Download Silenciamiento génico

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
Silenciamiento génico para el control del
hongo causal de escoba de bruja
Ana Cristina Caribé dos Santos, DSc
Guayaquil
25 a 28 de agosto, 2014
QUE ES RNAi
Conjunto de procesos mediados por pequeños
RNAs regulatorios conservado entre eucariotas
Protege el genoma de patógenos y
transposones
Regula el programa celular de expresión
génica y desenvolvimiento
Previene el acumulo de mRNAs não
funcionales
COMO FUNCIONA
APLICACIONES DE RNAi EN LA
CIENCIA
Estudio funcional de genes
Defensa contra patógenos
Control de la expresión génica
experimentalmente
POR QUE UTILIZAR RNAi VENTAJAS
PTGS
Degradación del mRNA, por tanto,
no altera la estructura del gen
endógeno
Su eficiencia no es comprometida
por la presencia de núcleos no
transformados o de genes
POR QUE UTILIZAR
RNAi - VENTAJAS
Silenciamiento
de alta especificidad
Silenciamiento simultáneo
de secuencias conservadas
(familias multigénicas)
POR QUE UTILIZAR RNAi - VENTAJAS
Silenciamiento sistémico
Plamodesmatas
Diliporo
Proteínas transmembranas
Plantas
Basidiomicetos
C. elegans
POR QUE UTILIZAR RNAi - VENTAJAS
Amplificación del silenciamiento
LO QUE YÁ HICIMOS
Determinación de la
operacionalidad del
silenciamiento génico
por RNAi en
M. perniciosa, usando o
gen gfp, como modelo
PROYECTO DE SECUENCIAMIENTO DEL GENOMA DE Moniliophthora perniciosa
(http://www.lge.ibi.unicamp.br/vassoura)
Cerca de 39 Mbp y 14.000 genes predichos
Secuencias identificadas en el banco de dados del genoma de
M. perniciosa que tienen homología con genes vinculados al
mecanismo de RNAi
Gene
Organismo c/
homologia
Proteína
Valor E
Qde-1
N. crassa
RdRP
2e-04
QDE3
N. crassa
qde-3
6e-15
(RecQ DNAhelicase)
CAF
Arabidopsis
CAF
3e-12
(endoribonuclease dicer homolog)
SDE3
Arabdopsis
RNA helicase
4e-24
Producción de una linaje transgénica de M. perniciosa
que expresa el gen heterólogo gfp
Vector usado en la transformación
de M. perniciosa
hph
pHSP70-SG (Spellig et al. 1996)
Dra. Regine Kahmann, Munchen, Germany
Transfixión del vector pHSP70-SG para protoplastos de M.
perniciosa por el método PEG/CaCl2
B
A
C
D
E
A. Protoplastos, micrografía de fase de contraste 400X. B Hifa parecida con
tubo de germinación saliendo directamente de una simple célula esférica. C e
D. Algunos protoplastos agregados en el proceso de regeneración,
contribuyendo para la formación de micelio. E. Desenvolvimiento de hifas en
un estado mas avanzado.
Transformación de M. perniciosa con el gen repórter gfp
Expresión de gfp - linajes control y transformante
Transformación de M. perniciosa con el gen repórter gfp
Expresión de gfp – linaje transformante
Transformación de M. perniciosa con el gen
repórter gfp
Expresión de gfp – linaje transformante
SILENCIAMIENTO DEL GEN gfp POR RNAi
Estrategia para síntesis de dsRNAs
lacZ
ddt
ddt T7 promoter
gfp sense
NcoI
MCS EcoRI
lacZ
ddt
MCS EcoRI
MCS
gfp antisense
NcoI
ddt
T7 promoter
MCS
Plasmid Template - Estrategia para obtención de gfp (Plasmid Template)
en las orientaciones senso y antisenso para síntesis de gfpdsRNAs,
usando o MEGAscript RNAi Kit transcription reaction.
Silenciamiento del gen repórter gfp por RNAi
A
CT
.
T1
B
T3.
T2
T4
T5.
