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TEMA 10: DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS
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Tema 10. Diagnóstico de enfermedades genéticas
Estrategias generales de diagnóstico de enfermedades genéticas. Métodos
de
detección
de
mutaciones.
Aplicación
del
ligamiento
genético
al
diagnóstico de enfermedades genéticas. Diagnóstico prenatal. Genética
forense.
Estrategias generales de diagnóstico de enfermedades genéticas
Como en cualquier otro tipo de patologías, el diagnóstico de enfermedades genéticas se realiza mediante
la identificación clínica de los síntomas y signos que caracterizan cada síndrome concreto, apoyado en
datos de laboratorio. Con los avances del Proyecto Genoma Humano, hoy en día es posible, en muchos
casos, analizar directamente la alteración causal a nivel del ADN. De todas formas, en el entorno clínico
nos encontramos varios problemas que pueden dificultar el diagnóstico correcto. En primer lugar, la
posible presencia de heterogeneidad genética: varios genes pueden ser los responsables de una única
enfermedad. Esta circunstancia hace muy laborioso el estudio mutacional, ya que multiplica el número
de exones que hay que analizar. Incluso en aquellos casos en los que se sabe con exactitud cuál gen
está alterado, puede suceder que las mutaciones responsables del cuadro clínico se distribuyan por todo
el gen (fenómeno que algunos autores denominan heterogeneidad alélica), de manera que sería
necesario analizar toda la región codificante antes de poder descartar o confirmar que el gen en cuestión
está mutado. Lógicamente, si se trata de un gen de gran tamaño, el análisis se hace extremadamente
laborioso. La situación opuesta vendría dada por aquellas enfermedades genéticas que están causadas,
en la gran mayoría de familias, por una misma mutación, de manera que podemos centrarnos en el
estudio de esa mutación concreta para confirmar o descartar el defecto molecular que provoca esa
enfermedad.
Por tanto, hemos de sopesar todas las circunstancias mencionadas para decidir si nos inclinamos por
realizar lo que se denomina diagnóstico directo (análisis de un individuo para ver si es portador de la
mutación concreta que causa la enfermedad en esa familia), o si por el contrario aplicaremos el
denominado diagnóstico indirecto (análisis de marcadores genéticos en la familia para ver si el
consultando ha heredado el cromosoma que lleva la mutación). A continuación discutiremos las ventajas
e inconvenientes de cada una de estas aproximaciones diagnósticas, así como los métodos más
habitualmente empleados.
El video de la Figura 10.1 explica las dos estrategias diagnósticas para
detectar alteraciones genéticas en enfermedades humanas.
Métodos de detección de mutaciones
Como hemos dicho, el diagnóstico directo consiste en el estudio de un gen —cuya implicación en el
desarrollo de una enfermedad ya ha sido demostrada— para detectar la presencia de posibles
mutaciones en el mismo. En aquellos casos en que las mutaciones patogénicas pueden estar localizadas
a lo largo de toda la secuencia codificante del gen (heterogeneidad alélica fuerte), se deben utilizar
métodos "de barrido", que examinan cada exón por separado para detectar simplemente si existe una
mutación o no. Estos métodos no identifican el tipo de mutación, pero nos permiten descartar
rápidamente todos aquellos exones normales, para centrarnos en el estudio de los exones mutados. En
cambio, cuando queremos detectar una mutación concreta, porque ya sabemos que es ésta mutación la
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que origina la enfermedad en esta familia, utilizaremos métodos dirigidos a identificar únicamente esa
mutación (métodos "de confirmación"). Éstos últimos son quizás los métodos más utilizados en el
contexto de un laboratorio diagnóstico, especialmente en aquellas enfermedades que tienen una
heterogeneidad alélica limitada, es decir, enfermedades en las que un pequeño número de
mutaciones causan la inmensa mayoría de los casos. Los ejemplos más notorios son la mutación C282Y
(que causa la mayoría de los casos de Hemocromatosis Hereditaria en europeos); la mutación F508del,
responsable de hasta el 80% de los casos de Fibrosis Quística en individuos nor-europeos; la inversión
de los exones 1-22 del gen del Factor VIII de la coagulación (responsable de un 50% de los casos de
hemofilia A); la mutación G380R del gen FGFR3 (que causa la mayoría de los casos de Acondroplasia),
las mutaciones N370S y L444P (que detectan la mayoría de los casos de Enfermedad de Gaucher), o
las enfermedades por expansión de trinucleótidos (Enfermedad de Huntington, Síndrome del X Frágil,
etc). A continuación analizaremos algunos de los métodos más utilizados en el diagnóstico directo, tanto
métodos de barrido como de confirmación.
1. MÉTODOS DE BARRIDO para la detección rápida de mutaciones (sin identificar el tipo concreto de
mutación). Excepto en el primero (SSCP) estos métodos se basan en la detección de heteroduplexes,
que se forman por la reasociación lenta de las cadenas tras la desnaturalización del fragmento de ADN.
