Download Introduction to Physiology: The Cell and General Physiology

SECTION
V
Cell Biology, 2e
Thomas D. Pollard
William C. Earnshaw
with Jennifer Lippincott-Schwartz
Chapter 15
Gene Expression
Illustrations by Graham Johnson
Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.
Book section V: Central dogma - from gene to protein
Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.
Chapters on the central dogma - from gene to protein
Chapter 15
Gene expression
Chapter 16
Eukaryotic RNA processing
Chapter 17
Protein synthesis & folding
Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.
Objetivos
• Al finalizar el estudiante podrá:
– Conocer las diversas fases de la expresión génica.
– Conocer los tipos de factores de transcripción y su rol
en la expresión génica.
– Entender la regulación de la expresión génica y las
moléculas envueltas.
– Entender la relación entre los factores de
transcripción y los procesos de transducción de
señales.
Importante como y cuando se prenden o se apagan y como se controlan?
Niveles de control: a grandes rasgos
Transcripcion,  traducción  Degradación de Proteinas
-transcripcion y los puntos de regulación transcripcional
Factores de transcripción – proteínas que activan o desactivan genes al
pegarse a secuencias especificas cercanas a las regiones codificantes
Paradigma – operon de lactosa en E coli (procariotes)
Eucariotes – 6% de los genes son factores de transcripcion
Activan a las polimerasas de RNA (I, II, III) que son RPDD
Regulación de estos factores es otra forma de controlar genes
Síntesis de estos factores
Transporte desde el citoplasma
Modificaciones post traduccionales
The transcription cycle
Fig. 15-1
Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.
Tipos de RNA producidos en células
Tipo de RNA
Función
mRNA
Codifica para proteínas
rRNA
Ribosomas y síntesis de proteínas
tRNA
Adaptadores entre mRNA y aa en
síntesis de proteína
miRNA
Regulación de expresión genética
smaRNAs
Splicing, telómeros, etc
Ciclo de Transcripción
• Síntesis de RNA mensajero
– Iniciación
• RNA polimerasa localiza y se une al cromosoma.
– Complejo pre-iniciador
– Complejo abierto
– Extensión
• Razón de 20 a 30 nucleotidos/segundo
– Terminación
• RNA polimerasa se disocia del DNA
Transcription units
in prokaryotes &
eukaryotes
Fig. 15-2
Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.
Ribosomal RNA transcription unit
Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.
Fig. 15-3
Regiones Promotoras
• Región del DNA que regula la expresión del gen.
• Clasificación
– De acuerdo a su función
• Promotores fuertes
– Producto es abundante
• Promotores débilies
– Producto es raro o no abundante
• El nivel de expresión varia de célula a célula, depende de:
– las secuencias reguladoras
– Concentración de los factores de transcripción.
Regiones Promotoras
• Promotor de la Pol I (rRNA)
– Región que precede a los codones del gen.
– 100 pares de bases antes del codón inicial.
– “core region” sobrelapa el codón inicial del gen.
• Promotor de la Pol II (mRNA y snRNA)
– Región que precede a los codones del gen.
– Posee secuencias conservadas
• TATA Box
– TATAAAA
– 30 pb al frente de la secuencia iniciadora
(TAC)
– Equivale al “Pribnow box” de los procariotas
• Región Iniciadora (menos conservada)
Regiones Promotoras
• Promotor de la Pol III
– Dos tipos
• tRNA
– A Box
– B Box
– 15 pb a partir del terminal 5’, 3’
• 5S rRNA
– C Box
– Centro de la región codificadora
Promoters in prokaryotes & eukaryotes
Fig. 15-5
Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.
07_09_1_bacterial gene.jpg
Señales: Start/Stop
Promotores (conserv)
Punto principal de
control
07_09_2_bacterial
gene.jpgespecificos son reconocidos por
Promotores y terminadores
la RNA pol
Prokaryotic RNA polymerase
Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.
Fig. 15-6
07_10_transcr_DNA.jpg
-genes : en cualquier dirección pues hay DS
-Promotor asimétrico; -10 y -35
-Dirección 5‘  3’
Que asegura que una porción de DNA X sera transcrita?
Transcripción Eucariotes: Iniciación
- Mas complejo el proceso que en procariotes.
