras la caída del IMC, independientemente de su valor original y cuando no se halla justificado por
otras causas clínicas, está marcando la progresión a la insulinodependencia.
Por otro lado, los pacientes LADA pueden presentar diferentes
grados de resistencia a la insulina, por lo que la determinación
de péptido C puede ser de poca utilidad en estos casos. Sin embargo, debemos aceptar que actualmente no existen recomendaciones adecuadas para brindar al médico clínico y seguramente se requieren estudios futuros para llegar a establecer
tales recomendaciones. A pesar de esas restricciones, se ha sugerido un algoritmo para el diagnóstico de LADA (7.23), el cual
hemos adaptado y actualizado en el esquema de la Figura 7.3.
TRATAMIENTO DEL LADA
El principal objetivo del tratamiento de la diabetes autoinmune en pacientes detectados típicamente en edad adulta, debe
ser el de mantener un adecuado control metabólico y prevenir
la instalación de complicaciones crónicas de la enfermedad.
Para ello tiene especial importancia el control glucémico, de
modo similar a lo que sucede con la diabetes tipo 1. Pero por
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Figura 7.3
Algoritmo sugerido para el diagnóstico de diabetes autoinmune en el adulto.
otro lado en el caso de estar presente el síndrome metabólico,
de manera similar a lo que a lo que sucede con la diabetes tipo 2, deben tenerse en cuenta los otros factores de riesgo para la enfermedad cardiovascular, como son la hipertensión arterial, la dislipemia, etc. (7.24).
Como segundo objetivo, es de indudable interés para los pacientes LADA preservar la masa funcional de células ß, para lo
cual tiene fundamental importancia el tipo de tratamiento utilizado. Con ese fin se presenta a continuación una revisión de
los recursos terapéuticos disponibles, pero enfocando la problemática del paciente diagnosticado en edad adulta y con
componente de autoinmunidad.
SULFONILUREAS
Las sulfonilureas, frecuentemente utilizadas en el tratamiento
de diabéticos tipo 2, favorecen la liberación de insulina de las
células ß del páncreas promoviendo el cierre de canales de potasio por una vía ATP dependiente. Desde ese punto de vista y
sosteniendo que la hiposecreción de insulina es el evento patogénico principal en pacientes LADA, podría sostenerse que
la utilización de sulfonilureas sería útil en el manejo de este tipo de pacientes. Pero por otra parte debemos tener en cuenta
una serie de consideraciones: 1) Estos fármacos pueden causar
un temprano agotamiento de las célula ß por su continuo es56
tímulo secretagogo. 2) Está demostrado en modelos animales
que la liberación del contenido de los gránulos de secreción
por parte de la célula ß exacerba la pérdida de la tolerancia inmunológica, con lo cual se está contribuyendo al empeoramiento y a la amplificación de la respuesta autoinmune (7.25).
Por lo mencionado, es razonable sospechar que el tratamiento
con sulfonilureas esté contribuyendo realmente al deterioro
de la masa de células ß en los pacientes LADA y que por lo tanto no sería el tratamiento más adecuado para esta forma de
diabetes. Además del planteo especulativo en modelos animales, esa hipótesis en alguna medida está en relación con evidencias emanadas de diferentes estudios sobre pacientes diabéticos adultos. En el estudio local de Zavala y col. (7.26) se demostró que los pacientes diabéticos tipo 2 con fracaso secundario a los antidiabéticos orales del tipo sulfonilureas, presentaban con cierta frecuencia evidencias de agresión celular inmune hacia las células ß e incluso positividad para el marcador
IAA. Sin embargo no quedó establecido que la causa del fracaso secundario fuese causado por las sulfonilureas.
Cabrera-Rode y col. estudiaron 14 pacientes diabéticos tipo 2
con autoanticuerpos positivos, GADA e ICA, a los que dividieron en dos grupos, uno había sido tratado con glibenclamida
e insulina y el otro había recibido insulina como monoterapia.
El seguimiento se llevó a cabo durante un año y al final del
mismo los autores encontraron que los pacientes tratados sólo
con insulina habían mejorado el control metabólico. En coincidencia habían negativizado el ICA, aunque persistía el GADA y
no se detectaban diferencias significativas en la reserva pancreática medida por péptido C en ayunas (7.27).