Cuando el fragmento contiene una mutación y se mezcla con un ADN normal, la desnaturalizaciónreasociación da lugar a moléculas heteroduplex portadoras de un desemparejamiento (mismatch)
precisamente en el nucleótido donde está la mutación.

SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism, Polimorfismo de la Conformación de Cadenas
Sencillas). Un cambio en la secuencia provoca cambios conformacionales cuando el ADN se
desnaturaliza (se separan las dos cadenas) y se deja que cada cadena se repliegue por separado.
Estos cambios conformacionales se detectan porque alteran la migración electroforética en geles de
poliacrilamida no-desnaturalizantes. En el ejemplo típico, se amplifica un exón mediante PCR, se
desnaturaliza el producto de PCR por calor, se cargan los productos desnaturalizados en un gel de
acrilamida, se realiza la electroforesis y se tiñe el gel mediante una tinción específica para el ADN
(tinción de plata, por ejemplo). Si no hay mutaciones, se detectarán únicamente las bandas
correspondientes al homodúplex (resultado de la reasociación parcial de las dos cadenas
complementarias durante la electroforesis) y las bandas correspondientes a cada una de las cadenas
sencillas que se han replegado adoptando una conformación determinada. En cambio, la presencia
de una mutación dará lugar a nuevas bandas debidas al patrón de plegamiento de las
cadenas sencillas mutantes, que será diferente al de las cadenas nativas. Como hemos
comentado, este análisis no nos dice de qué tipo de mutación se trata: para eso es necesario
secuenciar este producto de PCR y compararlo con la secuencia normal. La ventaja es que nos
permite descartar la presencia de mutaciones rápidamente, lo que ahorra tiempo y recursos.
Figura 10.2 Video que explica gráficamente la técnica de SSCP.

DGGE
(Denaturing
Gradient
Gel
Electrophoresis,
Electroforesis
en
Gel
con
Gradiente
Desnaturalizante) y sus variantes, entre las que destaca TGGE (Temperatura Gradient Gel
Electrophoresis). Esta técnica se basa en someter una muestra de ADN a una electroforesis en geles
de acrilamida con un gradiente desnaturalizante químico o térmico, de manera que la muestra se
encuentra con condiciones cada vez más desnaturalizantes a medida que avanza por el gel. Las
muestras de ADN son productos de PCR (exones, habitualmente) en cuyo extremo hay una región
corta muy rica en citosinas y guaninas (región llamada "clamp" o "pinza" GC), de forma que la
temperatura de desnaturalización de esta pequeña región es mayor que la del resto del fragmento.
Por tanto, cuando el fragmento va avanzando por el gel, llegará un momento en que se
desnaturaliza todo excepto la región del clamp-GC. El resultado es que el fragmento se frena
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y deja de avanzar por el gel. Cuando la muestra de ADN es un heteroduplex que contiene un
desemparejamiento, su punto de desnaturalización será distinto al del fragmento nativo, y por tanto
se parará en un punto distinto del gel. Esto se reflejará en la aparición de una banda con distinta
migración electroforética.
La Figura 10.3 ilustra el fundamento de las técnicas que detectan la
presencia de heterodúplex, con ejemplos de DGGE y TGGE.

DHPLC (Denaturing HPLC) es una técnica en la que los heteroduplex y homoduplex son separados
en un aparato de HPLC (High Performance Liquid Chromatography) utilizando un gradiente
desnaturalizante de acetonitrilo y variando la temperatura de la columna. La muestra se injecta en
una columna de cromatografía y el ADN se une a la matriz. El acetonitrilo deshace estas
interacciones y el ADN eluido se detecta a la salida de la columna midiendo la absorbancia a 260
nm, originando un pico a un tiempo de elución característico. En temperaturas bajas, no
desnaturalizantes, la concentración de acetonitrilo necesaria para eluir un fragmento depende del
tamaño y la secuencia del mismo, por lo que cada fragmento da lugar a un pico de elución
característico. Al aumentar la temperatura de la columna, la elución tiene lugar a concentraciones
menores de acetonitrilo, a medida que el fragmento comienza a desnaturalizarse. Como los
heteroduplex se desnaturalizan a temperaturas distintas a los homoduplex, generan picos a tiempos
de elución diferentes. De este modo es posible detectar mutaciones puntuales. La gran ventaja del
DHPLC es su rapidez, ya que los tiempos de elución típicos están en torno a los 5 minutos y una
muestra se puede analizar en 10 minutos. Por tanto, conserva la gran sensibilidad de los métodos
de detección de heteroduplex que utilizan un gradiente desnaturalizante (temperatura, en este
caso), pero tiene una procesividad mucho mayor y es fácilmente automatizable.
La figura 10.4 presenta ejemplos del análisis mediante DHPLC. En la
imagen se puede ver el análisis de dos muestras (una muestra normal y
una muestra con una mutación) del exón 12 del gen JAK2, analizadas a
dos temperaturas distintas. Tanto a 56ºC como a 56,4ºC se puede
distinguir la muestra normal de la muestra que lleva la mutación, que
presenta dos pequeños picos antes del pico principal. Los picos
pequeños corresponden a los heterodúplex, y sólo aparecen si en el
ADN original hay una mutación.