T6
Diagnóstico del silenciamiento usando RT-qPCR. Expresión relativa de gfp
en linajes transgénicas de M. perniciosa tratadas con gfpdsRNA (51 – 97%).
LO QUE YÁ HICIMOS
Silenciamiento de genes
endógenos de M. perniciosa
por RNAi, visando análisis
funcional
SILENCIAMIENTO DEL GEN MpHyD DE M.
perniciosa POR RNAi PARA ESTUDIO FUNCIONAL
SILENCIAMIENTO DEL GEN MpHyd
Estrategia para síntesis de dsRNAs
lacZ
MpHYD3 antisense
T7 promoter
SalI
SalI
SalI
SalI
MCS
lacZ
T7 promoter
MCS
MpHYD3 sense
Sp6
MCS
Sp6
SalI
SalI
MCS
Plasmid Template - Estrategia para obtención de MpHyd en las orientaciones senso y antisenso para la síntesis de MpHyddsRNAs usando o
MEGAscript RNAi Kit transcription reaction.
SILENCIAMIENTO DEL GEN MpHyd
2,0
Expresión relativa de MpHyd en linajes control y tratadas con
MpHyddsRNA vía PEG/CaCl2 (18 a 97%)
1,0
0,5
Hd5
Hd5
Hd5
Hd5
Hd5
Hd4
Hd4
Hd4
Hd4
Hd4
Hd2
Hd2
Hd2
Hd2
Hd2
Hd1
Hd1
0,0
Hd1
Hd1
Hd1
RQ
1,5
CT T1 T2 T3 T10 CT T1 T2 T3 T10 CT T1 T2 T3 T10 CP T1 T2 H3T10
Lines M. perniciosa
SILENCIAMENTO DO GENE MpHyd
2,0
RQ
1,5
1,0
0,5
Hd5
Hd5
Hd5
Hd5
Hd4
Hd4
Hd4
Hd4
Hd2
Hd2
Hd2
Hd2
Hd1
Hd1
Hd1
Hd1
0,0
CT T2 T4 T6 CT T2 T4 T6 CT T2 T4 T6 CT T2 T4 T6
Lines M. perniciosa
Expresión relativa de MpHyd en
linajes control y tratadas con
Fenotipo
MpHyddsRNA vía electroporación
(89 a 97%)
SILENCIAMENTO DO GENE MpPrix1 POR RNAi
Estrategia para síntesis de dsRNAs
T7
PDNR-LIB
MpPRIX1 sense
MpPRIX1
MpPRIX1 antisense
PDNR-LIB
T7
Estrategia para obtener MpPrix1 (PCR Template) en las
orientaciones senso y antisenso para síntesis de
MpPrix1dsRNAs, usando MEGAscript RNAi Kit transcription reaction.
Silenciamiento del gen MpPrix1 por RNAi
Expresión relativa de MpPrix1 en linajes
control y tratadas con MpPrix1dsRNA (23
a 87%).
Actividad de la enzima 1 cys-peroxidase en
linajes control y tratadas con MpPrix1dsRNA
Curva de sobrevivencia de linajes control y tratadas con MpPrix1dsRNA expuestas a H2O2
LO QUE ESTAMOS HACIENDO
Proyecto “Rede Cacau Renorbio – Vassoura de Bruxa”
 Proyecto interinstitucional (FINEP, FUNPAB, CEPLAC,
UESC, CENA-USP, CENERGEN-EMBRAPA, UNICAMP)
Coordinador: Dr. José Luis Pires (CEPLAC)
Vice-coordinador: Dr. Raúl René Valle (CEPLAC)
 Sub-proyecto: Silenciamiento génico y control del fitopatógeno Moniliophthora perniciosa por RNAi
Coordinadora: Dra. Ana Cristina Caribé (UESC)
Investigadores:
Dres. Raúl René Valle (CEPLAC), Carlos Pirovani (UESC);
Dras. Karina Gramacho (CEPLAC), Acássia Pires (UESC),
Virginia Soares (UESC), Fátima Alvim (UESC)
Sub-proyecto: Silenciamiento génico y
control del fitopa-tógeno Moniliophthora
perniciosa por RNAi
Producir biofungicida a base de moléculas
de
RNA
duplo
filamento
(dsRNAs)
homólogos a genes esenciales a procesos
relacionados
al
desenvolvimiento
patogenicidad de M. perniciosa
y
 Sub-proyecto: Silenciamiento génico y control del fitopatógeno Moniliophthora perniciosa por RNAi
Acción de Pesquisa 1. Realizar identificación y silenciamiento por RNAi
de genes de M. perniciosa esenciales a: infección, crecimiento, nutrición,
reproducción y patogenicidad
Genes candidatos a silenciamiento por el método dsRNA.
