Download Expresión Diferencial del Genoma en el Desarrollo

Biol 3019
Biología del Desarrollo
Universidad de Puerto
Rico-Aguadilla
JA Cardé, PhD
Expresión Diferencial del
Genoma en el
Desarrollo - II
Objetivos
 Repasar los conceptos de equivalencia genómica
y de expresión diferencial del genoma.
 Repasar la anatomía de un gen y del mRNA
 Promotores, enhancers,
 TF y silencers
 Explicar los mecanismos de transcripción diferencial
 Discutir el procesamiento diferencial del mRNA
 Resumir los mecanismos de controlde expresión
genética: transcripcional, traduccional, postraduccional; y sus implicaciones en el desarrollo.
Mecanismos de Transcripción
diferencial
 TF: Ya se sabe quienes son, pero
no se sabía su rol?
 ChIP-Seq Technique:
 Aislar y crosslink la cromatina
 Cortar el DNA
(sonicación/enzimas)
 Incubar con AB vs la proteína
de interés
 Precipitar complejo AB-ProtDNA
 Separar el DNA, PCR y
secuenciar
Mecanismos de Transcripción
diferencial
 ChIP-Seq, identifica dos tipos de promotores
 High CpG content promoters
 Default ON, DNA no metilado  activo; para inactivarlo
metilar las histonas
 En genes de control del desarrollo temprano
 Regulan la síntesis de TF y otras proteínas reguladoras
 Low CpG content promotors
 proteínas características de etapas tardías, células
maduras
 Defaults OFF: DNA metilado  inactivo, hay que
demetilar y esto permite modificar las histonas y la
RNA pol II entra.
Ejs: estados de cromatina en
promotores
 HCP vs LCP -
 Activos, Bivalente, Inactivo
 DNA. Histonas, Otros
Transcripción diferencial: mecanismos
Metilación del DNA: ON/OFF switch
 Histonas metiladas … y el DNA?
 En las citosinas del promotor
 5 Metil-Cit (5ta base) estabiliza nucleosomas y previene
transcripción
 Presente en 5% de las C (siempre seguidas por G) luego
de la replicación
 Regulación transcripcional en vertebrados
 Metilación del DNA, promotores
 Bloquea la unión de TF a enhancers con C metilada
 Facilita reclutamiento de metilasas y deacetilasas,
estabilizando el nuclesoma para evitar transcripción
(MeCP2)
Transcripción diferencial: mecanismos
Metilación del DNA: ON/OFF switch
Gen de Globina
-Promotor demetilado en
RBC vs otras células
-Developmentally Regulated
Genes
Transcripción diferencial: mecanismos
Metilación del DNA: ON/OFF switch
Metilación: como bloquea la
transcripción?
- TF se pueden unirse
a enhancers no
metilados
- No pueden unirse a
enhancers metilados
Metilación: como
bloquea la transcripción?
- Reclutando proteínas que a su
vez alteran el nivel de
metilación o de acetilación
- EJ: MeCP2 – liga las Citosinas
metiladas
- Esta a su vez recluta
deacetilasas y
metiltransferasas
- Remueven acetilaciones
- Sustituyen por metilaciones
- Reclutan a H1
Metilación: Patrones heredables:
DNMT3DNMT1
DNA CpG
|
|
DNMT3
(de novo)
|
|
DNMT1
(forever)
3 estados de los promotores
 Activado – Reprimido – Intermedio
 Bivalente, estado Intermedio: permite una respuesta
rápida a señales de desarrollo
 Característico de promotores High CpG (HPC); genes de
control
 Escasamente metilados, RNA pol II y nRNAs presentes
incompletos, nucleosomas estado intermedio o
bivalente con:
 H3K4me3, activos
 H3K27me3, inactiva
 Paso limitante para HPC es alargamiento de los nRNAs
 Para los LPC, es iniciación
RNA Procesamiento Diferencial:
 Clave para diferenciación: síntesis de diferentes proteínas
en diferentes tipos de células
 Control en Procariota : transcripción, traducción y
postraducción
 Control en Eucariota: uno mas; procesamiento y
transporte
 Splicing isoforms: proteínas distintas del mismo gen:
familia
 En humanos 90% de los genes lo usan
 Genoma: 20,000 genes < Proteoma: 20,000 proteínas
Genes
Cells
Proteins
C elegans
20,000
959
~20000
H sapiens
20,000
100,000 bil
~100,000
Alternative Splicing Variants
Alternative Splicing Variants
Bcl-XS vs Bcl-XL:
- large Bcl = inhibe apoptosis
- short Bcl = induce apoptosis
en tumores cual predomina?
