Download Enzimas de restricción:

Ingenierí
Ingeniería gené
genética conjunto de té
técnicas, nacidas de la biologí
biología molecular,
que permiten manipular el genoma de un ser vivo
1970s
Alternativas
Genómica
Proteómica
Una década importante para la biología molecular y celular
descubrimientos CLAVES
Aislamiento DNA y RNA
enzimas de restricción
DNA ligasa
Secuenciación del DNA
Aislamiento de
DNA de genoteca
GEN
Aislamiento
del cDNA y clonación
Secuencia parcial
de aminoácidos
Síntesis de oligonucleótidos
(sondas o cebadores)
Homologías estructurales
Función biológica
Seleccionar el cDNA o
DNA genómico en genotecas
(Hibridación)
DNA RECOMBINANTE
PROTEINA
PROTEINA
Secuenciación DNA
Estructura 1ª
de la proteína
Manipular
el DNA
Se introduce en bacterias,
principalmente y se obtiene
DNA concretos,
rápidamente y en grandes
cantidades
Aislamiento de
la proteína
Enzimas de restricción:
GEN
Secuenciación
del gen aislado
Producción
recombinante
Hidrólisis selectiva del DNA
Electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida
Separació
Separación por tamaño y
conformación
Tinció
Tinción con Bromuro de Etidio
Separación de
los fragmentos
Mapas de restricción
Variabilidad interespecie:DNA mitocondrial
Mutaciones
Secuenciación
DNA
secuenciación
Método de Sanger (“didesoxi”)
DNA ligasa: otra enzima esencial
Autorradiografía
de rayos X
Se puede ligar DNAs de distinta
procedencia para formar una nueva especie
de DNA : DNA recombinante
“Cohen y Boyer, 1973”
DNA ligasa
Ligación
Las bacterias se pueden transformar con DNA recombinante :Transformació
Transformación
Clonar significa hacer copias idénticas: CLON
Incorporación de DNA en vectores plasmídicos (“in vivo”) a un sistema
celular que permita su replicación
Selección de colonias en la célula huesped: gen resistencia a antibiótico (AmpR)
Vectores de clonación:
DNA clonado
transformación
PLÁSMIDO
Moléculas circulares de
DNA bicatenario
Extracromosómico
placa LB/agar/AmpR
Origen de replicación
Marcador de selección: resistencia a
antibiótico
Sitio de clonaje múltiple
Bacteria,levadura
Grandes cantidades de DNA
Un mismo tipo de DNA
Elaboración de bibliotecas de DNA (genoteca
genoteca) con fago y otros vectores
DNA a insertar
ligación
Ventajas
Mayor eficiencia transformación
Mayor nº clones analizados
Fragmentos de gran tamaño
plásmido
gen de resistencia
a antibiótico
DNA
recombinante
UN MUESTRARIO DE
GENES MÁS COMPLETO
transformación
Célula
huesped
Selección de células
recombinantes por crecimiento
en presencia del antibiótico
Aislamiento de mRNA
TIPOS DE
GENOTECAS
GENOMICO
DNA
mRNA
(polen)
cDNA
Ventajas: no intrones,
proteínas específicas de tejido,
secuencia deducida de aa
tipo vector
Plásmido
Fago λ
Cósmido
Fago P1
BAC (cromosoma artificial bacteriano)
YAC (cromosoma artificial levadura)
DNA a clonar (kb)
20
25
45
100
300
1000
Longitud máxima de DNA que se pueden clonar en determinados vectores
Cromatografía de afinidad
con oligo-dT sefarosa
transcriptasa inversa
mRNA
cDNA
DNA
Identificación del DNA clonado
Desnaturalización
de DNA por calor
Síntesis de oligonucleótidos
Enfriamiento
Hibridación
RNA
SONDAS (HIBRIDACIÓN)
CEBADORES (PCR)
Híbrido DNA-RNA
Seleccionar un DNA determinado
Sonda radiactiva
Expresión de la proteína y
detección con Ab marcado
“Beaucage y Caruthers, 1981”
RNA o DNA
tampón
32P-M
papel filtro
Electroforesis
gel
Transferencia Northern RNA-DNA
Transferencia Southern DNA-DNA
Hibridación in situ
solución
salina
membrana
gel
membrana
DNA transferido
sonda a la membrana
radiactiva
sonda
no unida
autorradiografía
fragmentos
hibridados
La PCR permite amplificar DNAs que codifican proteínas o péptidos específicos
desnaturalización
2
hibridación
1
3
síntesis DNA
oligonucleótidos
cebadores
Región del gen
o cDNA que se
quiere amplificar
PRIMER CICLO (2 moléculas de dsDNA)
SEGUNDO CICLO (4 moléculas)
TERCER CICLO (8moléculas)
Producció
Producción de grandes cantidades de un segmento de DNA purificado
Cuá
Cuándo producir de las molé
moléculas recombinantes
PRODUCCIÓN ESCASA
Niveles Bajos de síntesis (Interferón)
Material biológico escaso (Inmunoglobulinas y