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
Rotura de Desemparejamientos (Mismatch Cleavage). Es un método basado en el hecho de que
determinados tratamientos químicos o enzimáticos son capaces de romper un fragmento de ADN
específicamente en el punto donde existe un desemparejamiento. Como hemos dicho, los
heteroduplexes son portadores de un desemparejamiento (mismatch) precisamente en el nucleótido
donde está la mutación. Por tanto, el tratamiento con determinadas sustancias romperá el
fragmento sólo en el caso de que existan desemparejamientos, de forma que una electroforesis en
gel será suficiente para comprobar la presencia de una mutación.

PTT (Protein Truncation Test, Prueba de truncamiento de proteínas). Es un método especialmente
dirigido a la detección de mutaciones que crean un codón de parada prematuro y provocan el
truncamiento de la proteína. Para llevar a cabo esta prueba, se prepara ADNc mediante RT-PCR
(PCR tras transcripción reversa del ARN del paciente) utilizando un cebador que contiene la
secuencia del promotor del fago T7 y la secuencia consenso de inicio de la traducción (secuencia de
Kozak). Esta construcción permite realizar la transcripción y traducción in vitro, a partir del producto
de la RT-PCR. El análisis en un gel de acrilamida de los fragmentos proteicos que resultan de la
transcripción/traducción revelará la presencia de una banda correspondiente al tamaño esperado
para la secuencia nativa, o bien otras bandas de menor tamaño correspondientes a todas las
posibles mutaciones que provoquen un truncamiento del producto proteico (mutaciones sin sentido,
los cambios del marco de lectura y las mutaciones que afectan a las secuencias de ayuste).
La figura 10.5 ilustra el fundamento de la técnica de PTT.

Secuenciación. Hoy en día, con la aparición de equipos fluorescentes automatizados y con bajo
coste por reacción, la secuenciación directa de productos de PCR (exones, o incluso la secuenciación
directa de un ADNc obtenido por RT-PCR) es un método cada vez más popular de detección de
mutaciones. Tiene la ventaja de que identifica el tipo de mutación, y de hecho es un paso obligado
para identificar las mutaciones detectadas por los métodos de barrido que acabamos de explicar.
Sin embargo, sólo es realmente fiable cuando el ADN mutado está en una proporción superior al 1520% del total de ADN presente en la muestra. Aunque esto se cumple en las enfermedades
hereditarias, no es así cuando se trabaja con muestras procedentes de tumores, en las que con
frecuencia la cantidad de células tumorales es baja y no todas son portadoras de una mutación
concreta (por lo que el número de moléculas mutadas puede ser inferior al 15% del total).
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La figura 10.6 muestra una mutación detectada mediante secuenciación
en el nucleótido 97 de este fragmento, cuya secuencia normal se
representa en el electroferograma superior. Debajo de él vemos la
secuenciación
de
una
muestra
de
un
paciente,
con
dos
picos
(correspondientes a timina y citosina) en esa posición. La herramienta
informática detecta automáticamente este tipo de alteraciones y nos
alerta sobre la presencia de una posible mutación (figura inferior).
Cada uno de los métodos de barrido que hemos visto tiene sus ventajas e inconvenientes, sobre todo en
lo referente a la sensibilidad (porcentaje de mutaciones que son capaces de detectar), coste,
complejidad técnica, capacidad de especificar la posición de la mutación, etc. Aunque las características
de cada método se presentan resumidas en la siguiente tabla, la elección de un método u otro
dependerá de las peculiaridades de cada laboratorio, del gen que se quiera estudiar, los medios
disponibles y la experiencia previa con cada uno de los métodos.
MÉTODO
Secuenciación
VENTAJAS
INCONVENIENTES
Detecta todas y especifica la
Excesiva información, coste alto,
posición.
laboriosa.
Sencillo.
Secuencias <400bp.
Buena sensibilidad.
No especifica posición.
SSCP
Cierta complejidad.
DGGE y DHPLC
Muy alta sensibilidad.
No especifica posición.
Rotura de
Muy alta sensibilidad.
Gran dificultad técnica.
Desemparejamientos
Puede especificar posición.
Toxicidad OsO4.
Alta sensibilidad.
No todos los tipos de mutaciones.
Especifica la posición.
Complejidad técnica, coste.
PTT
2. MÉTODOS DE COMPROBACIÓN para detectar de la existencia de una mutación específica:
PCR-Digestión. El fundamento de esta técnica reside en el hecho de que la mutación crea o
destruye una diana de restricción, de modo que la simple digestión del producto de PCR con el
enzima de restricción permite determinar, en un gel de agarosa, el patrón de digestión indicativo de
la presencia o ausencia de la mutación. Es un método que, por su sencillez y rapidez, es uno de los
más utilizados en laboratorios clínicos. La principal limitación, lógicamente, es que no todas las
mutaciones alteran una diana de restricción.
La figura 10.7 explica el proceso de detección de una mutación
específica mediante la digestión de un producto de PCR con enzimas de
restricción.