Spliceosome
Factores de
splicing
- Expresados
diferencialmente
-snRNA U1 y
SF2 en 5’
-U2AF en 3’
RNAProcesamiento Diferencial:
ER-Drosophila Dscam gene38,000 proteínas
Altenative Splicing: FGF
IIIb vs IIIc
- Ambos en
entre ex 7 y 10
- mesenq IIIC:
mesodermo
- epitelio IIIB
ectodermo
- Metilaciones
marcan
splicing
- H3K36me3
excluye el B
- PPTB
Splicing enhancers y recognition
factors
 Splicing enhancer (cis) sequences (SES)
 Cerca de sitios de splicing
 Promueven el ensamblaje del spliceosome
 Recognition factors (trans) proteins
 Reconocen las SES y reclutan el splicesoma
 Polypirimidine track binding - proteínas (PPT)
reprimen la formación del spliceosoma
Aplicación clínica
Mutaciones en splicing sites:
 Resultan en proteínas NO funcionales
 Distrofina: mutación en un “splicing site” causa que se
salte el exón
 Miostatin gene: mutación induce personas mas
“fuertes”
 Su proteína es un regulador negativo de división
celular muscular
 Hipertrofia muscular –
 si miostatina no está, el músculo se sigue dividiendo
hasta mas tarde: músculos mas grandes
Hipertrofia Muscular
Myostatin Knockout
Control: Nivel traduccional:
longevidad diferencial
 Longevidad diferencial del
mRNA : media vida del mRNA
 Mientras mas estable mas dura
y mas copias de la proteína
 Longitud del poli A, secuencias
en el 3’UTR para mayor
longevidad
 Estabilización de ciertos mRNA
en ciertos momentos en ciertas
células
 mRNA caseína : 1.1 hr en tejido
mamario vs 28.5 hrs en
lactancia (prolactina)
HuD – grupo de proteinas que
estabiliza dos grupos de RNAS
-Proteinas que detienen division
celular en neuronas
-Proteinas que inician
diferenciacion neuronal
Control: Nivel traduccional:
Inhibición selectiva de mRNAs
 Ovocito: fabrica y almacena los mRNAs que se
usarán solamente luego de fecundación.
 Se mantienen en estado durmiente hasta que
llegue la señal: cambo de polaridad / iones
(Ca2+)
 Ej de mRNAs en el huevo: histonas,
actina/tubulina, ciclinas
 Drosophila: bicoid, caudal, nanos (homeobox)
 Regulación traduccional “negativa”:
inhibidores
Control: Nivel traduccional:
Inhibición selectiva de mRNAs
 5’Cap, 3’ Poly A ; si no están no traducción
Circularización de
mRNA
- 5’ cerca de 3’
-eIF4E +
-eiF4A (helic)
-eiF4G (scaf)
-poliABP
-Maskin
-CPEB (3’UTR)
(uuuuau)
-eIF4E
-Fosforilacion de
CP y Maskin activa
Control: Nivel traduccional:
Inhibición selectiva de mRNAs
 Ovocito de Drosphila – Bicoid
 Puede ser TF activador –hunchbak
 Puedes se TF inhibidor - caudal
Bicoid:
--Reconoce un BRE
en 3’UTR del mRNA
de caudal
--Liga a d4EHP
--Previene unión de
eIF4E
--Sin este eIF4G no se
puede pegar e
iniciar la traducción
Control: Nivel traduccional
- Tienen favoritismos los ribosomas? NO!