Gen
Organismos
Función probable
Síntesis de quitina - pared
Sintase de quitina (CHS3) Pleurotus, Agaricus
celular de fungos
Laccaria, Coprinopsis Formación de septos
Septina (SEP/CDC/SPR)
Trehalose fosfato sintase
Síntesis de trehalose - azúcar
Pleurotus, Grifola
(TPS1/TPS2)
que regula turgencia.
Previene la acumulación de
Aspergillus
Catalasa (CTA1/CTT1)
niveles tóxicos de H2O2
Moniliolisinas (Mp-AaPri1
Pleurotus, Agrocybe
Formación del hongo
e MpPri2)
Coprinopsis, Postia
Glucanasa (EGT)
Degradación de celulosa
Formación de película
Coprinopsis,
Hidrofobinas (CoH1)
hidrofóbica en la superficie
Lentinula
de hifas
 Sub-proyecto: Silenciamiento génico y control del fitopatógeno Moniliophthora perniciosa por RNAi
Acción de Pesquisa 2. Síntesis de vehículos para protección y
entrega de dsRNAi en el hongo Moniliophthora perniciosa, in vivo
1. Síntesis de microesferas de quitosana:
Síntesis de microesferas de quitosana utilizando el
método de coacervación (ARAL et al., 2000; BERTHOLD et al.,
1996).
2. Síntesis de liposomas:
Síntesis de vesículas unilamelares grandes (LUVs), a
partir de la extrusión de la dispersión lipídica del lipidio
catiónico
bromato
de
dioctadecildimetilamonio
(DODAB) en solución acuosa conteniendo el dsRNA
albo.
 Sub-proyecto: Silenciamiento génico y control del fitopatógeno Moniliophthora perniciosa por RNAi
Acción de Pesquisa 2. Síntesis de vehículos para protección y
entrega de dsRNAi en el hongo Moniliophthora perniciosa, in vivo
3. Síntesis de cápsides virales: técnica de VIGS
(vírus-induced gene silencing)
Vectores virales - El genoma viral será modificado
removiendo genes de patogenicidad y insiriendo genes o
secuencias que codifiquen moléculas de dsRNA
correspondientes a los albos a ser silenciados
 Sub-proyecto: Silenciamiento génico y control del fitopatógeno Moniliophthora perniciosa por RNAi
Acción de Pesquisa 3. Elaborar biofungicida a base de dsRNAs
homólogos a genes esenciales al desenvolvimiento o patogenicidad de M. perniciosa
 Producción de la formulación del biofungicida, suspensión concentrada(SC)
 Establecimiento del procedimiento para aplicación del biofungicida a base de dsRNAs:
por aspersión o inyección (concentración del
fungicida; equipo para aplicación; período y
condiciones climáticas para aplicación, etc.)
Acción de Pesquisa 3. Elaborar biofungicida a base de
dsRNAs homólogos a genes esenciales al desenvolvimiento
o patogenicidad de M. perniciosa
 Prueba de eficiencia del fungicida en invernadero con clones de cacao con padrones de
resistencia y susceptibilidad e inoculados con
basiodiosporas de M. perniciosa (1,0X105 basiodiosporas viables/mL)
 Observación y análisis del desenvolvimiento
del hongo y síntomas producidos
GRACIAS