ASO (Allele Specific Oligonucleotide, Oligonucleótido Especifico de Alelo). Una técnica bastante
utilizada en los primeros años del diagnóstico molecular, aunque hoy en día ha caído en cierto
desuso. Se basa en el diseño de sondas específicas para el alelo mutado y para el alelo nativo,
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utilizando oligonucleótidos. El tamaño de las sondas hace que su Tm (temperatura de
desnaturalización) sea lo suficientemente distinta para que —en determinadas condiciones de
hibridación— la sonda específica del alelo normal hibride solamente con ADN normal, y la sonda
específica del alelo mutado hibride específicamente con ADN genómico que contiene la mutación. El
ADN de los pacientes (puede ser tanto ADN genómico como un exón amplificado mediante PCR) se
deposita en membranas de nylon haciendo un "dot-blot", y esas membranas se hibridan con cada
una de las sondas (oligonucleótidos marcados con radioactividad o con fluorescencia). El análisis de
la hibridación de cada sonda permite identificar si la muestra contiene un solo alelo mutado
(heterocigoto), dos alelos mutados (homocigoto para la mutación), o ninguno (homocigoto sano).
ARMS
(Amplification
Refractory
Mutation
System,
Sistema
de
Mutación
Resistente
a
la
Amplificación) está basada en el mismo principio que ASO, es decir, la utilización de oligonucleótidos
específicos para la secuencia normal y para la secuencia mutada. La diferencia estriba en que, en el
caso del ARMS, estos oligonucleótidos son cebadores de PCR. Se diseñan, por tanto, dos reacciones
de PCR que comparten un mismo cebador común pero se diferencian en los cebadores específicos
para cada alelo: un cebador amplificará sólo el alelo normal, el otro cebador amplificará sólo el alelo
mutado. Dada la rapidez y sencillez de la PCR, esta técnica está desplazando cada vez más a la
técnica de ASO.
OLA (Oligonucleotide Ligation Assay, Ensayo de Ligación de Oligonucleótidos). Se trata de un
método algo más laborioso, pero que —una vez optimizado— permite analizar gran número de
muestras con rapidez y fiabilidad. Se basa en la ligación de dos oligonucleótidos, uno de los cuales
está marcado con biotina y el otro con una molécula radioactiva o fluorescente. El punto crucial es el
diseño de ambos oligonucleótidos a ambos lados de la base mutada. Por ejemplo, un diseño habitual
es que ambos oligos hibriden sobre la secuencia normal, de modo que la mutación impida la
hibridación de uno de ellos. Como consecuencia, la reacción de ligación sólo será efectiva en
presencia de una secuencia normal. Cuando se separan las sondas y se unen por los residuos de
biotina a un soporte que contiene estreptavidinas, sólo las moléculas completas (fruto de la ligación
de los dos oligos) emitirán la señal correspondiente al marcador (radioactividad o fluorescencia). Por
el contrario, el ADN de un sujeto homocigoto para la mutación no dará ninguna señal. En principio,
este método también permite detectar los individuos heterocigotos para la mutación, ya que la
intensidad de la señal emitida será la mitad de la de un individuo homocigoto normal. El método de
OLA permite la automatización y la cuantificación de la señal cuando se utilizan marcadores
fluorescentes, lo que le convierte en un buen método para el análisis de gran cantidad de muestras.
MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) es una modificación del OLA que permite
determinar el número de copias de hasta 45 genes en un solo ensayo, pudiendo discriminar
secuencias que difieren en un solo nucleótido. MLPA utiliza, para cada gen, dos sondas: una de ellas
es complementaria a la secuencia que se quiere estudiar (21-30 nucleótidos), a la que se añade la
secuencia de un cebador universal en el extremo 5'; la otra sonda de la pareja tiene otra secuencia
complementaria a la diana, un ADN de relleno ―que puede ser de distintos tamaños― y la
secuencia de otro cebador universal en el extremo 3'. Ambas sondas hibridan a ambos lados de la
secuencia diana, y son ligadas por una ligasa termoestable. Con un solo cebador se pueden
amplificar las sondas que se han ligado correctamente. Utilizando secuencias de relleno de distintos
tamaños para cada gen, podemos amplificar en una misma reacción muchos fragmentos distintos, lo
que ahorra mucho tiempo y reactivos. Además, como las condiciones de reacción son las mismas, la
cantidad final de producto es proporcional a la cantidad inicial de ADN, por lo que los resultados de
MLPA pueden ser cuantificados. Por tanto, MLPA permite detectar deleciones y amplificaciones,
además de detectar mutaciones.
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La Figura 10.8 resume los principios generales de varios métodos para
la detección de mutaciones específicas, basados en la utilización de
oligonucleótidos específicos.
Un comentario final a todas estas técnicas de análisis directo es que pueden aplicarse a ADN procedente
de distintos tipos de muestra, ya que trabajan con secuencias amplificadas mediante PCR. Por tanto, es
posible detectar la presencia de mutaciones no sólo en ADN de sangre periférica, sino también en
raspados bucales, vellosidades coriales, cabello, biopsias, material incluido en bloques de parafina o
incluso de tarjetas impregnadas con manchas de sangre (tarjetas de Guthrie, por ejemplo).
