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CAPÍTULO
16
Técnicas de hibridación
Miriam Ruth Bueno Topete • Alejandra Natalí Vega Magaña
Introducción
Al revelar los numerosos métodos mediante los cuales
las células procesan, añaden, eliminan y transfieren in­
formación genética, los biólogos moleculares abrieron
el camino para el desarrollo de sus propias manipula­
ciones genéticas. En los últimos años se han desarro­
llado técnicas que han permitido abordar el análisis y
la manipulación del ácido desoxirribonucleico (DNA,
deoxyribonucleic acid) de una forma antes inimagina­
da. La tecnología del DNA recombinante ha hecho po­
sible investigar más a fondo la estructura y la función
de los genes, en especial de los genes eucarióticos,
inaccesibles por otros métodos. Cuando los investiga­
dores se enfrentaron por primera vez con el gran tamaño
y la complejidad del DNA, incluso el del virus más sim­
ple, la posibilidad de descifrar la información genética
codificada parecía estar más allá de toda esperanza.
Se hizo evidente que para estudiar un gen individual, se
le debía aislar del resto del genoma, ya que cada gen
representa una pequeña sección dentro de un cromoso­
ma; en ese contexto, no puede individualizarse. Para el
aislamiento de un gen o de fragmentos más pequeños,
el DNA debe fragmentarse. Si bien la rotura del DNA
puede realizarse de forma mecánica, por este medio
la fragmentación se produce al azar. La obtención de
fragmentos específicos de DNA fue posible mediante un
método desarrollado a partir de herramientas propias de
ciertos organismos procariotas, como lo son las enzimas
de restricción (véase capítulo 14). Para avanzar hacia un
estudio más detallado del DNA se necesitó una meto­
dología que permitiera obtener grandes cantidades de
fragmentos específicos de DNA. Estos fragmentos po­
dían ser DNA genómico, DNA complementario (cDNA)
o DNA obtenidos a partir de oligonucleótidos sintéticos.
A menudo, antes de que un determinado fragmento de
DNA o de RNA mensajero (mRNA) pueda manipularse
de cualquier modo, primero debe localizarse. Los cro­
mosomas, incluso los de las células eucarióticas más
simples, contienen una enorme cantidad de DNA, por
lo que localizar un segmento específico es como tratar
de encontrar la proverbial aguja en el pajar. Para locali­
zar fragmentos específicos se utilizan las técnicas de
hi­­bridación de ácidos nucleicos. Entre las técnicas de hi­
bridación más comunes se encuentran Southern blot,
Northern blot, Slot blot, Dot blot, hibridación in situ,
hibridación en solución y citometría de flujo. Antes de
abordar cada metodología es importante mencionar al­
gunos aspectos básicos que facilitarán el entendimiento
técnico de estas herramientas de la biología molecular,
como son la electroforesis de ácidos nucleicos y la defi­
nición de sondas.
Electroforesis de ácidos nucleicos
La electroforesis es una técnica analítica de separación de
macromoléculas. La separación tiene lugar debido a la diferente movilidad que presentan las macromoléculas cargadas
cuando se someten a la influencia de un campo eléctrico
como consecuencia de su relación carga/masa. Los ácidos
nucleicos son moléculas cargadas de manera negativa, debido a la presencia de grupos fosfato en su estructura. La
naturaleza del enlace fosfodiéster de las cadenas polinucleotídicas condiciona la carga de un ácido nucleico, que
es casi igual al número de grupos fosfato. La electroforesis
en geles de agarosa se lleva a cabo en aparatos apropiados,
cámaras por lo general horizontales, y requiere de dos elementos indispensables: la fase móvil y la fase estacionaria.
