Download microscopia optimizada por ordenador

MICROSCOPIA
OPTIMIZADA POR
ORDENADOR
CONSEJOS DE CAPTURA DE
IMÁGENES DESDE EL
MICROSCOPIO
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Jose Luis Luque Ojeda
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MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR
• INTRODUCCIÓN
• CONSIDERACIONES PREVIAS
• POSIBLES CAUSAS DE UNA MALA
IMAGEN
• AJUSTE KOHLER
• MALOS PROCEDIMIENTOS
• CAPTURA DE IMAGEN
• CONSEJOS
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MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR
INTRODUCCIÓN
Para obtener unos buenos resultados en el análisis de
imagen, es importantísimo partir de una buena
adquisición de esa imagen.
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CONSIDERACIONES PREVIAS
• HACER BIEN LOS PROTOCOLOS DE FIJACIÓN, TINCIÓN ….
• CANTIDAD DE CÉLULAS O TEJIDO SUFICIENTE PARA QUE NO
FALLE NUESTRA OBSERVACIÓN
– SI VAMOS A CONTAR CELULAS EVITAR AGREGADOS
– PERO POCAS CELULAS SON POCO REPRESENTATIVAS
• MONTAJE: CON MEDIO DE MONTAJE
• DURARÁ MÁS TIEMPO
• ETIQUETADO: SABER QUE ES LO QUE SE HA PUESTO EN EL
PORTAOBJETOS
• MUESTRAS DUPLICADAS: SI SE PUEDE
SABER EXACTAMENTE LO QUE
BUSCAMOS
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MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR
CONSIDERACIONES PREVIAS
• USAR CONTROLES
• CASOS DE EMISIONES DE FLUORESCENCIAS PRÓXIMAS EN EL
ESPECTRO
• COLOCALIZACIÓN
• USAR UN BUEN CUBRE
• PARA CONFOCAL 0,17 mm
• VER LA CALIDAD # 1,5
• NO LLENAR EL PORTA DE MUESTRAS
• EN EL BORDE PUEDE CHOCAR LA PLATINA CON EL OBJETIVO
• NO APOYAR BIEN EL PORTA, SE PUEDE LEVANTAR, INCLINARSE…
• NO PODER ENFOCAR BIEN
• VERIFICAR QUE TIENE ACEITE EL OBJETIVO, SI LO NECESITA
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CONSIDERACIONES PREVIAS
• SI SE VA A OBSERVAR CÉLULA VIVA
• PREPARACIÓN ANTICIPADA DE LA Tª Y CO2
• PREPARAR EL SISTEMA:
– AL MENOS 1 HORA PARA LA Tª
• VERIFICAR EL CO2
– EN LA PLACA: IDEALMENTE USAR MEDIO SIN ROJO FENOL,
» QUENCHING (DISMINUYE LA SEÑAL, AUMENTA EL FONDO)
– USAR UN POCILLO CON ROJO FENOL PARA CONTROLAR pH
• COMPROBAR QUE EL FLUOROCROMO AGUANTA LA LARGA
DURACIÓN DEL EXPERIMENTO
– Si se va a excitar 200 veces en 24 horas, excitarlo 200 veces en 16
min.
– Mas vale perder 16 min. que 24 horas de observación.
• ASEGURARSE QUE TODO FUNCIONA BIEN, NO SE TIRAN 24
HORAS.
• VERIFICAR QUE LA PLACA DEJA PASAR LA FLUORESCENCIA Y
EN SU CASO LOS LÁSERES.
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MICROSCOPIA OPTIMIZADA POR ORDENADOR
POSIBLES CAUSAS DE UNA MALA IMAGEN
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1. Verificar que la iluminación sea la correcta.
2. Verificar que las lentes del objetivo estén limpias.
3. Comprobar que entre el diafragma de campo y el de abertura, no haya
ningún filtro difusor.
4. El centrado del revólver portaobjetivos debe ser el correcto.
5. El portaobjetos y el cubreobjetos deben estar limpios. Comprobar que el
primero esté bien colocado, y que no haya dos cubreobjetos superpuestos.
6. Verificar la limpieza de todo el sistema óptico. Esto se puede efectuar
haciendo girar por separado los oculares que el microscopio posea,
comprobando si las pequeñas motas de suciedad se mueven Si es así, es
que hay que limpiar el ocular.
Luego, habrá que hacer girar el tubo ocular en su conjunto; éste no debe
ser desmontado nunca, pero sí se pueden limpiar cuidadosamente los
prismas soplando sobre las superficies accesibles. El objetivo puede
limpiarse desenroscándolo ligeramente y ayudándose de un pincel seco.
En la cámara de fotos: Si al girarla, las manchas no se mueven, las
partículas están en la cámara.
¡¡CUIDADO PUEDE SER PEOR EL REMEDIO QUE LA ENFERMEDAD!!