El proceso de diagnóstico indirecto de enfermedades genéticas.
Como ya se ha mencionado al principio de este capítulo, hay ocasiones en las que no es posible, o
resulta muy poco práctico, llevar a cabo diagnóstico directo. Esto sucede en aquellos casos en los que no
se conoce la secuencia del gen causante de una enfermedad, o cuando éste es excesivamente grande y
complejo (compuesto por muchos exones, por ejemplo). En estos casos todavía podemos predecir si un
individuo ha heredado la enfermedad, estudiando marcadores específicos que nos permitan identificar
cuál cromosoma de los progenitores es el que lleva la mutación. Una vez identificado, simplemente
hemos de ver qué cromosomas han heredado los hijos, para predecir la probabilidad de que también
hayan heredado la mutación. Como no estudiamos directamente el gen, sino marcadores genéticos que
nos ayudan a identificar los cromosomas, se denomina a este proceso "Diagnóstico Indirecto". Para
comprender el diagnóstico indirecto es necesario repasar los conceptos generales de ligamiento genético
y su aplicación a familias humanas que han sido expuestos en el Capítulo 4.
A veces nos enfrentamos con una enfermedad genética cuyo gen causal no ha sido todavía identificado,
lo que obviamente impide realizar diagnóstico directo. En otras ocasiones, aún conociendo el gen que
debe estar mutado, resulta impracticable realizar estudios de diagnóstico directo en la rutina de un
laboratorio clínico, por la gran heterogeneidad alélica que muestra esa enfermedad (un gran número de
posibles mutaciones pueden ser las responsables del cuadro clínico), o en genes con una estructura
exónica muy compleja. Un ejemplo bastante claro es la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), debida a
mutaciones en el gen de la distrofina. Este gen es muy grande (ARNm de 14 kb) y tiene 79 exones
distribuidos a lo largo de 2,3 Megabases de ADN genómico, por lo que el estudio mutacional de cada
exón sería excesivamente laborioso. En este tipo de situaciones, una alternativa muy utilizada es la de
establecer si el probando ha heredado el cromosoma o los cromosomas parentales que llevan el gen
mutado, o si por el contrario ha heredado los cromosomas parentales normales. Para hacer esto se sigue
un proceso denominado "gene tracking", algo así como "seguir la pista" a los alelos enfermos en una
familia concreta. Esto se hace utilizando marcadores polimórficos situados muy cerca o incluso dentro
del gen en cuestión, escogiendo aquellos marcadores que sean informativos en cada familia concreta.
Los marcadores son del mismo tipo que los utilizados en el análisis de ligamiento (RFLP, microsatélites).
Utilizando esta estrategia podemos saber si un individuo ha heredado una mutación de su progenitor
enfermo simplemente determinando si ha heredado el cromosoma mutado de ese progenitor.
Lógicamente, esta estrategia es válida siempre que no haya habido ninguna recombinación entre el
locus de la enfermedad y el locus del marcador, de ahí que utilicemos marcadores tan cercanos al gen
que la frecuencia de recombinación sea prácticamente cero. De hecho, la metodología empleada
es la misma que en los estudios de ligamiento, pero varía la manera de utilizar la información obtenida:
mientras en los estudios de ligamiento queremos determinar la distancia entre dos loci, en el análisis
indirecto ya sabemos cuál es esa distancia (y conocemos por tanto la frecuencia de recombinación) y
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simplemente utilizamos esa información para determinar cuál cromosoma ha sido transmitido por cada
progenitor a un individuo concreto de la descendencia. El proceso general que se sigue en el diagnóstico
indirecto es el siguiente:
a)
distinguir los dos cromosomas en cada uno de los progenitores: para esto es imprescindible
encontrar un marcador para el que ambos progenitores sean heterocigotos (a poder ser no
idénticos), de manera que esta familia sea totalmente informativa.
b)
resolver la fase de ligamiento en el individuo transmisor: esto supone ser capaces de determinar
cuál de los alelos del marcador segrega con el alelo de la enfermedad (y "viaja", por tanto, en el
mismo cromosoma). Para esto hay que estudiar a los progenitores del individuo transmisor o a su
descendencia y deducir la fase de ligamiento entre el marcador y el gen. Nuevamente, una
recombinación entre ambos loci (enfermedad y marcador) llevaría a resultados erróneos, de ahí la
importancia de usar marcadores cercanos al gen (o intragénicos) de modo que la frecuencia de
recombinación entre ambos sea despreciable.
