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Small interfering RNA ( siRNA )
Cristina Teixidó Febrero
Historia
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En los 90. Las primeras observaciones de silenciamiento de genes se hicieron al querer
mejorar cultivos de interés económico
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1990 R. Jorgensen “Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase gene into petunia
results in reversible co-supression of homologous genes in trans.” Plant Cell
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1997 David Baulcombe Intentar frenar la infección vírica en la planta del tabaco.
Introducir genes virales en plantas transgénicas las protegía de la infección por el virus.
“A Species of Small Antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants”
Science
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1998 Andrew Fire y Craig Mello C. elegans. Se puede silenciar la expresión de un gen a
través de la introducción del dsRNA correspondiente. Andrew Fire denominó este
fenómeno RNAi
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2001 Thomas Tuschl. Demostró que siRNAs sintéticos eran capaces de inducir RNAi en
células de mamífero “Duplexes of 21-nucleotide RNAmediate RNA interference
incultured mammalian cells” Nature
Introducción
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La ribointerferencia es un mecanismo de silenciamiento post-transcripcional de genes
específicos, ejercido por moléculas de RNA que, siendo complementarias a un RNA
mensajero, conducen a la degradación de éste
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ARNi es una molécula de RNA que suprime la expresión de genes específicos
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El siRNA, ARN pequeño de interferencia, es también conocido como RNA de
silenciamiento. Es uno de los tipos de RNA interferente y se produce mediante el
procesamiento de la enzima Dicer
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Es altamente específico para la secuencia de nucleótidos de su RNA mensajero diana,
interfiriendo por ello con la expresión del gen respectivo
Imagen de Dicer
Estructura
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Doble cadena de 21-23 pb
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Cada hebra de RNA tiene un grupo fosfato 5’ y un grupo hidroxilo (-OH) en 3’
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Los siRNA no están presentes en organismos unicelulares, sino que son propios
de células eucariotas. Esto sugiere que se trata de una función biológica
bastante nueva, que han adoptada las células más avanzadas durante la
evolución
Aplicaciones y funciones
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Mecanismo de control de la expresión génica
Permite estudiar la función de cada gen e identificar genes esenciales en
procesos celulares
Regulación del desarrollo y el mantenimiento del genoma
Funcionan como un sistema de defensa contra virus, control de transposones o
elementos génicos anómalos.
Estrategia terapéutica potencial en enfermedades virales, descubrimiento de
fármacos diana y terapia del cáncer
Validar dianas terapéuticas
Suelen utilizarse precursores de RNAi, ya sea RNA doble cadena del gen diana
a reprimir o directamente RNA monocatenario complementario al RNAm a
silenciar
Con cultivos celulares, generalmente el vehículo utilizado son liposomas
Vía del RNAi
RNAi transitivo
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En plantas, hongos y Caenorhabditis elegans
La molécula de siRNA provoca, tras el corte del mRNA diana, la síntesis de nuevos siRNA a
partir de secuencias que están en dirección 5’ del punto de corte, con lo que se amplifica la
señal
RNA polimerasas dirigidas por RNA, las cuales aparentemente no existen en humanos
Vía del RNAi
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Dicer puede cortar dsRNA a siRNAs de: (A) secuencias propias, (B) virus o (C) miRNAs.
Algunos virus generan dsRNA dentro de las células a las que infectan. Las células
infectadas detectan estos dsRNA y montan una respuesta de defensa, que termina con la
degradación del RNA invasor
Diseños de los siRNA
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Diseño aleatorio.