La primera es el medio amortiguado que permite la movilidad de las moléculas cargadas hacia los electrodos correspondientes cuando se genera un campo eléctrico. La fase
estacionaria, o soporte, es un polímero de naturaleza gelatinosa conocida como agarosa (originalmente obtenido de
algas, como el agar-agar, pero de composición más homogénea). Dependiendo de su concentración genera poros de
cierto tamaño a través de los cuales migran los fragmentos
de DNA o RNA. Por lo general, la concentración es de 0.5 a
2%. La agarosa posee la propiedad de permanecer líquida
a más de 50 °C y de formar un gel al enfriarse. Los fragmentos de ácidos nucleicos separados por electroforesis se
visualizan mediante su tinción con bromuro de etidio, un
colorante que se intercala entre las bases del DNA y que
emite fluorescencia cuando se irradia con luz ultravioleta
(véase capítulo 13).
Sondas
Las sondas son segmentos de DNA o RNA de cadena sencilla marcados con moléculas reporteras, como enzimas o
radioisótopos, que permiten su fácil detección. El diseño
de la sonda, es decir, su secuencia nucleotídica, es lo que
le permitirá, entre miles de fragmentos que forman parte
del genoma de un ser humano, identificar “un solo gen” o
“el fragmento de un gen”. Gran parte del éxito de este tipo
de estrategias moleculares depende de la especificidad de
la sonda. La longitud de las sondas puede ir de 15 a 30 bases, conocidas también como oligonucleótidos, hasta miles
de bases de nucleótidos. Pueden sintetizarse y purificarse
con relativa facilidad por instrumentos comerciales disponibles en la actualidad. En términos generales, las sondas
se obtienen a partir de síntesis química o de plásmidos, que
148
Metodología del DNA recombinante
se clonan con la sonda de interés. La especificidad de la
síntesis de la sonda dependerá del objetivo de estudio (por
ejemplo, el diagnóstico de mutaciones en enfermedades
genéticas o la identificación de un polimorfismo).
Southern blot
Fundamento
La técnica de Southern blot la desarrolló Edwin Southern
en 1975; es una estrategia estándar para analizar DNA previamente digerido con enzimas de restricción.
Esta técnica se utiliza para determinar la presencia de
un gen o fragmentos del DNA específicos en una mezcla
de ácidos nucleicos extraídos con anterioridad.
Se basa en la aplicación de dos procesos fundamentales: la desnaturalización o separación de las cadenas complementarias del DNA y la hibridación o unión de dos cadenas complementarias. Este fundamento es compartido
por todas las técnicas de hibridación.
Procedimiento técnico
En este procedimiento, primero se aísla el DNA de cualquier célula del organismo excepto de glóbulos rojos, ya que
carecen de núcleo. Para el análisis molecular de un paciente, el DNA puede obtenerse de linfocitos. Sin embargo, la
extracción puede hacerse también de otras fuentes: cultivos celulares, células de líquido amniótico, vellosidades
coriónicas o cualquier órgano biopsiado. Una vez extraído
el DNA, se digiere con enzimas de restricción (una o dos)
y los fragmentos se separan por electroforesis en geles de
agarosa, de acuerdo con su carga/masa. En algunas ocasiones se utilizan geles de acrilamida cuando los fragmentos
que se van a separar son muy pequeños. En este procedimiento electroforético, como ya se mencionó, las muestras
se someten a un campo eléctrico; como los fragmentos de
DNA tienen carga negativa se mueven hacia el electrodo
Buffer de
transferencia
positivo y los fragmentos más pequeños migran con más
rapidez.