c)
Determinar el alelo del marcador que ha sido transmitido al probando. Esto nos dirá (con una
fiabilidad mayor o menor dependiendo de la fracción de recombinación entre el marcador y el gen)
si se ha transmitido el cromosoma con el alelo mutado o el alelo normal. Aquí se hace evidente la
enorme utilidad del diagnóstico indirecto: permite establecer si un individuo ha heredado la
mutación sin necesidad de detectar directamente la presencia de la misma. Como hemos
comentado, su gran limitación viene dada porque en ocasiones los marcadores están a cierta
distancia del locus de la enfermedad y las predicciones no son fiables al 100%. Por ejemplo, si la
distancia entre el marcador y el locus de la enfermedad fuese de 5 cM (lo que supone una
frecuencia de recombinación del 5%), la fiabilidad del análisis sólo sería del 95%, ya que en un 5%
de los casos podría haberse dado un sobrecruzamiento entre ambos loci que hubiese trasladado el
alelo mutado al cromosoma homólogo. En la práctica, solventamos esta limitación mediante el uso
de varios marcadores, preferiblemente situados a ambos extremos del locus de la enfermedad. De
esta forma, la única posibilidad de error sería un doble sobrecruzamiento entre el locus de la
enfermedad con cada uno de los marcadores, pero la probabilidad de que esto suceda es
prácticamente despreciable. Lógicamente, a mayor número de marcadores, mayor fiabilidad de los
resultados, sobre todo si además se incluyen marcadores situados dentro del propio gen de la
enfermedad.
La Figura 10.9 explica, mediante un video, el proceso general del
diagnóstico indirecto utilizando marcadores polimórficos en ligamiento con
el gen responsable de una enfermedad genética.
Diagnóstico prenatal
El avance de las técnicas diagnósticas genéticas permite hoy en día, para determinados procesos,
realizar diagnóstico precoz dentro del útero. Esta modalidad diagnóstica, llamada diagnóstico
prenatal, es con frecuencia causa de la petición de consejo genético, y tiene unos matices especiales
por las implicaciones emocionales fuertes que conlleva para la familia. El desarrollo de los métodos de
diagnóstico prenatal ha ido parejo a la práctica del consejo genético, y por tanto se ha realizado de
modo responsable y adecuado. En cambio, el uso generalizado de nuevos métodos, especialmente la
ecografía, fuera del contexto del consejo genético (o incluso como sustituto del mismo) sin realizar
adecuadamente el cálculo de riesgos, la detección de portadores ni otras medidas de apoyo, supone un
descenso en la calidad de la asistencia que reciben las familias con enfermedades genéticas. El uso de
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pruebas de barrido (screening) en el primer trimestre del embarazo significa que la mayor parte de las
consultas de diagnóstico prenatal se realizan en situaciones en las que no existía riesgo previo de
una enfermedad genética, lo cual genera situaciones especialmente delicadas que es importante
gestionar bien.
Dado que los procesos de diagnóstico prenatal suponen una cierta tensión emocional para la familia,
especialmente para la madre, y pueden provocar una morbilidad fetal significativa, se recomienda que
sólo se realice diagnóstico prenatal cuando se cumplen una serie de condiciones y en aquellos casos en
que está indicado. En concreto, sólo se debe plantear el diagnóstico prenatal en el caso de
enfermedades graves para las que exista un método diagnóstico específico y fiable, y que sean
susceptibles
de
tratamiento
o
prevención.
Las
indicaciones
principales,
por
tanto,
son
las
cromosomopatías, los defectos del tubo neural, y la edad materna avanzada. También se debe valorar la
aceptación o no (por motivos éticos, religiosos o de índole personal) por parte de la familia, del aborto
eugénico como opción. En general, la mayoría de los autores desaconseja iniciar los estudios de
diagnóstico prenatal cuando dicha opción no resulte aceptable, pues no está claro que el diagnóstico
conlleve ningún beneficio y por el contrario pueden generarse conflictos serios que son difíciles de
resolver y a los que el facultativo no podrá dar respuesta. En estas circunstancias, el diagnóstico
prenatal sólo sería de utilidad si se pueden tomar medidas preventivas o terapéuticas en el periodo fetal,
lo cual por ahora sólo es posible en un número reducido de enfermedades. Por tanto, antes de la puesta
en marcha del proceso de diagnóstico prenatal es importante conocer las disposiciones de la familia
respecto a las posibles opciones terapéuticas, además de considerar otros factores como la severidad
de la posible enfermedad, la posibilidad de tratamiento o medidas preventivas, y la fiabilidad de las
técnicas de diagnóstico prenatal. Este último punto es también de gran importancia, y debe ser
explicado con claridad y ejemplos prácticos, porque el concepto de "riesgo" no siempre es correctamente
entendido. Igualmente es importante que no se realice diagnóstico prenatal sin una estimación previa
del riesgo que tiene un feto concreto de padecer la enfermedad: el diagnóstico prenatal no está exento
de complicaciones y supone en sí mismo un riesgo para el feto, por lo que no está justificado realizarlo
cuando el riesgo previo de padecer enfermedad es muy bajo. Esto supone, lógicamente, que el
diagnóstico prenatal debe formar parte del proceso global de consejo genético y ser realizado, siempre
que sea posible, por especialistas en genética clínica.
