Download Sondas de DNA genómico

Nombrado así por Edward M. Southern
quién desarrolló este procedimiento en la
Universidad Edinburgh (1975).
Técnica que se utiliza para identificar y
localizar secuencias específicas de ADN
mediante el uso de electroforesis en gel y
de hibridación utilizando sondas. Para el
desarrollo de esta técnica se emplean dos
herramientas: Las endonucleasas de restricción y las sondas o
rastreadores moleculares.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
Las endonucleasas son enzimas que van a hidrolizar los
enlaces fosfofiestrer de los ácidos nucleicos. Las endonucleadas
de restricción tienen la función de limitar la entrada de DNA
extraño mediante el corte o escisión de unas secuencias
identificadas específicas del DNA, llamadas secuencias de
restricción o de identificación. Las endonucleasas de restricción
tienen tres tipos:
•
TIPO I: Catalizan la metilación del DNA y la ruptura del
DNA no metilada.
•
TIPO II: Sólo posee actividad nucleolótica.
•
TIPO III: Mutilan y rompen.
CORTES
 EXTREMO COHESIVO
 EXTREMO ROMO
FRAGMENTACIÓN DEL ADN POR ACCIÓN DE
ENDONUCLEASAS
SONDAS O RASTREADORES MOLECULARES
Las sondas son fragmentos de DNA de localización
cromosómica conocida. Se obtienen de tres fuentes:
Sondas de DNA genómico se extraen de preparaciones
cromosómicas
Sondas de DNA complementario (cDNA), se sintetizan a
partir del rnRNA del gen de interés o en estudio;
Sondas oligoaleloespecificas (sondas OAE) que rastrean
directamente a los alelos mutados, se sintetizan
químicamente.
DESARROLLO DE LA TECNICA
PASO 1
Se realiza la separación del
ADN de alto peso molecular
en pequeños fragmentos,
mediante la acción de una
enzima
de
restricción
(endonucleasas), que es
específica para cada tipo de
fragmento.
PASO 2:
Tras la acción de la enzima de
restricción los fragmentos se
separan de acuerdo a su tamaño
molecular mediante un proceso
de electroforesis en gel de
agarosa y tinción con bromuro
de etidio.
En la electroforesis las
moléculas de ADN, que están
cargadas negativamente, se
dirigen hacia el electrodo
positivo, sin embargo, su
velocidad de migración es
interrumpida por el el gel de
agarosa.
De manera que las moléculas de menor peso se viene más deprisa que las de
mayor peso. En consecuencia, se produce la separación de los fragmentos del
ADN de acuerdo a su tamaño (los fragmentos más pequeños avanzan más
distancia con respecto al punto de aplicación de la muestra).
ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
PASO 3
Los fragmentos generados son
transferidos a la membrana que
sirve de soporte (gel de agarosa).
Este proceso se lleva a cabo
colocando el gel de agarosa sobre
papel filtro previamente remojado
en una solución llamada de
transferencia (solución salina
concentrada). A continuación se
sitúa la membrana sobre el gel y
encima de esta una pila de papel
filtro seca, y por capilaridad la
solución de transferencia es
atraida a la pila de papel filtro,
arrastrando consigo al ADN hacia
la membrana donde queda
inmovilizado
conservando
la
misma posición relativa que
ocupaba en el gel.
PASO 4.
Posteriormente se realiza la
hibridación bajo condiciones de
temperatura y concentración de
sales que la favorezcan. En esta
etapa se incuba la membrana con
la solución que contiene a la
sonda marcada y previamente
desnaturalizada, para que ésta se
una, por complementariedad de
bases nitrogenadas, a uno o varios
de los fragmentos de restricción
que contienen el gen detectable
por la sonda.
Luego de la hibridación, se lava la
membrana para eliminar el exceso
de sonda que no hibridó.
PASO 5:
La localización de los fragmentos que
han
hibridado
se
realiza
por
autoradiografía. En esta técnica, la
membrana de nailon se coloca, una vez
lavada, junto a una película de rayos X
dentro de una caja que las aísle de la luz.
La película registra las posiciones donde
hay desintegración radiactiva, si la sonda
estaba marcada radiactivamente, o
mediante otras técnicas, si se han usado
sondas marcadas o compuestos no
radioactivos.