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POSIBLES CAUSAS DE UNA MALA IMAGEN
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7. Comprobar que el aceite de inmersión sea el suficiente, sin
burbujas ni impurezas, y que no sea fluorescente. Que no haya
miserias ni derroches.
Excesos ensucian y manchan objetivos, mesa, dedos, manos…
8. Asegurarse de que el objetivo está bien enroscado.
9. Verificar el grosor del cubreobjetos, portaobjetos y medio de
montaje, que es decisivo, sobre todo en medianos y grandes
aumentos. Es importante, igualmente,
NO COLOCAR DOS CUBREOBJETOS SUPERPUESTOS.
10. La montura del condensador debe estar bien centrada y la
frontal bien sujeta, en el caso de que sea abatible. Comprobar que
la cremallera esté bien apretada, para mantener la posición.
11. La intensidad lumínica no debe ser débil, ni excesiva.
No hay que regularla nunca con el diafragma del condensador.
12. Tener cuidado de no utilizar objetivos de contraste de fases para
observaciones de campo claro, sobre todo cuando trabajamos con
grandes aumentos.
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POSIBLES CAUSAS DE UNA MALA IMAGEN
• 13. Utilizar una combinación correcta entre el ocular y el objetivo,
pues puede ocurrir que el ocular sea demasiado potente.
• 14. Comprobar que la preparación esté bien hecha, comparándola
con una preparación test.
• 15. En contraste de fases, es común el error en el centrado del
anillo de iluminación.
• Aunque éste puede descentrarse debido a la geometría de las
estructuras.
• 16. En observaciones con fluorescencia, las fluorescencias
parásitas que se pueden descubrir pueden ser debidas a: el medio
de montaje, al aceite de inmersión, una óptica inadecuada, el uso
de un filtro incapaz de cortar los rayos de excitación.
• 17. Si el medio de montaje tiene un índice de refracción muy similar
al del objeto incoloro, éste no podrá verse, ni con contraste de
fases, ni con contraste interferencial.
• 18. Si se observa una neblina solamente en los bordes del campo,
se deberá a una mala corrección de esfericidad del campo por parte
del sistema óptico. Con objetivos caros es raro que ocurra.
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POSIBLES CAUSAS DE UNA MALA IMAGEN
• 19. En DIC, comprobar que efectivamente está el prisma de
corredera bien colocado. Con placas Petri de plástico, no se podrá
manifestar el rendimiento óptico normal debido a la característica de
polarización de la Placa Petri, con lo que se recomienda usar una
de vidrio.
• 20. Si se va a hacer colocalización no deben de estar interpuestos
ningún prisma en la trayectoria de la luz fluorescente, ya que los
primas producen la difracción la luz.
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AJUSTE KÓHLER
• NECESARIO PARA UN BUEN ALINEAMIENTO DE LA LUZ
AJUSTES PARA LUZ TRANSMITIDA-CAMPO CLARO SEGÚN KÓHLER
Para la representación más fiel posible de un objeto juegan un papel muy importante,
además de los llamados haces de luz directos, también los indirectos, es decir, los haces
de luz difractados y dispersados en los detalles del preparado.
• Según ABBE vale: Cuanto mayor es el factor de los haces de rayos indirectos (apertura),
tanto más fiel al objeto será la representación microscópica.
Para aprovechar el rendimiento óptico total del microscopio, en particular del objetivo, el
condensador, el diafragma de campo luminoso y el diafragma de apertura deberían estar
ajustados según el principio de iluminación de KÓHLER,
PROCEDIMIENTO
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El microscopio debe estar conectado, con la lámpara halógena encendida.
Regular la claridad de la imagen mediante el regulador de luz.
Poner un preparado con contrastes fuertes en la platina de desplazamientos en cruz.
Intercalar en caso dado la óptica frontal del condensador, se recomienda el objetivo
de menor aumento y llevar el condensador mediante el mando para movimiento
vertical hasta el tope superior. El tope tiene que estar ajustado de tal manera que el
preparado no sea levantado por el condensador.
Intercalar el objetivo 10x mediante el revólver portaobjetivos y enfocar el preparado
mediante el mando de enfoque.
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AJUSTE KOHLER
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Cerrar el diafragma de campo luminoso, hasta que se pueda ver (aunque poco
nítido) en el campo visual ,
Bajar el condensador mediante el mando para movimiento vertical hasta que el borde
del diafragma de campo luminoso aparezca con suficiente nitidez.
Centrar la imagen del diafragma de campo luminoso mediante los dos tornillos de
centrado situados en el portacondensador
Abrir después el diafragma de campo luminoso hasta que su borde justamente
desaparezca del campo visual .
Para ajustar el diafragma de apertura (contraste) sacar un ocular del portaoculares y
mirar a simple vista por el tubo- Ajustar el diafragma de apertura a unos .2/3 .,.4/5 del
diámetro de las pupilas de salida de los objetivos. En la mayoría de las aplicaciones,
este ajuste del diafragma. de apertura proporciona el mejor contraste con una
resolución casi completa, y por lo tanto representa el compromiso más favorable
para la vista humana.