Los dos métodos más utilizados para la obtención de material fetal son la amniocentesis y la toma de
una biopsia de vellosidades coriónicas. La amniocentesis consiste en la toma de una muestra de líquido
amniótico, que contiene células fetales en suspensión. Dichas células se pueden cultivar in vitro para
después realizar estudios cromosómicos, bioquímicos o moleculares, lo cual requiere entre 1 y 3
semanas. El procedimiento es guiado por ultrasonidos y, en manos experimentadas, fiable. Sus
principales inconvenientes son el límite de edad fetal, ya que no puede realizarse antes de las 15
semanas de gestación, y los riesgos de pérdida fetal que conlleva (en torno al 0,5-1%). La biopsia de
de vellosidades coriónicas puede realizarse durante el primer trimestre del embarazo, en torno a la
décima semana, y es especialmente útil para realizar estudios moleculares y en la presencia de un
riesgo alto de cromosomopatía. En cambio, es menos utilizada que la amniocentesis cuando el riesgo de
alteraciones citogenéticas es bajo. El procedimiento se realiza mediante punción a través de la pared
abdominal (transabdominal) o a través del cuello del útero (transcervical), bajo guía ecográfica. En ese
momento, el tejido coriónico todavía no forma una placenta propiamente dicha, por lo que la biopsia se
examina bajo microscopio y se aíslan las vellosidades (que únicamente contienen tejido fetal). El
material obtenido puede utilizarse directamente (sin necesidad de cultivo) para estudios moleculares o
enzimáticos. En general, este procedimiento se reserva para embarazos de alto riesgo, ya que la
probabilidad de pérdida fetal es mayor que en la amniocentesis (en torno al 2-3%).
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Figura 10.10 Este video muestra gráficamente el procedimiento de la
amniocentesis.
Dado el riesgo relativamente alto de daño fetal que tienen la amniocentesis y, sobre todo, la obtención
de vellosidades coriónicas, desde hace años se están buscando métodos no invasivos que permitan
realizar estudios moleculares o bioquímicos en material fetal. Entre éstos, están siendo muy utilizados
los métodos ecográficos, el análisis bioquímico de sangre materna, el análisis de células fetales
presentes en la sangre materna, o incluso la obtención de sangre fetal (aunque este procedimiento es
más invasivo y por tanto más peligroso que los otros mencionados). Con la proliferación de las técnicas
de
fertilización
in
vitro,
hoy
en
día
también
es
posible
realizar
diagnóstico
genético
preimplantatorio, obteniendo un blastómero a partir de un embrión de pocas células y realizando
estudios moleculares a partir del ADN de esa única célula. Por desgracia, dicho procedimiento
habitualmente no se realiza en el contexto del consejo genético, y todavía no existen datos claros acerca
del posible daño fetal que pueda producir. Tampoco hay estudios abundantes sobre las tasas de error
que se obtienen en el diagnóstico de las distintas enfermedades genéticas, y en cualquier caso su
aplicación viene limitada por la baja tasa de éxito de la fertilización in vitro.
Figura 10.11 Un video en el que se ve el diagnóstico por ecografía 4D (3D
en tiempo real) de un feto de 14 semanas y seis días.
Genética forense
Los polimorfismos del ADN que se han estudiado en el Tema 1 tienen una aplicación práctica muy
concreta: como son únicos para cada persona, pueden utilizarse para identificar un muestra biológica
como perteneciente a un individuo concreto. Desde que Alec Jeffreys desarrolló el concepto de “huella
dactilar genética” (genetic fingerprint), el análisis de polimorfismos se ha convertido en una
herramienta esencial en medicina legal y forense: pruebas de paternidad, identificación del culpable de
un crimen, identificación de restos humanos, etc.
En 1985, Alec Jeffreys descubrió sondas de ADN que hibridaban con minisatélites distribuidos en varios
loci por el genoma humano (conocidos también como VNTR: Variable Number of Tandem Repeats).
Aunque utilizaba un sonda frente a un VNTR del gen de la mioglobina que no es polimórfico, al hibridar
mediante Southern blot en condiciones poco restrictivas la sonda se unía a otros minisatélites que sí son
polimórficos en la secuencia GGAGGTGGGCAGGARG. Esto llevó al desarrollo de sondas multilocus, que
dan patrones de bandas complejos y únicos para cada individuo.
El problema del Southern blot es que requiere grandes cantidades de ADN, por lo que no puede
utilizarse en algunos escenarios forenses en los que sólo se cuenta con una pequeña muestra (un pelo,
saliva, etc). La llegada y popularización de la técnica de PCR a finales de los años 80 hizo posible
estudiar pequeñas cantidades de ADN, pero no es aplicable a los minisatélites debido a su gran tamaño.
Por ello, se introdujo el análisis de otro tipo de polimorfismos, los microsatélites (también llamados
STR: Short Tandem Repeats). Se trata de marcadores de un solo locus, pero la combinación de un
número relativamente bajo de microsatélites (entre 10 y 15) permite llegar a niveles de confianza muy
altos cuando se comparan dos muestras de ADN.