citoquinas)
Inestabilidad in vivo
Alto polimorfismo (alergenos)
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS NO NATURALES
Mutantes (quimeras, anticuerpos humanizados)
Fragmentos peptídicos
ESTUDIOS FUNCIONALES IN VIVO
Plantas y animales trasgénicos
moléculas/ciclo
(30 ciclos)
Tipos de células huésped
Bacterias, levaduras, cels insectos, plantas
Diferente calidad de la estructura de la proteína
Proteína Proteína desplegada
Formas de expresión de la proteína
Intracelular o extracelular
Proteína libre o proteína de fusión
Facilidad de detección y aislamiento
Proteína
Proteína-GST
Naturaleza del producto de expresión
Proteína completa, fragmentos, mutantes
Diferentes usos
Proteína
Péptidos
Proteína
mutante
Sistemas de expresión
Células bacterianas
Levaduras
Escherichia coli
Saccharomyces
Bacilus subtilitis
Pichia pastoris
Células de insecto
Sf9
Sf12
Plantas mono y dicotiledóneas
Células de mamíferos
Etapas en la producción de proteínas recombinantes
promotor
Operador lac
Sitio de clonaje múltiple
Vector de
expresión
Secuenciación
cDNA
ligación
iniciador de
transcripción
2. Subclonación en
vector de
expresión
cDNA
pET11b-cDNA
lacI
4. Detección y purificación
célula E.coli
IPTG (inductor)
IPTG-represor lac
proteína
recombinante
tránscrito
RNA
SOMATOSTATINA: Primera proteína humana
(1977)
producida en bacteria
5. Producción a gran escala
EcoRI
p
T7
Transformación
Represor Lac inhibe
la transcripción
NdeI
Ap
R
ATG
cDNA
Modos de expresión
Intracelular (grandes cantidades, insoluble)
Proteína de fusión
So
lu
b
I n le
so
lu
bl
e
Inducción
So
lu
b
In le
so
lu
bl
e
Expresión directa
Proteína-GST
trombina
Proteínas de
la bacteria
Cuerpos de inclusión
Azul Coomassie
Policlonal
Extracelular (solubilidad, poca cantidad, previene proteolisis)
Secreción (periplasma)
Excreción (medio de cultivo)
Excreción proteína interés
Secreción periplasma
Intracelular soluble
Análisis del plegamiento de proteínas recombinantes
Equivalencia estructural
Natural
Recombinante
► SDS-PAGE en presencia y ausencia de 2-ME seguido por tinción
kDa
► SDS-PAGE seguido por westernblotting y análisis inmunológico
-
2ME
+ -
2ME
1
2
3
+
4
66
45
36
29
24
NR N R N R NR NR NRNR
20
14
1
2
3
4
5
6
7
N, natural
R, recomb
Suero
% inhibición
100
nSin a 1 rproSina1
ELISA
50
Proteína natural
Proteína recombinante
0
10-3 10-2 10 -1
Inhibidor
66
45
36
80
A214
29
24
60
20
0,2
14
40
0,1
► ensayo de actividad biológica
20
Acetonitrile % (-----)
► HPLC o FPLC analítica
0,3
Absorbance (540 nm)
kDa
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0,0
10 20 30 40 50 60
Time (min)
600
200 400
rNtD (pmoles)
1,3-β-glucanase activity
Investigación
Agricultura
Estudios de evolución
Biología forense
Medicina clínica
Análisis del DNA: proyecto “genoma”
genoma”
detección de HIV
Transferencia de genes
Diagnóstico
Terapia
cultivos
celulares
Anticuerpos
humanizados
anticuerpos
monoclonales
Marcadores DNA
Ingenieria
genética
Análisis
del DNA
Bancos DNA,
RNA y proteínas
Análisis de
genomas completos
Mapa genético del cromosoma 1 humano,
el más largo
Posiciones de 58 marcadores
El cromosoma femenino es más largo
biología
molecular
Medicina
forense
Genética del
desarrollo
Desde 1980…..Human Gene Mapping (HGM)
Inmunotoxinas
Síntesis de
sondas de DNA
Clonaje
Terapia
génica
Producción de
prot. recombinantes
Localización de desórdenes
genéticos; determinación sexo;
expresión diferencial
Ingeniería genética: medicina forense
Un caso de violación
DNA cromosómico
(e.j. sospechoso 1)
digestión con
enzimas de restricción
fragmentos DNA
separación en
electroforesis
Pasos:
Pasos
Muestra de la escena del crimen
Extracción del DNA
Cuantificación
Análisis de marcadores genéticos
Perfil genético
Comparación con otros perfiles
Comparación en bases de datos
…además, pruebas de paternidad,
resolución de crímenes
sospec1
evidencia
victima
sospec2
sonda DNA
radiactiva
desnaturalizar
y transferir
exponer
470 ORF
funciones al 87%
Genoma del Mycoplasma genitalium
Extraer oocitos después
de una superovulación
fertilización in vitro
Técnica utilizada: PCR
cultivo in vitro hasta