METFORMINA
La metformina, una droga ampliamente utilizada en el tratamiento de los pacientes diabéticos tipo 2 (fundamentalmente
cuando presentan sobrepeso), actúa favoreciendo el ingreso de
glucosa en los tejidos periféricos e inhibiendo la gluconeogénesis.
También se ha probado el tratamiento con metmorfina en modelos animales con diabetes autoinmune y se ha concluido que
esta droga no interfiere en el curso de la enfermedad respecto al desarrollo de la autoinmunidad (7.28).
La carencia de efectos nocivos de la metformina sobre el curso
evolutivo de la autoinmunidad en el LADA, la torna una droga de utilidad tanto para esos pacientes como para los adultos
que presentan diabetes tipo 2 con resistencia a la insulina, con
autoinmunidad, y que además presentan signos del síndrome
metabólico.
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GLITAZONAS
Las glitazonas, recientemente introducidas para el manejo de
la diabetes tipo 2, mejoran la acción periférica de la insulina,
disminuyen los niveles circulantes de insulina y favorecen el ingreso de glucosa a los tejidos periféricos. Pero además, estas
drogas tienen interesantes propiedades, por lo cual sus aplicaciones se extienden a los LADA. Hay evidencias para afirmar
que las glitazonas favorecen la síntesis de insulina en la célula
ß, aumentan el contenido de insulina en los gránulos de secreción y mejoran la propia secreción de la hormona (7.29). Además de su efecto antihiperglucemiante, las glitazonas han demostrado poseer efectos antinflamatorios, con disminución de
las citoquinas involucradas en la agresión autoinmune a los islotes, como el factor de necrosis tumoral alfa y el interferón
gamma (7.30). En modelos animales de diabetes autoinmune
la troglitazona ha demostrado impedir el desarrollo de la enfermedad, muy posiblemente debido a sus efectos antiinflamatorios (7.31).
A pesar de lo mencionado, todavía no hay suficientes trabajos
de investigación clínica que soporten fehacientemente la preservación de la masa de células ß y, por ende, una recomendación de consenso para aplicar las glitazonas en el tratamiento
de los LADA.
INSULINOTERAPIA
Al referirnos a la insulinoterapia en pacientes LADA, se da por
entendido que la misma no genera dudas respecto a su aplicación en aquellos pacientes cuyo descontrol metabólico así lo
require. Pero además la utilización de insulinoterapia en pacientes con diagnóstico de LADA puede ser beneficiosa independientemente del control metabólico, ya que este tipo de
intervención ha demostrado preservar la masa de células ß de
la acción deletérea de la autoinmunidad en modelos animales.
También se ha demostrado que el tratamiento insulínico produce una disminución de los marcadores séricos, de lo cual se
infiere que tal vez se atenúe la agresión inmune celular, mejorando la secreción de insulina medida por péptido C y finalmente reflejándose en un mejor control metabólico de los pacientes (7.32).
Un estudio piloto, por el bajo número de individuos incluidos,
separó a 10 pacientes con diagnóstico de LADA, seropositivos
para ICA y GADA, en 2 grupos de 5 sujetos cada uno. A un grupo se lo trató con glibenclamida y al otro con pequeñas dosis
de insulina, efectuándose un seguimiento de control durante
30 meses. El grupo tratado con insulina presentó mejoría en la
58
secreción de insulina, medida por péptido C en ayunas, además negativizó el test de ICA en 4 de los 5 pacientes y mejoró
el control metabólico (7.33). A partir de ese estudio preliminar
puede suponerse con cierto asidero que la administración de
insulina subcutánea en bajas dosis (menores de 10 U/día) constituye una estrategia terapéutica eficiente (tal vez más inmunomoduladora que sustitutiva), a diferencia del tratamiento
convencional con sulfonilureas. Ese estudio fue señero para
tratar de prevenir la falla lenta y progresiva de las células ß en
pacientes con diabetes clínicamente clasificables como tipo 2,
pero con autoinmunidad específica demostrada a través de los
marcadores convencionales. De todas maneras, para confirmar
apropiadamente esas presunciones se aguardan nuevos estudios, con un mayor número de pacientes, con seguimiento más
extendido y con diseños más completos, incluyendo la utilización precoz de insulina y la determinación precisa de la reserva pancreática. También será necesario demostrar la posible
disminución de las complicaciones crónicas de la diabetes en
los pacientes sometidos al tratamiento insulínico precoz para
poder validar la utilidad de este tipo de intervención. Mientras
tanto, el tratamiento en primera instancia con insulina, para
los pacientes diabéticos tipo 2 con autoinmunidad demostrable y el seguimiento de control de la reserva pancreática de la
hormona, parecería ser el enfoque más racional.
