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Cap 10 – Análisis de Genes y Genomas JA Cardé, PhD Universidad Adventista Alberts et al. Objetivos • Al finalizar la presentación el estudiante podrá: – Definir biotecnología – Conocer los mecanismos de corte y unión del DNA por enzimas – Conocer métodos de visualización de las moléculas orgánicas. – Establecer diferencias, parecidos la importancia y los diferentes tipos de vectores y bibliotecas – Conocer distintas aplicaciones de la biotecnología Biotechnology 3 greeks roots - Bios - life - Teuchos - tools - Logos - study - Study of tools from living things Biotechnology “The application of science and technology to living organisms, as well as parts, products and models thereof, to alter living or non-living materials for the production of knowledge, goods and services.” Biotechnology Biotechnology means any technological application that uses biological systems, living organisms, or derivatives thereof, to make or modify products or processes for specific use.” - Wikipedia.org Biotechnology - Using living organisms, their products or derivatives as tools to solve human issues to improve our life quality. - Organisms: Model systems - Products: Proteins, Antibiotics, Genetically Modified Products (GMPs) - Issues: health, environmental, economical ¿Qué es biotecnología? • Es el uso de organismos vivos, o sus productos para mejorar nuestra calidad de vida y/o nuestro ambiente. • Dependiente grandemente de avances en: – Biología molecular – Métodos y/o Tecnología de DNA recombinante M a n I p u l a c I ó n del DNA Enzimas de Restricción Palíndromes 10_04_Restrict.nuclease.jpg 5’ GTAATC 3’ 3’ CTAATG 5’ Cohesivos Romos Nomenclatura Aplicaciones Analisis y Visualización de DNA 10_05_gel.electrophor.jpg Azul Met EtBR-UV Radioactividad Como se verá la gel? EcoRI Alu I Not I 5GA / ATTC5 3CTTA / AG3 5AG / CT 3 3TC / GA5 5GC / GGCCGC3 3CGCCGG / CG5 LAS 3 A LA VEZ?!!! 5’AAGAATTCGCGGAATTCGAGCTTAAGGGCCGCGCGCCGAAGCTTTAAA3’ 3’ TTCTTAACGCCTTAAGCTCGAATTCCCGGCGCGCGGCTTCGAAATTT 5’ Mapas de Restricción Clonos de BAC 10_11_BAC.clones.jpg Varias enzimas - individuales y en conjunto Solapamientos Denaturación y Renaturación 10_12_de_renaturation.jpg DNA - DS - Complementaridad - GC / AT 3 enlaces vs 2 enlaces; TM Complejidad del Genoma – Experimentos Cot Secuencias altamente repetitivas Moderadamente Repetitivas Unicas Southern/Northern Blotting 10_14_1_Southrn.blotting.jpg Visualización 10_14_2_Southrn.blotting.jpg 10_18_ DNA.in.vitro.jpg Moléculas Quiméricas Ligación = Clonación Cortes Ligación y/o Complementaridad Transformación Bacteriana – Griffith 10_19_DNA.uptake.jpgTra Competencia Transformacion 2 Ejemplos: 10_20_Bacteria.plasmid.jpg Plasmidos Bacterianos Vectores Ori Antibiótico MCS/Polylinker ORF pAMP pKAN pBLUE 10_21_DNA ligase.jpg Digestión/Digestión Cloning Ligación Quimera Transformación Cultivo/Resistencia Transformación – Selección - Replicación – 10_22_cloned.DNA.frag.jpg DNA Miniprep Transformacion 1 10_23_genomic.library.jpg Bibliotecas: Genómica -Restricción -Ligación -Clonación -Replicación -Selección Screening - Replica plating - Probing radioactivo Autoradiografía 10_24_hybridization.jpg 10_25_cDNA.jpg Bibliotecas: de cDNA mRNA Total Oligo dT RT RNAsa H DDDP - replicación DS DNA copia mRNA ClonarSelecciónScreen. 10_26_Genomic_cDNA.jpg vs Reacción de la Polimerasa en Cadena: PCR 10_27_1_PCR_amplify.jpg -Objetivo -aplicaciones 10_27_2_PCR_amplify.jpg PCR 1, PCR 2 Aplicación-cloning 10_28_PCR_clones.jpg Aplicación – detección/diagnóstico 10_29_PCR_viral.jpg Aplicación - Forense - VNTR 10_30_1_PCR_forensic.jpg 10_30_2_PCR_forensic.jpg Aplicación - Secuenciación 10_07_1_enzym.dideoxy.jpg Secuenciacion Di-deoxi 10_07_2_enzym.dideoxy.jpg 4 reacciones ddNTPs PCR PAGE Autoradiografia 10_08_DNA.sequencing .jpg Secuencia Digitalizada/Color Code PCR / Fluorescencia http:www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.html 10_31_SerialDNA.clone.jpg Clonación en secuencia Para unir un grupo de fragmentos derivados de distintos origenes Vectores de Expresión 10_32_expressionvector.jpg -Ori, Antibiotico, Polylink -Promotor eficiente -Senales de poliA etc -Transformado en celulas Dogma Central Repensado - huevo o gallina/gen o proteína? 10_33_gene_protein.jpg Genes Reporteros - Determinar el 10_34_Reporter.genes.jpg patron de expresion de un gen - Quiero saber cual celua expresa a X, proteina indetectable cual será el efecto de seq 1 sobre seq 3) GFP: Gen Reportero Promotor de neurona con GFP Neuronas expresando GFP 10_35_GFP.jpg Hibridización In situ - Detección de la presencia de papiloma humano - Sonda pink complementaria al genoma viral 10_16_In.situ.hybrdztn.jpg In situ En cromosomas Localizar genes Cromosoma 5 2 pts/por cada gen, WHY? Diagnóstico Screening poblacional para Sckl cell anemia Diagnósticos 10_13_hybridization.jpg ER No Rx DNA Microarray - Para monitorear la expresión de miles de genes a la vez 10_15_DNA.microarrays .jpg ER Rx cDDNs de dos celulas para comparar expresion Marcarlos fluorescente(rojo/verde) Mezclar e hibridizar con el array Lavados, Rastreos, Lectura 110 genes Rojo A > B o Verde B>A o Amarillos Análisis: spot Rojo, este gen es del pool R, donde se expresa mas que en el otro pool, lo mismo para verde Site Directed Mutagenesis 10_36_mutagenesis.jpg Sustituciones: mutantes, KO, doble copia 10_37_engineered.org.jpg Transgénicos 10_38_ES.cells.jpg 10_39_Transgenic.mice.jpg 10_40_Transgenic.plant.jpg Transgénicos ¿Preguntas?