- Difiere en :
- 3 polimerasas: RNApol I, II, III vs 1 polimerasa de RNA
- un factor de iniciacion (Sigma) vs muchos factores
- Genes a transcribirse no están cerca uno de otros,
facilita el control individualizado por otras secuencias
- Presencia de nucleosoma, hay que desenredarlo
Factores de Transcripción
Factor
• Generales
– GTFs
– Altamente
conservados
– TATA Box –Binding
Protein
• TFIID
– Tabla 15-1 Asignada
• Página 259
Orden/Función
No.
subuni
dades
Peso
Molecular de
Subunidades
TFIIA
3
12,19,35
TFIIB
1
25
TFIID
12
15-250
TBP
1
38
TFIIE
2
34,57
Recluta TFIIH (7)
TFIIF
2
30,74
Une Pol II y TFIIB (6)
TFIIH
9
35-98
Desenrrolla el DNA del promotor
(8)
Pol II
12
10-220
Cataliza la síntesis de RNA (5)
TOTAL
42
~1,000
Estabiliza unión de TBP y TATA
(3)
Selecciona sitio de iniciación
Recluta la polimerasa II (4)
Interacciona con factores de (2)
regulación
Reconoce el “TATA Box” (1)
Factores de RNA Pol II - Iniciación
• Formación del complejo preiniciador
– TFIID (TBP + TAFs)
• Se unen al “TATA Box”
– TFIIA
• Estabiliza el complejo TFIID-TATA Box
• Evita la unión de represores
– TFIIB
• Se une al TBP y DNA al frente y después del “TATA
box”
– Determina el tamaño o distancia entre el “TATA
box” y la secuencia iniciadora.
Factores de RNA Pol II
• RNA polimerasa II - TFIIF
– Estabiliza la interacción de la RNA Polimerasa II con
el TFIIB y TBP
– El TFIIF previene que la RNA Polimerasa II se una a
lugares no promotores
• TFIIE y TFIIH
– Estabiliza el complejo proteína y DNA
– E es estimulador de H
– TFIIH
• Helicasa 5’- 3’ y 3’ - 5’
• Adenosina trifosfatasa dependiente de DNA
• Actividad de cinasa
• Reparar el DNA
– Mutado en Xeroderma pigmentosa
RNA polymerase II preinitiation complex
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Fig. 15-7
Transcription is
carried out by a
large RNA
polymerase II
holoenzyme
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Fig. 15-8
07_07_RNApolymer.jpg
RNA Polimerasa
•
•
•
•
•
•
Cataliza enlaces fosfodiester
Desenreda la hélice
5’> 3’
rNTP
Transcripto 1rio se libera inmediatamente
Varias copias del mismo gen en poco tiempo
Tres sistemas de transcripción
Tres Polimerasas de RNA en Ecuariotas
Tipo de
Polimerasa
Genes transcritos
RNA Pol I
Mayoría de los genes para rRNA
RNA Pol II
Genes estructurales codificantes, miRNA,
spliceosoma
RNA pol III
tRNA
5s rRNA
Otros smRNAs, pequeños
Transcripción - Extensión
Comienza con el proceso de extensión
Asociado a “promoter clearence”
Cambios estructurales en la RNA polimerasa
Regulado por factores de extensión
Reacción general
– (NMP)n + NTP  (NMP)n+1 + PPi
• Complejo de extensión un balance entre estabilidad y
flexibilidad
•
•
•
•
•
Events during transcription elongation
Fig. 15-11
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Transcripción - Terminación
• Mediada por factores de terminación
– Interaccionan con la RNA polimerasa
– Luego de cada adicion; la pol tiene cuatro opciones
• Extender • Pausar
• Reversa
• Terminar
Transcripción – Terminación – Eucariotas
Desestabilizar el hibrido DNA/RNA
• Polimerasa I
– Proteína que interaccionan con secuencia
downstream
• Polimerasa II
– Multiproteínas que reconocen el poly A
• Polimerasa III
– No requiere factores proteicos
– Transcribir 5 0 6 U
Mechanisms of transcription termination Prokaryotic
Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.
Fig. 15-12
Regulation of the lac operon in E. coli
Fig. 15-13
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Operon de Triptofano
Ejemplo clásico de control y regulación de expresión en base a la
necesidad de alimentos (cambios en ambiente)
08_06_single.promot.jpg
-5 genes para 5 proteinas en un mRNA (policistrónico)
-transcripción y traducción simultánea
-No triptófano – operón se enciende
-Si triptófano – operón se apaga
Operon de Triptófano - Como opera?
- Operador:
- Represor alostérico
- Triptófano?
08_07_repress.protein.jpg
Represores vs Activadores
08_08_activator.prot.jpg
Represor activo: reprime genes
- Se pega al promotor
Activador activo: activa genes
-Se pegan a la pol y la estimulan
-Ambas son alostéricas
Ej: CAP – activador
- Dependiente de cAMP
-[cAMP ] aumenta cuando no hay
glucosa, para que se metabolicen
otra azucares
Operón de Lactosa
- Un activador y un represor controlan el operon de Lactosa
- Un promotor controlado por dos reguladores de transcripción:
- Lac operon controlado por;
- lac represor y CAP activador
- Codifica proteinas para importar y metabolizar lactosa
- En ausencia de glucosa:
- cAMP aumenta y se ativan los genes regulados por CAP
- CAP prende los genes para lactosa , pero si esta lactosa presente;
sino para q los necesita seria perder esfuerzo
- Lac represor los apaga cuando no hay lactosa
- El operon es expresado cuando se dan dos condiciones:
- Lactosa presente y glucosa ausente
- Si no estan LAS DOS, no opera
08_09_lac operon.jpg
Regulación de Expresión: Factores de Transcripción
• Sistema de regulación de genes
– Procariotas
• Señales del ambiente
– Temperatura
– Concentración de
nutrientes
– Eucariotas
• Regulación genética
– Factores de
transcripción
» 6% genoma
humano
Regulación de Expresión: Elementos de regulación
• Promotores
proximales
– Proteínas
reguladoras
– TATA box
• RNA Pol II
– CCAAT box
• Herpes Virus
– GGGCGG
• “house keeping
genes”
Assay for RNA polymerase II promoter regulatory elements
-
Se muta
Se clona
Se transforma
Se mide
expresión
- Ejemplos
- CCAAT –
Timidine
Kinase,
Herpes
- GCGCG –SP1,
Houskeeping
Fig. 15-14
Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.