Las moléculas de DNA separadas pueden visualizarse
mediante su tinción con bromuro de etidio u otro compuesto intercalante. En este momento el procedimiento
no es informativo, debido a que el fragmento de interés
se encuentra inmerso en millones de fragmentos creados
por las enzimas de restricción. Con posterioridad, el DNA
se desnaturaliza para obtener cadenas sencillas, mediante un proceso químico, generalmente por tratamiento con
álcalis. A continuación, los fragmentos se transfieren del
gel a un soporte sólido, como membranas de nitrocelulosa
o de nailon. Las membranas de nailon presentan algunas
ventajas; mayor capacidad de unión de ácidos nucleicos
(400 ug/cc2), mayor resistencia y vienen cargadas positivamente o con carga neutra. Existen diferentes métodos
para la transferencia, como la capilaridad, el vacío o la
electrotransferencia. Es importante señalar que la finalidad
de la transferencia es crear una réplica de lo que se tenía
en el gel, ahora en un soporte mucho más sólido, como es
una membrana (figura 16-1). Por último, para identificar
uno o más fragmentos entre millones, se utiliza una sonda específica marcada con alguna molécula reportera (por
ejemplo, “radiactividad”, 32P-dCTP). La sonda se pone en
contacto con la membrana y en aquellos lugares en donde
la sonda encuentre su secuencia complementaria se pegará, proceso conocido como hibridación. La sonda emitirá
radiactividad, la cual se detectará mediante un proceso de
revelado con placas de rayos X. La emisión de la sonda corresponderá únicamente al fragmento de interés. En la figura 16-2 se observa un esquema de cada uno de los pasos
involucrados en la técnica de Southern blot.
Marcaje de las sondas
Las sondas pueden marcarse radiactivamente (en general
con 32P) o enzimáticamente (biotina, digoxigenina, etc.). Una
(–)
60 volts
Papel filtro
Gel
Membrana
Transferencia
Papel filtro
(+)
Membrana con
ácidos nucleicos
Figura 16-1. Técnicas de hibridación
Corte con enzimas
de restricción
DNA genómico
Electroforesis
149
Fragmentos
separados
Fragmentos de DNA
Película
Papel absorbente
Membrana
Membrana
Autorradiografía
Detección de la secuencia
de interés
Gel
Amortiguador
Hibridación con la
sonda marcada
Figura 16-2. Esquema representativo de cada uno de los pasos involucrados en la técnica de Southern blot. Obtención del DNA
genómico y digestión con enzimas de restricción, electroforesis, transferencia, hibridación específica con una sonda y detección
de la secuencia de interés.
ventaja de los sistemas enzimáticos es que, una vez marcada
la sonda, su vida media es muy larga (meses), mientras que
el marcaje radiactivo es más corto (para 32P, de 15 días). Sin
embargo, la sensibilidad varía: las sondas radiactivas detectan hasta 0.1 pg de ácido nucleico y las enzimáticas, entre 1
y 10 pg. Las sondas pueden marcarse en un extremo o a lo
largo de toda la cadena. Para marcar en un extremo puede
utilizarse la enzima polinucleótido cinasa (que introduce un
único nucleótido marcado en el extremo 5′ de la sonda) o la
enzima transferasa terminal (que introduce varios nucleótidos marcados en el extremo 3′ de la sonda).
El marcaje en toda la sonda se realiza por el procedimiento de nick traslation (figura 16-3). En este método se
combinan dos actividades enzimáticas:
1. Actividad DNasa 1, que suprime un nucleótido al azar
de una de las dos cadenas de la sonda.
2. Actividad de DNA polimerasa, que, a partir del hueco
dejado en la cadena de DNA por la DNasa 1, va incorporando nuevos nucleótidos por complementariedad
(entre los que están marcados), tomando como molde
la otra cadena de DNA intacta.
Otro método para marcar sondas es el de random primers (secuencias cortas de oligonucleótidos, normalmente
hexámeros, que por su pequeño tamaño hibridan al azar a
lo largo de toda la cadena). Al añadir la enzima DNA polimerasa 1 desde el lugar donde se unen los primers, van
incorporándose nucleótidos en que algunos van marcados
radiactivamente hasta que finalmente se completa la cadena.
Aplicaciones
La técnica de Southern blot ha sido de gran utilidad para
identificar genes asociados con enfermedades de transmisión genética, e identificar mutaciones, como rearreglos,
deleciones y dosis génica en caso de portadores. La figura
16-4 representa el diagnóstico de anemia falciforme a través de Southern-blot.
