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SECTION
V
Cell Biology, 2e
Thomas D. Pollard
William C. Earnshaw
with Jennifer Lippincott-Schwartz
Chapter 16
RNA Processing
Illustrations by Graham Johnson
Dr. José A Cardé-Serrano
Biol 4018
Departamento de Ciencias Naturales
Universidad de Puerto Rico en Aguadilla
Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.
Objetivos
• Al finalizar el estudiante podrá:
– Visualizar las funciones del RNA.
– Diferenciar los procesos de transcripción entre la
célula eucariota y procariota.
– Explicar los procesos de “capping”, poliadenilización ,
“RNA splicing” y “RNA Editing”.
– Conocer la diferencia entre los arreglos genómicos
de los eucariotas unicelulares vs. Multicelulares.
– Diferenciar entre los diversos tipos de mecanismos
de “splicing” .
– Definir Exosoma.
Procesamiento de RNAs
• Funciones del RNA
– RNA mensajero
• Dirigir la síntesis de proteínas
– RNA transferencia
• Traer el amino ácido correcto a la cadena
polipeptídica, adaptador
– RNA ribosomal
• Forma parte del ribosoma
– Otras funciones
• Remoción de intrones –
• Procesar terminal 5’ del tRNA
• Modificar el rRNA
• Regular patrones de desarrollo
• Interferir expresión génica (RNAi)
Procariotas vs Eucariotas
Overview of RNA synthesis & degradation
Fig. 16-1
Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.
Procesamiento de RNAs
• Transcripción; transcripto primario
– RNA producido inicialmente no es el final
• RNA heterogéneo nuclear (hn RNA)
• Contiene secuencias intrónicas
• No está estabilizado, señalizado
• Proceso de maduración
– Adición del gorro en el terminal 5’
– Poliadenilización del terminal 3’
– “Pre-mRNA splicing”
Procesamiento de mRNA eucariotas- estabilidad el mRNA
07_12_capping.jpg
Capping-5-metil-guanosina
Poliadenilación- corte y poliAd…
Adición del gorro al terminal 5’
• Guanosina
– En un enlace 5’—5’ trifosfato
• Deja libre un grupo OH en el terminal 5’ ademas del 3’OH
– El residuo de guanosina, es metilado en el nitrógeno 7 de la
base nitrogenada
– El grupo OH del primer nucleótido, en la posición 2 del
carbono de la azúcar también es metilado
– En algunas ocasiones del carbono 2 de la azúcar del
segundo nucleótido también puede ser metilado.
5’ cap on mRNAs- 7metil-guanosina
Fig. 16-2
Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.
Adición del gorro al terminal 5’
• Funciones del proceso
– Define el terminal 5’ del mRNA.
– Transporte del mRNA del núcleo al citoplasma.
– Juega un rol en el comienzo del proceso de
traducción al unirse al “ enlongation initiation factor
4E” (eIF-4E).
– Estabiliza el mRNA.
– Protege de la degradación por exonucleasas.
Signals for pre-mRNA polyadenylation
Fig. 16-3
Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.
Poliadenilización del terminal 3’
• 50 a 200 nucleótidos de Adenina
• No está determinada en el genoma.
• Incluye la secuencia AAUAAA
– Induce a un complejo multiproteínico a cortar el
mRNA aproximadamente 25 nucleótidos después de
esta señal.
• Cada 10-20 nucleótidos interaccionan con
la proteína llamada “Poly A binding
protein”
Poliadenilización del terminal 3’
• Funciones
–
–
–
–
Induce la terminación del proceso de transcripción.
Facilita la remoción del intrón más cercano al terminal 3’.
Transporte del mRNA del núcleo al citoplasma.
En ocasiones, permite el producir dos mensajeros
distintos a partir de una misma transcripción. (terminación
diferencial)
– Proteje el mRNA de degradación.
– Ayuda en el comienzo del proceso de traducción en la
célula eucariota.
07_13_Eucar_v_bact.jpg
Organización de genes: procariotes vs eucariotes
Núcleo: cap y poliA = citoplasma cap y poli A pero…mas cortos..