- Selección de 21 bases del ARNm diana sin tener en cuenta la secuencia que tiene en el
transcrito
- Uso por los investigadores del mecanismo de acción de los ARNi para identificar
posibles nuevos parámetros o atributos relacionados con la funcionalidad del ARNi
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Diseño racional
- Procedimiento informático dirigido a identificar las dianas óptimas del siRNA en un
ARNm
- Empleo de un complejo algoritmo que incluye amplios análisis bioinformáticos para
identificar siRNAs funcionales únicos con efectos secundarios mínimos
- Permite elegir un siRNA altamente funcional
- Lleva a cabo comparaciones sistemáticas de secuencias
- Elimina de forma efectiva los siRNA no funcionales del conjunto de candidatos
El algoritmo emplea un sistema de criterios como el contenido GC, perfiles de
estabilidad interna, estructura interna, presencia de bases en posiciones clave, etc
Diseño convencional
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Elegir el sitio diana del siRNA
Longitud de 21-23 pb sense/antisense con los extremos 3’ salientes y los 5’ fosforilados.
AA(N19)TT. En los 3’ va bien usar 2 dt seguidos
La cadena con el 5’ termodinámicamente menos estable es la incorporada en el RISC
5’ cadena guía: Tm menos estable (rico en A/U)
5’ cadena pasajera: Tm más estable (rica en G/C)
 Las tres primeras pautas: extremo 5 ’ de la cadena antisentido sea el termodinámico
menos estable
Diseño convencional
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Evitar:
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Diana esté en un intrón
Los 5’ y 3’ de UTRs (untranslated regions)
Los primeros 75 - 100 pb des del codón de inicio
Secuencias con > 50% GC (30-70%)
Secuencias que contengan repeticiones internas
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Comparar el candidato con marcadores de secuencia expresados en bases de datos
públicas (ej BLAST) para asegurar la especificidad (IMPORTANTE)
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Modificaciones químicas haciéndolos más estables
Modificar posición 2’ de ERI-1, una ribonucleasa que tiene una actividad 3' 5'
exonucleasa que está implicada en la regulación y en la degradación de los siRNAs
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La eficiencia debe ser > 90% a 1-20 nM
Recomendación: knockdown del gen con dos siRNAs independientes para controlar la
especificidad del efecto del silenciamiento
Ventajas
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Puede sustituir tres métodos: knock-out, dominantes negativos e inhibidores químicos
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Disminuye tiempo, coste y aumenta la especificidad
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Técnica fácil y rápida
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Facilita los análisis sobre tratamientos nuevos para el cáncer, enfermedades
inflamatorias o infecciosas
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Se pueden realizar experimentos en cualquier tipo celular de interés
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Se puede realizar in vivo e in vitro
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La eficacia del sistema de interferencia radica en que RISC cataliza múltiples ciclos de
interferencia in vivo
Desventajas
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Estabilidad
Administración
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Off-target effects (OTEs) Material foráneo por el SI: respuesta IFN
Genes con complementariedad incompleta son downregulados sin darse cuenta
dando problemas en la interpretación de los datos
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Los liposomas catiónicos muchas veces son tóxicos para la célula
Baja eficiencia de la transfección
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Saturación del complejo RISC por un uso de múltiples siRNAs no funcionales
Para hacer el knockdown se necesitan dosis muy elevadas. OTE son dosis
dependientes
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Ninguno es 100% efectivo (eficiencia 50-90%)
Inactivos por tener un SNP o una mutación puntual en el sitio diana
En un futuro
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Avance de la investigación biomédica
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Descubrir funciones biológicas nuevas para comprender mejor los mecanismos
de las enfermedades humanas
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Tecnologías para aumentar la especificidad, estabilidad y el rendimiento real
del silenciamiento
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Mínimos efectos secundarios con el mayor silenciamiento específico
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Tratamientos nuevos para el cáncer, enfermedades inflamatorias o infecciosas
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Desarrollo de nuevas terapias génicas
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Descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos
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Nueva clase de fármacos
Bibliografía
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Silenciamiento por RNA: de la regulación de la expresión génica a la defensa
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Bibliografía
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http://www.prnewswire.co.uk/cgi/news/release?id=159958
http://www.dharmacon.com/
http://www.nature.com/focus/rnai/animations (vídeo)