La interpretación se realiza mediante la
observación de las bandas, por
autoradiografia o colorimetría, que
indican la presencia de ácido nucleico en
la muestra que hibrida con la sonda
aplicada. La ausencia de bandas señala la
ausencia de secuencias complementarias
UTILIDAD
•Este procedimiento se utiliza para determinar desajustes de genes,
delecciones y, en casos particularmente favorables, cambios de
bases individuales.
•En un diagnostico prenatal; si se le conoce la lesión génica y si se
dispone de una sonda especifica, es posible el diagnóstico prenatal.
El ADN de células obtenidas de cantidades tan pequeñas como 10
ml. de liquido amniótico (o por una biopsia de vello coriónico) se
puede analizar por la técnica de SOUTHERN BLOT
•Se puede utilizar para determinar la herencia de determinados
genes. Las mutaciones en los centros de restricción producen
cambios en el tamaño de los fragmentos de restricción y, por lo
tanto, en la posición de las bandas en el análisis de la transferencia
SOUTHERN.
Esta técnica también se ha empleado para:
• El diagnóstico y caracterización de diversas inmunodeficiencias
• La distrofia muscular de Duchenne
• La hipoplasia adrenal congénita
• La deficiencia de glicerol-quinasa
• La distrofia miotónica severa
• Mutaciones de genes en células B de leucemia linfoblástica
crónica.
• Alta especificidad y reproducibilidad.
• Permitir la valoración del estado físico del ADN, y así
poder valorar si el ADN viral está integrado en el
genoma del huésped o permanece como episoma en
el huésped.
• Es un método excelente para detectar pérdidas
homocigóticas.
• Su utilización tiene algunos inconvenientes derivados de
su complejidad, costo y requerimientos de tiempo y
esfuerzo.
• No permite determinar en forma precisa secuencias
repetitivas de tamaño pequeño, lo que resulta
extremadamente importante cuando necesitamos
distinguir secuencias normales y premutadas.
• No es posible identificar delecciones o rearreglos pequeños
ubicados en la región que rodea la secuencia repetitiva.
• En ocasiones, el sitio de restricción específico de la enzima
(EcoRI), se muestra refractario a la digestión, lo cual genera
fragmentos adicionales que dan lugar al diagnóstico de
falsos positivos para la mutación completa en estos
pacientes.
Usos
en
criminología
medicina forense
la
o
Identificación
de
secuencias relacionadas
en
otras
especies:
Sonda→ cDNA del gen
NF2
de
ratón
(neurofibromatosis type
2) hibridizado en un
Southern blot contra
muestras
de
DNA
genómico de diferentes
especies.
El análisis de la "huella dactilar
de ADN" se basa en la técnica de
transferencia e hibridación de
Southern: La huella dactilar de
ADN, también conocida como
análisis del perfil de ADN, se basa
en el uso de la técnica
de transferencia e hibridación de
Southern para analizar regiones
polimórficas del ADN humano.
• Determinar desajustes de genes.
• Nos ha permitido identificar muchos de los
constituyentes estructurales de los ácidos nucleicos.
• Diagnóstico
y
caracterización
inmunodeficiencias.
de
diversas
• Para determinar la herencia de determinados genes.
• La técnica Southern blot también es utilizada para
diagnosticar lesiones génicas en los pre-natales
analizando muestras de liquido amniótico que es
extraído a través de sondas.
• Localiza una secuencia particular de la DNA dentro de una
mezcla compleja.
• Enfermedades genéticas como ANEMIA FALCIFORME,
LAFIBOSISQUISTICA Y LA COREA DE HUNTINGTON pueden
ser detectadas por el análisis del polimorfismo de
longitud de los segmentos de restricción.
Tamizaje clínico y análisis de mutaciones en el gen
FMR1 en 99 varones con características clínicas del
síndrome de X-frágil
Rev Chil Pediatr 77 (1); 34-42, 2006
Figura 1. Autorradiografía de Southern blot e hibridación con la sonda StB 12,3 marcada con ?32P [dCTP].
1A) Carril 1: Mujer normal. Carriles 2, 3 y 4: Probando hombre con mutación completa.
1B) Carril 1: Mujer normal. Carril 2: Probando con mutación completa y premutación (mosaico).
1C) Carril 1: Probando con mutación completa y metilación parcial. Carril 2: Mujer normal.