Por otro lado, independientemente de la veracidad de la posible acción inmunomoduladora de la insulina, en pacientes con
diabetes tipo 1 se ha demostrado que es más fácil alcanzar un
adecuado control metabólico y menores complicaciones microvasculares, administrando pequeñas dosis de insulina y tratando de presevar la masa remanente de células ß (7.34). En otro
estudio, la pérdida completa de la secreción de insulina fue
asociada con un comienzo más temprano de retinopatía preproliferativa (7.35).
El estudio en dos fases denominado Diabetes Prevention TrialType 1 Diabetes (DPT-1) relevó la presencia de marcadores en
más de 84.000 y 103.000 familiares sanos de primer y segundo
grado, respectivamente, y una fracción minoritaria de ellos ingresó en el protocolo de tratamiento con insulina. Los resultados tanto del primer trial, donde se administró insulina parenteral (7.36), como los del segundo trial, donde se administró insulina oral (7.37), no demostraron freno parcial ni prevención
en la evolución hacia la diabetes tipo 1, comparando los resultados entre los individuos tratados y los controles con placebo.
Sin embargo, en ambos casos las edades de los individuos (11.2
y 10.25 años) y los parámetros cuantitativos de riesgo, eran di-
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Figura 8.1
Caso clínico: modelo 1
Sexo: Femenino
Edad: 26 años
Peso: 55 Kg; Talla: 1.62m; BMI: 20
Antecedentes: Sin antecedentes
personales o familiares de diabetes.
Historia clínica: A los 25 años,
primer embarazo. A la 8a semana:
glucemia 99 mg%; en 7º mes, feto
muerto y retenido. Post-cesárea:
glucemia 331 mg%. Peso 54 Kg pasa a
51.5 Kg. Tratamiento: Metformina
(6 meses).
Servicio de Diabetes: Primera
consulta; glucemia 161 mg%; HbA1c
6.9% (VN 6.4%)
Se solicita:
- Péptido C: 0.29 nM (VN 0.6 nM)
ICA: 20 UJDF (VN 5-10 UJDF)
- Marcadores: GADA: 5.4 U/ml
(Positivo); IAA: Negativo
- HLA: DQB1 0201/0302
(susceptibilidad)
Diagnóstico: Diabetes tipo 1 (LADA)
Durante el embarazo se debió haber
realizado curva de sobrecarga con 75 g
de glucosa (superó el nivel
de 95m g%)
Tratamiento: Insulina NPH humana, 12
U/dia, en 2 dosis.
Control: Buen control glucemia
(automonitoreo y laboratorio)
y de HbA1c; peso: 55 Kg.
Ficha médica con datos bioquímicos e
inmunogenéticos del caso clínico
Modelo 1.
ferentes a los de individuos adultos que estamos considerando,
cuya evolución a la diabetes autoinmune y a la dependencia (o
requiriencia) insulínica es en general más lenta y se supone que
exhiben otra constitución genética que los lleva a debutar en
edad superior a los 25 o 35 años, según los distintos autores.
Por último no sólo la insulinoterapia podría ser útil en preservar la masa de células ß en el LADA, ya que otras estrategias
abren una esperanza a futuro, no sólo para evitar el deterioro
de la masa de células ß, sino para prevenir la enfermedad autoinmune. Entre ellas se encuentran la insulina inhalante y los
antígenos administrados a modo de “vacunas”, ya sean completos, como la GAD recombinante, o los péptidos representativos de los epitopes T, como algunos fragmentos de la proinsulina. El paciente LADA constituye un excelente modelo para
este tipo de intervenciones precoces y luego para poder extender los modelos terapéuticos a la diabetes tipo 1 de comienzo
en edades tempranas de la vida.
En resumen, una vez establecido el diagnóstico de LADA, el
tratamiento debe ser instituido de acuerdo al control metabólico y a la reserva insulínica, con el objetivo de preservar la masa de células ß y por lo tanto la secreción de la propia hormona. A tal fin no parece ser adecuado el tratamiento convencional con sulfonilureas, en cambio la terapia insulínica y las glitazonas parecen constituir los recursos terapeúticos más convenientes. En cambio, en los pacientes con diagnóstico de LADA y
signos de resistencia a la insulina, o síndrome metabólico, la
utilización de metformina puede ser lo más conveniente.