Volver a insertar el ocular en el portaoculares
http://www.ipb.csic.es/servicios/Microscopia/ajustes-en-microscopios.html
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MALOS PROCEDIMIETOS
BREVEMENTE:
EVITARLOS, NO HACERLOS
Y SOBRE TODO
NO REPETIRLOS
Y AVERIGUAR PORQUE SALIÓ MAL
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BUENOS PROCEDIMIETOS
• UTILIZAR CONTROLES
– PROCEDIMIENTO
• USAR EL QUE TIENE SEÑAL Y AJUSTAR
• PONER EL CONTROL:
– SI DA SEÑAL BAJARLO HASTA QUE DESAPAREZCA
– SI NO DA SEÑAL DEJARLO YA ESTÁ HECHO
• SI DIO SEÑAL EL CONTROL
– DESPUÉS DE AJUSTAR HASTA QUE DESAPAREZCA
– VOLVER A PONER LA MUESTRA PROBLEMA Y AJUSTAR
• SI NO SE HACE : PENSAR SI LO QUE HACEMOS,
LO ESTAMOS HACIENDO BIEN
¿ES UN BUEN PROCEDIMIENTO?
• VALORACIÓN O TITULACIÓN DE LAS CONCENTRACIONES DE
LOS FLUOROCROMOS
– FACILITA UN AJUSTE ADECUADO DE NUESTRO CONTROL
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CAPTURA DE IMAGEN
• USAR EL BOTONCITO DEL SOFTWARE QUE NOS
REFERENCIA EL NO SATURAR LAS IMÁGENES.
– CAPTURA DE IMAGEN UTILIZANDO
EL MÁXIMO RANGO DE NIVELES DE GRISES
– SI SE SATURAN LAS IMÁGENES Y QUEREMOS
CUANTIFICAR INTENSIDAD, NO PODRÁN VALORARSE
– COMPROBAR EN EL RECORRIDO DE Z QUE NO EXISTE
SATURACIÓN
– SI NO SE COMPRUEBA ES COMO “VOY A TENER SUERTE DE
GOOGLE”
– FOTOGRAFÍA OSCURA: SE PODRÁ REALZAR
– FOTOGRAFÍA SATURADA…………
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CAPTURA DE IMAGEN
• DEFINICIONES:
BINNING:
El proceso de combinar la carga de varios pixeles
adyacentes para crear “superpixeles” antes de la lectura.
El Binning incrementa la velocidad de refresco y la
proporción de señal-ruido de la cámara a cambio de una
reducción en la resolución espacial. Es fundamental
para enfocar “en vivo” en condiciones de baja
luminosidad
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CAPTURA DE IMAGEN
• BLOOMING/SATURACIÓN
La saturación se relaciona con la intensidad máxima de luz con la que
un píxel puede enfrentarse. Si un píxel es pensado como un pocillo
de fotoelectrones, la saturación ocurre cuando el pocillo está lleno.
El Blooming ocurre cuando el pocillo comienza a desbordar y cobrar
(cargar) extensiones en pixeles vecinos, causándolos saturación. El
desbordamiento se resalta como una raya blanca o la gota
alrededor de un punto brillante sobre la imagen.
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CONSEJOS
• NECESARIO UN BUEN ALINEAMIENTO DE LA LUZ
• SI TENEMOS LUZ PARÁSITA:
– FOTOGRAFÍA EN BLANCO, SIN MUESTRA, PARA ELIMINAR
LOS RUIDOS.
• UTILIZAR EL SOFTWARE PARA REFERENCIAR LA
NO SATURACIÓN DE LAS IMÁGENES
• A LA HORA DE HACER Z-STACKS: SABER
DETERMINAR LA DISTANCIA IDEAL PARA EVITAR
DESENGAÑOS
• PÍXELES ALARGADOS, VESÍCULAS CORTADAS…
• NO SE OBTIENEN CUANTIFICACIONES ADECUADAS
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CONSEJOS
• SI EL FLUOROCROMO SE QUEMA CON FACILIDAD
– PLANTEARSE SI HACER LA IMAGEN CON MENOR
RESOLUCIÓN
– HACER PRIMERO TODO EL STACKS DEL FLUOROCROMO
QUE ANTES SE QUEMA
– NO PERDER EL TIEMPO BUSCANDO CÉLULAS CON LA
FLUORESCENCIA SIN OBTENER IMÁGENES
– BAJAR LA POTENCIA DEL LASER SI ES NECESARIO Y
TENER UN POCO DE RUIDO AUNQUE HAYA QUE TRATARLO
LUEGO DESPUÉS
– PLANTEARSE SI EXISTE OTRO PARECIDO O SUSTITUIBLE
– USAR PROTECTORES DE FLUORESCENCIA
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SI TENÉIS ALGUNA DUDA
PREGUNTARME
MUCHAS GRACIAS
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