General mRNA Anatomy
STOP
mRNA
AAAAAA
AUG
Adapted from Gonzalez Lab -UPR-Rio
“RNA splicing”
• Orígenes
– mRNA aislados del citoplasmas eran más cortos que
los mRNA aislados del núcleo.
• Citoplasma
– Contienen el gorro, la poliadenilización pero
solo contienen los exones del gen.
• Núcleo
– Contienen el gorro, la poliadenilización y
contienen los exones e intrones del gen.
– Descubierto en el 1977
“RNA splicing”
• Organización del genoma eucariótico
– Unicelulares
• Intrones cortos
• Menos de cuatro por gen en su mayoría.
• Algunos genes no poseen intrones
– Multicelulares
• Promedio de ocho intrones por gen.
• Algunos genes poseen hasta 50 intrones.
07_14_exons_introns.jpg
Intrones - mas largos
Exones - mas cortos
Dispersan exones
Separados por intrones
Transcritos no
traducidos
Transcritos y traducidos
Hasta 10000
“RNA splicing”
Gen
Alfa globin
Cadena Liviana de la Inmunoglobulina
Cadena Pesada de la Inmunoglobulina
Citocromo b del mitocondrio de la levadura
Ovomucoide
Ovaalbumina
Ovotransferina
Conalbumina
Colágeno alfa
Intrones
2
2
4
6
6
7
16
17
52
“RNA splicing”
• Mecanismo
– Señales que demarcan el comienzo y el final de un
intrón.
• Sitio donador
– Terminal 5’
– Dos nucleótidos que son conservados
– GU
• Sitio Aceptador
– Terminal 3’
– Dos nucleótidos que son conservados
– AG
07_15_end_intron.jpg
-Splicing: remoción de intrones, empalme de exones
-Intrones: todos se parecen en algo…
-Cortados en lariat
entre la “A” y el 5’
del intron
-Realizado por
moleculas de RNA
(snRNAs)
-snRNPs
Snurps
Spliceosome
Alternativo
“RNA splicing”
• Mecanismo (cont)
– Punto de ramificación
• Se encuentra en el medio del intrón
– En una secuencia conservada
– 30 nucleótidos antes del sitio aceptador
• Es un residuo altamente conservado: Adenina
– Transesterificación
• Ocurren dos reacciones de este tipo
– El enlace fosfodiéster es atacado por el oxígeno
del grupo hidroxilo.
– Un enlace fosfodiester se rompe, y a la vez otro
se forma por lo cual la energía es conservada.
07_16_RNA_chain .jpg
“RNA splicing”
• Ventajas del proceso
– Se desarrollo a partir de las ribozimas
– Favorece la formación de nuevos genes
• Nuevas funciones
– Inmunoglobulinas
– Permite que el proceso sea modificado para
adaptarse a los sistemas
• “splicing” alternativo
• Trans-splicing
“RNA splicing”
• “Spliceosome”
– Complejo de RNA y proteínas
– Similar a un ribosoma en tamaño
– Lleva a cabo las reacciones de “RNA splicing”.
– Posee cinco ribonucleoproteínas
• snRNPs
– U1,U2, U4,U5,U6
– Contiene proteínas accesorias
• hnRNP
– Empacan el hnRNA
• SR
– Ricas en serina y argenina
– Atraen otros factores de “splicing”
“RNA splicing:
Spliceosome”
- U1- aparea con 5’
- U2- aparea con branch
- U5- acerca los exones
- U4- libera a U6
- U6-aparea con U2
- U1- liberado
- U6-aparea con 5’
07_17_spliceosome.jpg
-Desperdicio?
-Fuente de cambio
-Uso eficiente de
espacio
“Alternative and Trans-Splicing”
• Alternativo
– Utiliza diferentes sitios donantes y receptores en el
intrón.
• De un solo gen se producen varios mRNA.
• Ocurre en virus
• 30 – 75 % de los genes humanos
• Trans-Splicing
– Splicing entre dos moléculas distintas de hnRNA.
