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TECNICAS DE OBSERVACIÓN
MICROSCOPICA
Lunes
TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS
1. Observación en fresco
Son preferibles en las situaciones siguientes:
• La morfología de las bacterias se altera cuando se desecan y tiñen.
• Cuando las bacterias se observan para determinar movilidad
• Para observar los cambios citológicos que ocurren durante la
división celular
• Por este método se observan fácilmente algunas inclusiones
celulares como vacuolas y materias grasa.
2. Observación con tinciones
• Para observar las características morfológicas de las bacterias
• Identificación y diferenciación de microbios entre especie y
dentro de la misma especie (tinción diferencial o selectiva).
Lunes
TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS
1. Observación en fresco
•preparación en fresco simple
•preparación en gota pendiente
2. Observación con tinciones
•Tinción simple: un solo colorante.
•Tinción diferencial: más de un colorante
•Tinción especial
Tinción negativa: colorea el medio que rodea
a la bacteria permaneciendo ésta sin teñir.
Procedimiento para un preparado en fresco
("entre porta y cubre")
1. Colocar una gota de
2.- Tomar la muestra con el
SSF o agua en un porta
asa de siembra o un gotero
Muestra
Porta objeto
Observación microscópica
1. Observación en fresco
 Bacterias: Leptospiras, treponemas (M.
campo oscuro)
Observación microscópica
1. Observación en fresco : (SSF)
 Parásitos : Trofozoitos, larvas.
Observación microscópica
1. Observación en fresco
 Hongos: Levaduras
Observación microscópica
1. Observación en fresco con modificaciones
 Hongos
 NaOH 10% (hifas)
Procedimiento para un preparado en fresco
en gota pendiente
2. TINCIONES O COLORACIONES
COLORANTE: DEFINICIÓN
• Son compuestos orgánicos que tienen alguna
afinidad específica por algún componente.
• Los colorantes son compuestos químicos
utilizados para aumentar el contraste
COLORANTES: Tipos
a) Sales colorantes: más comúnmente usados
 básicos: Consisten en un catión coloreado unido a un anión
incoloro. Tiñen la célula bacteriana uniformemente (ácidos
nucleicos y los polisacáridos ácidos )
 (cromatina nuclear de pro y eucariotas)
 (más usados en citología bacteriana).
• Ej: clorhidrato (-) de azul de metileno (+). la safranina, la fucsina básica,
el cristal violeta
 ácidos: Tienen el catión incoloro unido a un anión coloreado.
No tiñen la célula bacteriana, pueden usarse como color de
contraste (coloración negativa). Tiñen estructuras citoplasmáticas
de las células eucariotas(Rx básicas)
Ej: eosinato (-) de sodio (+),la fucsina ácida y el rojo Congo.
COLORANTES: Tipos
b) Colorantes liposolubles
• Se combinan con los componentes lipídicos de
la célula, usados para revelar la localización de
los depósitos de grasa. Ej. Negro Sudán.
COLORACIONES : Tipos
• Vitales
– Son aquellas que se practican sobre células que están
vivas, mediante la introducción de un colorante en la
circulación de un organismo vivo.
– Ejem: el verde Jano y el azul de metileno.
• Supravitales
– son aquellas que se realizan sobre células o tejidos vivos,
pero que están aislados del organismo del que proceden.
• No vitales
– se realizan sobre células muertas.
TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA
PREPARACIÓN COLOREADA
a) Frotis o película (extensión)
b) La fijación
c) Coloración.
Tinción de células para la observación
microscópica
Extensión de una fina capa
de células sobre el porta
Adición del colorante
lavado y secado
Secado al aire
Fijación por flameado del porta
Se coloca una gota de aceite
de inmersión sobre el porta y
se observa con el objetivo de
100X
TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA
PREPARACIÓN COLOREADA
a) Frotis o película (extensión)
•
Utilizar portaobjetos limpios y desengrasados
TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA
PREPARACIÓN COLOREADA
b) La fijación:
Los microorganismos queden adheridos al portaobjeto ( coagula las sustancias proteicas)
TIPOS
– CON CALOR (O MÉTODO DE KOCH)
– FIJACIÓN QUÍMICA: alcohol metílico, formalina al 5 % (v/v), licor de Hoffman (partes iguales
de etanol absoluto y éter)
Metanol
TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA
PREPARACIÓN COLOREADA
c) Coloración. SIMPLE : Positiva o negativa
Lunes
Tinción simple de azul de metileno.