TEMA 10: DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS
11
Figura 10.12 Análisis de VNTR en muestras de ADN de una mancha de
sangre y de varios sospechosos. El módulo “Human Identification” de esta
animación muestra todo el proceso de análisis de microsatélites utilizado
en medicina legal y forense.
Es muy importante comprender cómo se establece la fiabilidad de esta tecnología. En primer lugar, la
comparación de perfiles de ADN permite excluir que dos muestras sean idénticas, y por tanto se
puede decir con total certeza que un individuo no ha dado lugar a la muestra obtenida en la escena del
crimen, por ejemplo. En cambio, nunca se puede decir con total certeza que el sospechoso sea
culpable aunque los perfiles genéticos de ambas muestras sean idénticos, porque existe la posibilidad de
que otra persona (en el mundo, o en ese país) tenga ese mismo perfil genético. Por tanto, esto debe
expresarse siembre como la probabilidad de encontrar otra persona (distinta del sospechoso) con ese
mismo perfil genético. Es decir, lo que se trata de establecer es la probabilidad de que el acusado
sea inocente a pesar de que su perfil genético coincida con el obtenido en la escena del
crimen. Es muy importante comprender que no se trata de establecer la probabilidad de que el perfil
genético del sospechoso coincida con la muestra, si es inocente. Esta confusión, conocida como “la
falacia del fiscal” ya que puede confundir a un jurado, puede explicarse con el siguiente ejemplo. Un
determinado perfil genético (una combinación de varios microsatélites) tiene una determinada
probabilidad en una población concreta, dependiendo de las frecuencias alélicas de esos polimorfismos
en esa población. Esa probabilidad se calcula como se ha explicado en la Figura 10.11. Suponiendo que
dicha probabilidad es 1 en 106, un fiscal podría intentar convencer al jurado de que un sospechoso con
ese perfil genético tiene una probabilidad de una en un millón de ser inocente, pero esto no es así. Si en
esa población hay, por ejemplo, 20 millones de posibles culpables, resulta que podríamos encontrar
por azar 20 individuos con ese mismo perfil genético, de los cuales obviamente sólo uno puede
ser el culpable. Por tanto, la probabilidad real de que el sospechoso sea culpable es de 1 por cada 20
incluso cuando su perfil genético coincide con la muestra obtenida en la escena del crimen. Dicho de otro
modo, tiene una probabilidad de 19 sobre 20 de ser inocente aunque su perfil genético coincida
TEMA 10: DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS
12
con el obtenido en la escena del crimen. En cualquier caso, hoy en día se obtienen perfiles con
probabilidades de aparición por azar muy bajas (en torno a 10-15), por lo que resultan muy fiables.
Los perfiles genéticos también pueden utilizarse para la identificación de restos humanos y
establecer su parentesco con otros restos o con personas vivas. En estos casos suelen utilizarse
polimorfismos del cromosoma Y o del ADN mitocondrial, por la razón de que se heredan
exclusivamente por vía paterna (el cromosoma Y) o materna (el ADN mitocondrial). El caso más
conocido es el estudio de los restos de la familia real rusa que aparecieron en una fosa en Siberia, y
el juicio que se desarrolló en Alemania en torno a la identidad de una mujer que decía ser Anastasia, la
hija perdida del zar asesinado. Años después, el estudio de los restos óseos, comparando su ADN
mitocondrial con el de miembros vivos de otra casa real que compartían un ancestro femenino, demostró
que esa mujer no podía haber sido la hija de Nicolás II.
Figura 10.13 El módulo “Recovering the Romanovs” de esta animación
muestra cómo se utilizó el ADN mitocondrial para establecer la identidad
de los restos de la familia real rusa.
Como se ha estudiado en el Tema 1, actualmente disponemos de un catálogo amplísimo de otro tipo de
marcador genético, los SNP. Hoy en día estos marcadores también se utilizan en genética forense, ya
que algunos de ellos están fuertemente asociados con ciertos rasgos fenotípicos (color de los ojos, color
del pelo, estatura, etc.) o con la procedencia geográfica. Por ejemplo, estudiando unos pocos SNPs de
una muestra anónima se puede decir con bastante fiabilidad el origen geográfico o el color de los
ojos de esa persona, y esto a veces ayuda en el terreno legal o forense.
Los avances realizados en genética forense han llevado a los gobiernos de distintos países a poner en
marcha bases de datos con perfiles genéticos de segmentos de la población más o menos amplios,
lo cual tiene implicaciones ética, legales y sociales de cierta envergadura. En Estados Unidos, el FBI
comenzó en 1998 una base de datos llamada CODIS (Combined DNA Index System), con más de dos
millones de perfiles de 13 microsatélites, procedentes de individuos que han sido condenados por algún
delito o de escenas criminales. En el Reino Unido, el National DNA Database (NDNAD) puede incluir el
perfil genético (10 microsatélites) de cualquier ciudadano que sea arrestado por algún delito, aunque
después sea declarado inocente. Según la policía británica, esta información ha ayudado a esclarecer
más de 300.000 crímenes desde su creación en 1998.