También se utiliza para detectar polimorfismos en los
fragmentos de restricción de diversos genes y la presencia de DNA de ciertos microorganismos infectantes como
bacterias y virus.
Metodología del DNA recombinante
150
A
cundarias), la transferencia, la hibridación con una sonda
y el revelado.
G G T C C A T G C T
T
C C A G G T A C G A
Aplicaciones
Actividad DNasa
Es una herramienta muy útil para el estudio de los productos de la transcripción génica (mRNA) y de su regulación,
ya que se pueden estudiar las potenciales variaciones en la
abundancia de especies del RNA en diferentes condiciones
experimentales o comparar condiciones clínicas normales
o patológicas.
OH
A
T
G
T C C A T G C T
C*
C C A G G T A C G A
A
Actividad DNA pol
A G G* C C A T G C T
T
Dot/slot blot
G*
T
C C A G G T A C G A
OH
A G G* T
T
C A T G C T
C C A G G T A C G A
A G G* T C* C* A T G* C* T
T C
C A G
G
T A C G A
Figura 16-3. Marcaje de una sonda del DNA por nick translation. En el primer paso de la reacción, la enzima DNasa 1
produce una pequeña rotura (nick) en una de las cadenas del
DNA. A partir de ésta, la DNA polimerasa 1 añade nucléotidos
al extremo 3′ OH generados. Dicha enzima tiene, además,
actividad de exonucleasa 5′-3′, que libera nucleótidos del 5′
del nick. La eliminación de nucleótidos del extremo 5′
y la adición de nuevos nucleótidos al extremo 3′ provoca el
movimiento del nick a lo largo del DNA (nick translation). La
sustitución de uno o más de los nucleótidos que van a ser
incorporados de nuevo por nucléotidos marcados radiactivamente origina la formación de moléculas marcadas (sondas).
Northern blot
Diferencias con Southern blot
Ésta es la contraparte del Southern blot y como ácido nucleico se utiliza RNA en lugar de DNA. A diferencia del
Southern blot, con esta técnica no se utilizan enzimas de
restricción, ya que las moléculas de RNA son más pequeñas y para su análisis no requieren su fraccionamiento. Sin
embargo, prácticamente comparten todos los demás pasos,
como son la electroforesis, la desnaturalización (aunque el
RNA es de cadena sencilla, puede formar estructuras se-
Tras el aislamiento y separación de los ácidos nucleicos,
éstos se aplican directamente a la membrana sin separarlos, según su peso molecular; es decir, no se realiza electroforesis. La fijación se hace por lo general con vacío y en
un molde cuyo pocillo puede tener forma de punto (dot
blot) o ser lineal (slot blot) (figura 16-5). Es posible realizar detecciones no sólo cualitativas (positivo o negativo)
sino también cuantitativas, utilizando como patrón diluciones seriadas de concentraciones conocidas del genoma que
se está determinando. Son especialmente útiles cuando se
quieren detectar fragmentos obtenidos a partir de una clonación en que la cantidad de fragmentos en la mezcla es
pequeña y no representa mucha dificultad su localización.