Frotis y fijación
1.- Poner una gota de agua
en un porta
2.- Tomar la muestra con el
asa de siembra
3.-Extender sobre el agua y
fijar a la llama del mechero
Tinción
1.- Cubrir la preparación
con Azul de Metileno 5’
2.- Lavar con agua, dejar
secar y observar al
microscopio
Micrococcus luteus
Lunes
Tinción negativa.
1.- Colocar una gota
Nigrosina en un porta
de
2.- Tomar muestra del
microorganismo
con el
asa, flamear el tubo y tapar
3.- Mezclar con la
Nigrosina y extender por
todo el porta. Secar al
aire y observar
cápsulas tanto bacterianas como de levaduras, esporas que se observan como cuerpos
refringentes y espiroquetas
 Hongos
 Tinción negativa
TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA
PREPARACIÓN COLOREADA
c) Coloración. Diferencial o compuesta
se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos
Etapas :
1. tinción primaria
2. Tinción de contraste o secundaria
-
Ejemplo.: COLORACION GRAM, COLORACION DE ZIEHLNEELSEN, ESPORAS
TERMINOS
• Los mordientes, aunque no son
colorantes, intensifican la tinción
porque aumentan la afinidad de la
célula por el colorante. También se
pueden utilizar para producir un
engrosamiento de ciertas estructuras
celulares externas, como los flagelos,
que debido a su delgadez no podrían
ser visualizados de otra forma.
Diferencias en la pared celular
Lunes
Tinción
L-3.2.3.- Tinción de Gram
Frotis y fijación
1.- Poner una gota 2.- Tomar la muestra
de agua en un porta con el asa de siembra
3.- Decolorar con
Alcohol 96º hasta que
no suelte colorante
3.- Extender sobre el
agua y fijar a la llama
del mechero
4.- Lavar con agua
1.- Cubrir la
preparación con
Cristal Violeta 2’
5.- Teñir con Safranina 1’
2.- Añadir Lugol
(mordiente) durante 1’
6.- Lavar con agua,
dejar secar y observar
al microscopio
Tinción de Gram
Tinción del frotis
Paso 1
Paso 2
Previamente fijado al calor,
con cristal violeta
Durante 1 minuto.
Todas las células se tiñen
de color azul-violeta.
Añadir Lugol,
dejar actuar 2 minutos
Todas las células siguen
de color azul-violeta.
Gram +
Decolorar con alcohol
Paso 3
Las células Gram +
siguen de color azul-violeta.
Las Gram negativas
se decoloran.
Tinción de contraste
Con safranina 2 minutos.
Las células G+
se ven azul-violeta.
Paso 4
Las G- rosas o rojas.
Gram -
PROCEDIMIENTO COLORACION
GRAM
Lunes
Tinción de Gram
Cocos Gram -
Bacilos Gram -
COLORACIÓN DE ZIEHL- NEELSEN
fundamento de esta técnica diferencial se basa en la propiedad
de la pared celular Orden Actinomycetales. (acidos micólicos)
• Resiste la decoloración con alcohol y un ácido fuerte cuando
• VARIANTES
• Caliente : Mycobacterium
• En frío (o de Kinyoun) : Cryptosporidium, Cyclospora E
Miercoles
Tinción de ácido-alcohol-resistente.
Tinción
Frotis y fijación
1.-Poner una gota de agua
en un porta
2.- Tomar la muestra de un
cultivo de Mycobacterium
3.-Extender sobre el agua y
fijar a la llama del mechero
1.-Cubrir la preparación
con Fuchina fenicada
2.-Calentar con un hisopo de
algodón empapado en alcohol
y prendido con la llama del
mechero hasta la emisión de
vapores. Mantener durante 5
minutos.
3.-Lavar con agua y
decolorar con alcohol
ácido
5.-Lavar con agua, dejar
secar y observar al
microscopio
4.-Teñir con Azul de
Metileno 1’
Tinción de esporas.
Miercoles
Tinción
Frotis y fijación
1.-Poner una gota de
agua en un porta
2.-Tomar la muestra de
un cultivo de Bacillus
2.-Calentar, con un
hisopo de algodón
empapado en alcohol
y prendido con la
llama del mechero,
hasta la emisión de
vapores.
Mantener
caliente durante 5
minutos.