Alternative splicing of pre-mRNAs
Fig. 16-6
Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.
07_18_a_tropomyo.jpg
Empalme Alternativo - Alternative Splicing produce …
Editar el RNA
• Eventos post-transcripcionales
– Modificaciones a nucleótidos
• Deaminación
– C se convierta en U
» CAA (glutamato) – UAA (codón de
terminación)
– A se convierte a I
» Mecanismo de regulación.
» I se comporta como G
RNA editing changes nucleotide base pairing
Fig. 16-7
Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.
Editar el RNA
• Inserciones o deleciones
– Trypanosoma
– Añaden Uracilos en sitios específicos
• Crea codones de iniciación.
• Crea codones de terminación
• Corrige mutaciones de “frameshift”
• Crear nuevos productos génicos
– RNAs guiados
• Contienen regiones 5’ complementarias al lugar a
editar.
Editar el RNA
Degradación del RNA
• Degradación de RNA
– Acortamiento del rabo
de poliadeninas.
• Deadenilasa
– Remoción del gorro
5’.
– Acción de
exonucleasas en
ambos terminales, 3’
y 5’.
– ARE-AU Rich
elements
General mRNA Turnover
Mechanisms
mRNA
m7G
Dcp1
AAAAAA
AAAAAAAAAAAAAA
Dcp2
m7G
Dcp1
Dcp1
AUG
STOP
AAAAAAAAAAAAAA
Dcp2
Dcp2
m7G
Parn
AAAAAAAAAAAAAA Parn
Adapted from Gonzalez Lab -UPR-Rio Piedras
Vigilancia del RNA
• Nonsense mediated decay
– Un Codón de terminación en una posición prematura.
– Reconocido por los elementos del splicing
• Nonstop decay
– No poseen señal de stop
• Splicing incorrecto
miRNA maturation
and silencing of
transcription
without cleavage
of the target
mRNA
Fig. 16-11
Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.
Controles Post-transcripcionales: Riboswitches
Riboswitches – secuencias de RNA q cambian conformacion al
unirse a metabolitos y moleculas peq y asi regulan expresion
- tipicos de bacterias, responden a metabolitos y activan
genes segun se necesitan
- económicos por que no necesitan proteinas
Controles Post-transcripcionales:UTRs
- Una vez el mRNA existe un
punto de control importante es la
iniciacion de la traduccion
- Procariotas: tienen una RBS
upstream el AUG, donde la subU
pequena se aparea y acomoda el
AUG para iniciar
- Bloquear esta region con
Represores es una forma de
control
- Eucariotas: tienen el Cap en el 5’
que guia al ribosoma hasta el
primer AUG. Represores se
asocian al 5’UTR bloqueando el
paso del ribosoma hacia el AUG
Controles Post-transcripcionales:micro RNAs
-miRNA – tipo de RNA no codificante en plantas y animales
- humanos mas de 400 miRNAs
- regulan mas de 1/3 de los genes estructurales
- por complementaridad, regulan estabilidad y traducción
- precursor, procesado a miRNA
- asociado a proteinas forma RNA induced silencing complex
-RISC, se mueven por el citoplasma buscando sus mRNA
complementarios, se les pega en los UTRs y propicia su
degradacion
miRNAs:
pre-Drosha-Dicer-RISC
Controles Post-transcripcionales: RNAi
-RNAi – para destrucción de RNAs DS ajenos
- son las mismas que llevan miRNAs y sirven de sistema
inmmune
- RNAs DS? = viruses y retrotansposones
- Cuando estos DS RNA entran DICER los reconoce (nucleasa)
- DICER los degrada en fragmentos de 23 ncltds (siRNAs)
- estos se incorporan a RISC que degrada una de las strands
- RISC busca el mRNA con la otra cadena para degradarlo
- conservados desde hongos hasta invertebrados, plantas
Aplicacion:
- Biotech: usarlo para apagar genes y ver efectos y determinar
función
- Tx: usarlos para apagar genes defectuosos o fuera de control
siRNA
RNAi Therapy
¿Preguntas?