Hibridación in situ
Este es un método histoquímico que emplea a la biología
molecular de la misma manera que la inmunohistoquímica
utiliza los métodos de la inmunología. Los principios de
ambos métodos son semejantes y el resultado final es el
mismo: la identificación de componentes tisulares en una
laminilla que pueden observarse al microscopio (figura
16-6). La especificidad de la inmunohistoquímica se basa
en la unión antígeno/anticuerpo, mientras que la especificidad de la hibridación in situ se basa en la unión de una
sonda con una secuencia complementaria de DNA o RNA
dentro de un tejido. A diferencia de Southern blot y Northern blot, la hibridación in situ no requiere de la extracción de ácidos nucleicos, sino que en el mismo tejido se
lleva a cabo el procedimiento de detección e hibridación;
de ahí el nombre de in situ (en el mismo lugar). Las sondas
que se utilizan para la hibridación in situ pueden ser radiactivas y no radiactivas. En la actualidad, las más utilizadas son las no radiactivas de las cuales existen variantes;
marcadas con fluorescencia, modalidad conocida como hibridación in situ acoplada a un sistema de fluorocromos
(FISH) (figura 16-7), diogoxigenina (DIG), biotina, fosfatasa alcalina o peroxidasa. Un aspecto relevante de este
tipo de sondas es que el detalle morfológico no se pierde, a
diferencia de lo que ocurre con las sondas radiactivas. Otra
modalidad de marcaje es con anticuerpos antihaptenos,
ofrece la ventaja de usar etiquetas fluorescentes diferentes
Técnicas de hibridación
151
Gel de electroforesis teñido
Membrana de hibridación
Normal portador afectado
Kb
20
9
6
4
2
1
Figura 16-4. Southern blot para el diagnóstico de anemia falciforme. El esquema de la izquierda representa el DNA digerido con
enzimas de restricción, separado por electroforesis y teñido con bromuro de etidio. Al extremo del gel, se observa un marcador de
peso molecular como referencia, expresado en kilobases (kb). El esquema de la derecha muestra el resultado de la hibridación,
en que se observan las bandas que se reconocen por la sonda. En este caso, el diagnóstico se dirigió hacia una hemoglobinopatía
(anemia falciforme), una enfermedad autosómica recesiva. Por el método de Southern blot se observa claramente la dotación
génica en caso de sujetos portadores y afectados por la enfermedad.
simultáneamente para la detección de secuencias distintas.
Esta estrategia es utilizada generalmente para la hibridación de cromosomas y de mRNA. Una nueva alternativa es
el marcaje de anticuerpos con moléculas de oro coloidal,
usadas para la detección por microscopia electrónica.
o revelado. En el caso de sondas radiactivas se realizará
autorradiograf ía. Se cubren las secciones con emulsión fotográfica y se exponen durante tres a siete días a –70°C. En
A) Dot blot
B) Slot blot
Aspectos técnicos
El primer paso para la hibridación es la preparación y fijación del tejido, en el cual deben conservarse los ácidos
nucleicos lo más íntegramente posibles, mantener la morfología del tejido y permitir una accesibilidad suficiente
para que la sonda penetre. La fijación con formalina, seguida de una inclusión con parafina es el procedimiento más
usado. Después de la fijación las secciones de tejido deben
adherirse al portaobjetos y no deben desprenderse durante
el procedimiento de hibridación. Para la adhesión, por lo
general se utiliza gelatina crómica o polilisina. Antes de la
hibridación, los tejidos se pretratan con HCl (que extrae
proteínas e hidroliza parcialmente las secuencias diana)
y proteinasa K (que incrementa la penetración y la accesibilidad de la sonda) y se someten a una posfijación con
paraformaldehído (incrementa la especificidad de la señal).
Se realizan diferentes lavados para remover las sondas
que no hibridaron y finalmente se procede a la detección
dots
slots
Figura 16-5. Esquema de la visualización del dot blot y slot
blot. El tipo de soporte que se utiliza durante el proceso de
fijación de los ácidos nucleicos en una membrana o filtro es
lo que determina la forma en que se visualiza esta técnica
molecular. A) Soporte que se utiliza para realizar un dot blot,
en que los orificios están en forma de puntos. B) Soporte
que se utiliza para realizar un slot blot, en que los orificios se
encuentran en forma de líneas.
152
Metodología del DNA recombinante
el caso del uso de sondas no radiactivas, las laminillas se
incubarán con un anticuerpo secundario dirigido contra la
sustancia con la que estaba marcada la sonda (p. ej., anticuerpo antidigoxigenina o antibiotina) siguiendo el protocolo según lo ya establecido en las técnicas inmunohistoquímicas (figura 16-8).