un estadío de 6-10 células
extraer una célula de
cada embrión por tubo
amplificar DNA específico
del cromosoma Y por PCR
fragmento específico
de sexo masculino
Localización del gen para
la sub. β de la fosforilasa quinasa
Producto
del gen enfermedad
Factor VIII hemofilia
gota
Urato oxidasa
cromosoma 16
nº de granos
analizar los productos por PCR
Análisis de hibridación con sondas de DNA y RNA fluorescente: PATRONES DE EXPRESIÓN DE GENES
“Array” de DNA de Arabidopsis
Este array contiene 10.000 muestras
diferentes de cDNA, aplicadas en
duplicado, y en conjuntos de 20 x 21
muestras
chip de silicio
6400 puntos
“Array” de proteínas
18 x 18 mm
6400 genes de levadura
Hibridación con sonda verde
Hibridación con sonda roja
oocito
embrión
detecció
detección microscopio de barrido confocal
1. análisis de expresión génica de
un genoma en determinadas condiciones
2. Detección de mutaciones
3. Mapeo genético
Producción de nuevos productos recombinantes utilizados en medicina
promotor
bacteriano
AmpR
β-gal
β-gal
cadena A
de insulina
Fines terapeúticos
1. Obtenció
Obtención de insulina humana
Cadena B
de insulina
(1)
(1) Transformació
Transformación E. coli
(2)
Cultivo celular
(3) Purificació
Purificación proteí
proteínas de fusió
fusión β-gal
(2)
insulina
(4) Tratamiento con CNBr
(3)
(5) Purificació
Purificación de cadenas A y B
N-terminal
cadena madura
(6) Oxidació
Oxidación y formació
formación de –S-S-
cadena A cadena B
(4)
péptidos
de B-gal
CNBr rompe el
enlace peptídico
después de la Met
(5)
cadena A
cadena B
óvulos
replegado y
oxidación de Met
secuencia señal
mamíferos
insulina activa
puentes disulfuro
1er aminoácido
de hGH madura
Codon de parada
gen de interés
2. Obtenció
Obtención de hormona del crecimiento humana (hGH
(hGH))
EcoRI
aminoác 1-24
Oligo (1-24 aa)
aislamiento del DNA
codificante aa 24-191
(a)
producció
producción intracelular
(b)
producció
producción extracelular
Secuencia señal
bacteriana
Met inicial
esperma
óvulos
fecundados
microinyección del
DNA en el pronucleo
as y
ligación
Met inicial
extracción
ratones
pseudopreñadas
hGH DNA
implante en ratones
pseudopreñadas
HindIII
vector de expresión
hGH DNA
Met
promotor
hGH se secreta al
espacio periplásmico
transformación
E. coli
animales resistentes
AmpR
transformación
E. coli
análisis de DNA
proteasa periplásmica
rompe el péptido señal
hGH se acumula
en el interior
de la célula
hGH se aisla del
extracto bacteriano
Medicina: Terapia génica
Biotecnología: Producción de plantas y
hGH se libera por
“shock” periplásmico
presencia del g
hGH sin Met
Met
(a)
NH2
COOH
(b)
secuencia de la proteína
Idéntica a la hormona natural
presencia del gen transgénico por PCR
Transferencia de genes a animales: ANIMALES TRANSGÉNICOS
Utilización de estos modelos en TERAPIA GÉNICA
RNA del virus del
mosaico del tabaco (TMV)
Vector T-DNA
ligación
cDNA de la proteína
de la cubierta
Promotor CaMV
Plantas como sistemas de
producción de proteínas
recombinantes
terminador
transferencia
a Agrobacterium
transferencia del gen que
codifica la hormona de crecimiento (GH)
plantas transgénicas
resistentes a plagas
Infección en placas
de hojas de tabaco
1. Producción de inmunotoxinas
Ab frente a antígeno de
Ab frente a antígeno de
superficie de células tumorales superficie de célula T citotóxica
Plantas transgénicas
toxina
recombinación
B. thuringiensis
aplicar TMV a las hojas
planta control
se infecta
Célula tumoral
Inactiva hasta
que es ingerida por
las larvas del insecto
planta transgénica
que expresa CP
está protegida
Ab bifuncional
planta transgénica que no
expresa CP se infecta
Célula T citotóxica
2. Anticuerpos “humanizados” retienen actividad pero pierden inmunogenicidad
Ingeniería de anticuerpos
mAb ratón
Ab quimérico
Ab humanizado
Célula T citotóxica
causa la lisis de la célula tumoral
Diseño de moléculas bifuncionales
(inmunotoxinas): nuevas terapias utilizando mAb
(a)
(b)
(c)
(a)
Regiones constantes y variables de la Ig de ratón
CDRs de ratón
(b)
Regiones constantes humanas, regiones variables
Y CDRs de ratón
(c)
Regiones constantes y variables humanas, CDRs
de ratón