- a favor: mRNAs de Euc son traducidos por
ribosomas de Proc
- sistema reticuloendotelial: traducción por
excelencia
 SI: Selectividad ribosomal –
Ribosomas tienen proteinas
distintas dependiendo del tejido
 Observación de un gen que
causaba deformidades en
esqueleto axial
 Encuentran la mutación NO en el
gen sino en Rpl38
 Traducción Diferencial por Rpl38
Control: Nivel traduccional
 Rpl 38 – mutada podía traducir
muchos mRNAs
 No podia traducir los mRNAs para
los genes Hox
 Proteína 38 del ribosoma en las
somitas, controla expresion de
Hox
 Especifican el tipo de vértebra a lo
largo de la columna
 Deficiencia de Rpl38 causa que
las celulas de las vertebras inician
traduccion es los Hox PLT 
deformidad vertebral
Control: Nivel traduccional
puede el RNA, como las proteinas unirse a un
acido nucleico y bloquearlo? SI
 microRNAs – forma eficiente y
específica de regular la traducción
de un mRNA
 Pequeños, complementarios a mRNA
o parte de el
 Antisense RNA, primera vez en C.
elegans
 Gen lin-4  produce un RNA de 21
ncltd que se pega a varios puntos de
un 3’UTR del mRNA de lin 14
Control: Nivel traduccional
puede el RNA como las proteinas unirse a un
acido nucleico y bloquearlo? SI
 lin14 usado en larva temprana, luego
inactivado, no es necesario
 lin 4 inactiva la sintesis de LIN-14
 miRNAs – sobre 1000 en humanos,
regulan 50% de nuestros genes
estructurales
 miRNA: ~ 22 ncltds, lejos o en intrones
de los genes
 Se fabrica a partir de precursores mas
gdes
Control: Nivel traduccional
miRNAs
- Conservado
- El precursor tiene varios
repeats, cada uno forma un
loop
- Estos loops son procesados por
Drosha y Dicer (RNAsas)
- Estas lo hacen SS RNA
- Empacado en RISC- Argonauta
- Se unen al 3’UTR
- Inhiben traducción
- Perfect
Prim-DroshaPremDicermicroAgo
microRNAs
 miR1- controla el balance entre crecimiento ventricular y
diferenciación
 miR181 – esencial para la determinación de células
progenitoras en celulas B
 miR430 – operación limpieza de mRNAs maternales el
ovocito una vez traducidos (zebra fish), de los primeros en
ser expresados en el embrión
 Fine tuning de Nodal: determinacion de
ectodermo/endodermo
 Son de 22 ncltds, pero con region “seed” de 5ncltd en el
5’
 mRNA con 3’UTR mutado y micro RNA no lo reconoce?
 Texel sheep: myostatin – error de splicing  miostatina
 G A en 3’UTR, mir1 y mir 206, degradan el mRNA del
miostatina
Control de expresión de RNA:
localización citoplásmica
 Se regula el timing y la localizacion de la expresión
 3’UTR – represión selectiva y localización selectiva
 3 mecanismos de localización
 Difusion y anclaje por proteinas activadoras (nanos)
 Proteccion por localizacion (hsp83)
 Libre difusion como nanos pero no es degradada
en unas zonas especificas (polo posterior)
 Transporte activo (mecanismo mas usado)
 Proteinas motoras ligan el 3’UTR y lo transportan
 Son ATPAsas (Dineina y kinesina, osar y bicoid)
• Difusión y anclaje por
proteinas activadoras
(nanos); se difunde se
concentran en el polo
posterior
• Protección Localizada
• Hsp38 – se difunde, se
degradas excepto
polo posterior
• Transporte activo por
el citoesqueleto
• 3’UTR anclados a
motores celulares
• Dineina
• Kinesina
Regulación Postraduccional
 Digestion enzimatica – zimogenos/insulina
 Compartamentalizacion –
 mitocondria, lisosomas, nucleo, golgi
 Dimerizacion, polimerizacion
 Hgb, Tubulina, actina
 Cofactores
 Ca2+. Mg+2
 Modificaciones covalentes
 Fosforilacions, Acetilaciones,
Metilaciones