Muestra fijada en
portaobjetos
Desnaturalización
Aplicaciones
1. La hibridación in situ tiene un alto grado de resolu-
Hibridación
Sonda
DNA blanco
Visualización
Fluorocromo
ción, que permite la localización de secuencias génicas
a nivel cromosómico, con lo que se pueden detectar
translocaciones y otras alteraciones cromosómicas,
así como el estudio de expresión de genes (mRNA) a
nivel celular y subcelular. Las principales aplicaciones
son la identificación de infecciones virales en tejidos,
así como el mapeo cromosómico.
2. La translocación bacteriana es la migración de bacte-
rias o productos bacterianos desde el lumen intestinal
hacia el exterior. En pacientes con cirrosis hepática, es
un detonador importante de infecciones bacterianas,
lo cual contribuye a la mortalidad de estos pacientes.
La hibridación in situ con fluorescencia (FISH) es una
herramienta importante para la detección de este proceso; mediante una sonda dirigida a una secuencia
conservada de la subunidad ribosomal 16S de bacterias, permite la detección y localización de bacterias
en la mucosa intestinal. Para este proceso es fundamental la fijación rápida de pequeños fragmentos de
colon con contenido fecal para preservar la mayoría
de bacterias adheridas a la mucosa (cuadro 16-1).
Figura 16-6. Laboratorio de Genética - INEN
Hibridación en solución: captura
de híbridos
HER-2/neu
CEP 17
Figura 16-7. Técnica de FISH. Identificación del gen
HER2/NEU en cáncer de mama por la técnica de FISH.
El gen HER2/NEU se encuentra localizado en el cromosoma
17q, y su amplificación está presente en 25 a 30% de las
neoplasias de mama; se relaciona estrechamente con
los estadios avanzados, metastásicos, que implican un
mal pronóstico. En la actualidad existe un tratamiento
con anticuerpos monoclonales humanizados dirigidos
específicamente contra el producto del gen HER2/NEU
que mejora el pronóstico y la sobrevida del paciente.
Este método utiliza sondas de RNA que tienen la capacidad de hibridar con el DNA viral en solución. Los híbridos
formados podrán detectarse por unión de anticuerpos específicos marcados con sustancias luminiscentes. Los modernos métodos comerciales, a diferencia de las versiones
anteriores que se consideraban como subóptimas, tienen
una adecuada relación entre sensibilidad y especificidad si
se establecen límites de señal lumínica adecuados (1 pg de
DNA; equivalentes a 100 000 copias del genoma viral). La
utilización de un cóctel de sondas de alto riesgo, que en
la última versión incluye 13 tipos (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51,
52, 56, 58, 59 y 68) y otro para el grupo de bajo riesgo que
incluye cinco tipos (6, 11, 42, 43 y 44), permite la detección
de cualquiera de estos tipos en dos únicas reacciones. Tiene como ventaja la posibilidad de semicuantificar la carga
viral, aunque esta cuantificación solamente indica número de copias virales y no puede corregirse en función del
número de células obtenidas en la toma. El inconveniente
principal es que no permite distinguir entre los diferentes
Técnicas de hibridación
153
a)
Símbolos
b)
Sonda
DNA
Fluorocromo
DIG
c)
DIG
Anticuerpo
HPR TSA
HPR
d)
TSA
Biotina
HPR TSA
DIG
Estretavidina
e)
f)
Figura 16-8. tipos virales ni la presencia de infecciones múltiples; varios
estudios refieren inespecifidades debidas a reacción cruzada entre las sondas de alto riesgo y ciertos tipos virales de
bajo riesgo que pueden superar 10% de los casos.
suspensión de partículas (por lo general células) alineadas
por un láser focalizado. La citometría es un proceso que
permite medir de manera simultánea distintas moléculas
en una sola célula.