RNA polymerase II promoter regulatory elements
Combinatorial Control
Transcription factor binding sites
Región Upstream 5’ para metalotioneina
Varios TF binding sites
Glucocorticoid Receptor
Metal Reponse Elements
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Fig. 15-14
Regulacion de Expresión : Enhancers
Que son?
• Responden a estrés (estímulos) celular
• Aumenta la razón (velocidad) de iniciación del promotor.
• Funcionan independientes de localización y distancia)
– Al principio 5’
– En el medio
– Al final 3’
• Funcionan en cualquier orientación con relación al
promotor
• No se encuentran asociados a todos los genes.
• Son células (tejido) específicos
• Responsable de un efecto sinergístico
• Modulares
Regulación en Eucariotas
- Reguladores de transcripcion controlan la expresion a la distancia
- Usan activadores y represores pero estos se unen a regiones
conocidas como enhancers… aumentaban la expresion
dramaticametne
- Lo hacen a miles de bp y tanto upstream como dowstream COMO
- El modelo sugiere un loop del DNA trayendo cerca del promotor y del
complejo de iniciacion la region donde esta el regulador
- Activadores y mediadores facilitan el ensamblaje del complejo de
iniciacion o lo sabotean
- Tambien atraen proteinas que modulan estructura de la cromatina
afectando la accesibilidad de promotor a los factores y la poimerasa
Enhancer elements provide a further level of gene regulation
Fig. 15-15
Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.
08_13_gene.activation.jpg
Assays for proteins that bind specific DNA sequences
+ Prot. nucleares
- Prot. nucleares
Fig. 15-16
Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.
Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
assay for protein
binding sites on DNA
- Extraccion cromatina + proteinas
- Crosslink con formaldehido
- Digestion al azar
- Inmunoprecipitacion
- Disociacion de DNA/proteínas
-PCR + microarray para las
secuencias
-Identifica genes o secuencias
presentes junto a nucleosoma
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Fig. 15-16
Transcription factors consist of modules
Como son las TFs?
-Modulares
-Dominios
separables
-Caracterización por
combinación
-El dominio activador
de 2 podra activar a
1?
-Como se haria el
experimento?
Fig. 15-19
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Transcription factors
recruit enzymes that
modify chromatin
Como activan?
Complejo de remodelación
de la cromatina
Acetilación
Metilación
Fosforilación
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Fig. 15-20
Promotores en
nucleosomas, como los
liberamos?
08_14_chromatin.struc.jpg
-acetilaciones de lisinas
-deacetilaciones
-remodelacion
Control Combinatorial en Eucariotes
- Permite la integración de multiples señales reguladoras
en genes individuales
- Procariotes – operon lac es controlado por lactosa y
glucosa
- Glucosa ausente, lactosa presente
- Eucariotas
- Elementos que se unen al DNA en diferentes regiones
- Sinergismo
- Enhancers
- Interacciones entre factores
- Interacciones entre factores y cromatina
- Complejos de remodelación de la cromatina
Regulation of transcription factor activity
Fig. 15-21
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Transcripciónal:
-Principal punto de control
-Es el principal intermediario
-Genes on/off
-Proteinas que se pegan a
08_04_gene.reg.prot.jpg
secuencias
reguladoras otras q
no son el promotor
-Zurco mayor
Factores de Transcripción
• Clasificación
– Modo de interacción, arreglo molecular
• Helix –turn-helix
• Homeodominios
• Zinc fingers
• Helix-loop-helix
• Leucine zippers
• Asignado tabla 15 – 2 Enfermedades por factores
de transcripcion P 270
Homeodominios
08_05_binding motifs.jpg
Zinc fingers
Leucine Zipper
DNA recognition structures of some transcription factors
Fig. 15-17
Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.
Homeodominios
NNTAATGGNN
Helix turn Helix
Zinc Fingers y Leucine Zipper
University of Puerto Rico
Intercampus Doctoral Program in Biology
E2- Mechanism of Action
From Geneka Biotechnology
http://www.biolynx.ca/active.html