3.-Lavar con agua
3.-Extender sobre el
agua y fijar a la llama
del mechero
Esporas
Bacterias
4.-Teñir con Safranina 1’
1.-Cubrir la
preparación con
Verde Malaquita
5.-Lavar con agua,
dejar secar y observar
al microscopio
La tinción de flagelos de Leifson
• 1.Se fija químicamente la suspensión bacteriana,
mediante formol, y se hace la extensión en un
portaobjetos.
• 2.Se deja secar al aire, sin calentamiento alguno.
• 3.Se cubre la preparación con una mezcla de ácido
tánico y el colorante rosanilina, de preparación
extemporánea. El ácido tánico engruesa los flagelos y
la rosanilina los tiñe.
• 4.Se retira el exceso de colorante con agua.
5. Por último, se deja secar al aire, antes de su
observación al microscopio.
•
Figura 3.11Tinciones específicas. (a) La tinción de Wirtz-Conklin se utiliza para observar
endosporas. Bacilius cereus (b) La tinción de Leifson revela que este microorganismo posee
flagelos, lo cual contribuye a su identificación como Spirillum volutans..(c) La tinción negativa
con tinta china permite observar que esta bacteria posee cápsula, lo que facilita su
identiticación como Klebsiella pneumoniae, agente causal de la neumonía.
Técnicas de tinción para bacterias
Tinción
Uso
Técnicas
Tinciones
simples
Un colorante; proporciona contraste para
observar mejor un organismo completo
Se tine con un colorante básico (azul de metileno, cristal violeta, o fucsina
básica) durante unos 5 minutos. Aclarar brevemente con agua. Se tiñen casi
todas las bacterias; la rnayoría de los tejidos no se tiñen.
Tínciones
diferenciales
Tinción de Gram Dos o más colorantes; distingue entre
bacterias Gram positivas y Gram negativas
Se cubre la preparación de bacterias fijadas con cristal violeta y después con
una solución de iodo (mordiente). Todas las células quedan tenidas de color
violeta oscuro. Se decolora con acetona al 95%.
Las células Gram positivas permanecen tenidas, pero las negativas pierden el
colorante. Se tiñe con safranina (contraste). El color violeta de las Gram
positivas se vuelve más oscuro y las Gram negativas se tiñen de rosa.
Tinción de
Dos colorantes; distingue entre las
Se tiñen las células con fucsina básica y se calienta a emisión de vapores
ácido-alcohol
micobacterias (ácido-alcohol resistentes) y el durante 5 minutos. Todas las bacterias se tinen de rojo. Se decolora
resistencia
resto de las bacterias
brevemente con una mezcla de alcohol-HCl. Las bacterias resistentes
(Ziehl-Neelsen)
permanecen teñidas de rojo; todas las demás se decoloran. Se trata con el
colorante de contraste azul de metileno. Las bacterias ácido-alcohol resistentes
continúan tenidas de rojo, las otras se tiñen de azul.
Tinciones
especificas
Tinción de
Tiñe selectivamente las endosporas
Se cubre la preparación con verde de malaquita y se calienta a emisión de
esporas de
vapores durante 60 segundos. Se lava con agua durante 30 segundos y se tiñe
Wirtz-Cortitlin
con safranina. Las endosporas retienen el color verde; el resto de la célula toma
el color rosa.
Tinción de
Permite observar los flagelos
A las células previamente fijadas, se le añade una mezcla de ácido tánico
flagelos de
(mordiente) y del colorante rosanilina. El mordiente engruesa los flagelos y el
Leifson
colorante los fine.
Tinción negativa Revela la presencia de cápsulas
Se utiliza tinta china o nigrosina para tenir una preparación en fresco del
espécimen. Las particulas de colorante no pueden penetrar en la cápsula, que
se observa como una región clara alrededor de la célula.
Imágenes de Paramecium al mismo aumento (1000x), pero con distintos
microscopios. (a) La microscopía de campo claro permite observar la forma y las
estructuras internas de mayor tamaño, como el núcleo. (b) La imagen de
contraste de fases muestra mayor detalle interno, y el característico halo. (c) La
microscopía de campo oscuro revela la presencia de cilios. (d) La imagen de
Nomarsky es casi tridimensional.
PARASITOS: Plasmodium
• GIEMSA O WRIGHT
COLORACION LEISHMAN
HONGOS
• AZUL DE LACTOFENOL
• T. MENTAGROPHYTES
COLORACION DE TEJIDOS
HEMTOXILINA /EOSINA
Hay alguna pregunta…?
o de lo contrario…
…seguimos en la
próxima clase !!!