Citometría de flujo acoplado a sondas
Aspectos técnicos
La citometría de flujo es una técnica de análisis multiparamétrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una
En el contexto de analizar el DNA mediante citometría
de flujo, es necesaria la utilización de sondas acopladas
Cuadro 16-1. Técnica
Detección
Sondas
Técnicas alternativas
Southern blot
DNA
Secuencias complementarias
(antisentido) de DNA o RNA
PCR, PCR en tiempo real, FISH
Northern blot
RNA
Secuencias complementarias de
DNA o RNA
RT-PCR, RT-PCR en tiempo real
154
Metodología del DNA recombinante
a fluorocromos o colorantes que se puedan intercalar en
el DNA. La unión sonda-DNA no es tan fuerte como la
unión antígeno-anticuerpo; como consecuencia, cambios en
la concentración de la sonda o la muestra pueden influir
en la intensidad de fluorescencia emitida. Una característica de las sondas de DNA es que son estequiométricas, lo
cual significa que el número de moléculas de sondas unidas
al DNA es equivalente al número de moléculas de DNA
presente en la solución. Dependiendo de las propiedades
de la sonda, ésta podrá requerir o no tratamientos para su
correcto funcionamiento, ya que si la sonda tiene características liposolubles puede penetrar directamente a la célula; de lo contrario será necesario realizar un proceso de
permeabilización celular.
Aplicaciones
Dentro de las aplicaciones de esta técnica se encuentra el
estudio de ploidías. La ploidía de una célula indica el número de cromosomas en dicha célula. Se pueden encontrar
variaciones dentro de una población individual debido a
mutaciones, ciertas enfermedades (incluyendo el cáncer) y
apoptosis. Otras aplicaciones, utilizadas en su mayoría en
el campo de investigación son la muerte celular, expresión
de genes reporteros, así como las etapas del ciclo celular.
b) Se extrae DNA, se digiere con enzimas de restric­
ción, los fragmentos generados son marcados con
radiactividad, se separan por electroforesis y se
transfieren a una membrana, donde hibridan con
una sonda marcada específica para un gen.
c) Se utilizan fragmentos de DNA cortados con enzi­
mas de restricción, que se separan por electrofo­
resis y se transfieren a una membrana, donde se
hibridan con una sonda marcada específica para
un gen.
3. ¿Cuál frase es correcta para describir la hibridación in
situ?
a) La técnica permite localizar un segmento concreto
de DNA en una posición determinada de un cromo­
soma eucariótico.
b) Si el marcaje es de tipo quimioluminiscente, la téc­
nica se denomina FISH.
c) Consiste en detectar determinados mRNA marcados
con fluorescencia, utilizando sondas de DNA marca­
das procedentes del cromosoma deseado.
4. La siguiente fotografía muestra la hibridación de una
sonda en el DNA digerido con enzimas de restricción
de los miembros de una familia con alteraciones en el
gen de distrofina. ¿Puede identificar cuáles individuos
presentan el gen alterado?
Ejercicios de integración
1. Consulte la secuencia del mRNA de NFkB número
(NM_001077494.1) del banco de genes (http://www.
ncbi.nlm.nih.gov). Según la información allí indicada,
responda lo siguiente:
¿En qué posición del mRNA se unen las siguientes
sondas?
a) 5′agctctgctggatcggcatggag3′
b) 5′acgcggacccgcgggcgtctaaaatt3′
¿En qué exón se localizan estas secuencias?
¿Cuál es la secuencia complementaria de cada sonda?
Según lo mencionado en este capítulo, ¿cuál técnica
de hibridación es la más adecuada para detectar el
mRNA?
2. ¿Cuál de los siguientes enunciados es verdadero para la
técnica Southern blot?
a) Se extrae RNA celular, separado por electroforesis
y transferido a una membrana, se hibrida con una
sonda marcada específica para un gen.
1
2
3
4
5
6
5. La siguiente fotografía muestra la hibridación de una
sonda en el mRNA del virus del papiloma humano
en pacientes con sospecha de presentar la infección.
¿Puede identificar cuáles individuos están infectados?
D
1
2
3
4
5