Es indudable que se requieren más trabajos de investigación
clínica con mayor número de pacientes y con mayor tiempo de
seguimiento para establecer el tratamiento más adecuado. En
ese sentido se ha establecido el Programa ADA de la Sociedad
Argentina de Diabetes, el cual desde la primera fase en curso
encara la prospección de marcadores y la genotipificación HLA
para detectar los casos de diabetes en adultos asociados con
autoinmunidad. Se aguarda que las conclusiones de ese estudio multicéntrico lleven a recomendaciones de consenso y a
criterios terapéuticos de guía. Hasta entonces, la clínica y el criterio médico individual, con el soporte de los análisis inmunogenéticos disponibles, determinarán las medidas terapéuticas
a seguir en cada caso.
cial y de Inmunoanalítica especializada que se mencionan en el
Prólogo, permitió acumular una vasta colección de casos inscriptos en la clasificación general de “pacientes diabéticos
diagnosticados en edad adulta, con autoinmunidad demostrable”. Salvo ese patrón general, obviamente todos ellos, en uno
o más aspectos, resultaron diferentes. Por ello sería impracticable y poco útil la exposición de toda la variedad posible de fenotipos y genotipos, además asociada a un amplísimo espectro
de parámetros bioquímicos e inmunológicos. Sin embargo, se
estima que la presentación de un par de casos representativos
puede ilustrar someramente sobre cómo se pueden presentar
los casos clínicos, qué tipos de análisis inmunológicos y genéticos complementan los análisis convencionales en Diabetología,
cómo se los interpreta y, finalmente cómo se llega a una conclusión fundamentada sobre el diagnóstico y el tratamiento a
seguir. En las Figuras 8.1 y 8.2 se presentan las fichas resumidas
de dos casos LADA.
Figura 8.1
Caso clínico: modelo 2
Sexo: Masculino
Edad: 35 años
Antecedentes: Sin antecedentes
personales o familiares de diabetes.
Historia clínica: Poliuria, polidipsia y
pérdida de peso; glucemia 354 mg%;
cuerpos cetónicos 4+; glucosuria 4+;
triglicéridos 250 mg% (VN 180 mg%);
colesterol 250 mg% (VN < 200 mg%);
LDLc 170 mg% (VN 100 mg%); HDLc
35 mg% (VN > 40 mg%).
Tratamiento: Insulina NPH, 36 U/día,
en 2 dosis; buen control metabólico y
peso; Luego descenso glucémico
e hipoglucemia.
Discontinúa la terapia, con
normoglucemia y HbA1c normal
(6 meses).
Consulta otro profesional: Tratamiento
con glibenclamida 10 mg/día.
Servicio de Diabetes:
Primera consulta: Se solicita:
ICA: Negativo
- Marcadores: GADA: 7 U/ml (Positivo)
IAA/IA: Negativo
- HLA: DQB1 0501/0502
(susceptibilidad)
Diagnóstico: Diabetes tipo 1(LADA)
Tratamiento: Reinicio de la insulinoterapia.
Ficha médica con datos bioquímicos
e inmunogenéticos del caso clínico
Modelo 2.
8. CASOS MODELO
La experiencia recogida por los autores de este artículo a lo
largo de muchos años desde los servicios de Medicina asisten60
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Diabetes
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3:57 PM
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FE DE ERRATAS Diabetes
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3:10 PM
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Diabetes mellitus autoinmune de inicio en edad infanto-juvenil y adulta
Fe de erratas
Estimado doctor/doctora:
En la separata “Diabetes mellitus autoinmune de inicio en edad infanto-juvenil y adulta”. Bases
racionales para el diagnóstico diferencial y el tratamiento, deseamos aclarar lo siguiente:
En la página 49, al pie, la figura 7.1 debe ser reemplazada por la que mostramos a continuación.
Figura 7.1
Algoritmo sugerido para el diagnóstico
de diabetes en edad infanto-juvenil.
Por otra parte en la página 56, encabezando, la figura 7.3 debe ser reemplazada por la que mostramos a continuación.
Figura 7.3
Algoritmo sugerido para el diagnóstico
de diabetes autoinmune en el adulto.
1