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LA ACTIVACIÓN DE LA VÍA DE SEÑALES
WNT POR INHIBICIÓN EPIGENÉTICA DE
SUS GENES REPRESORES SE ASOCIA AL
PRONÓSTICO DE LA LMA
Vía Wnt
 La vía de señalización Wnt es una de las rutas que comunica la
membrana con el núcleo celular.
 Desarrollo y diferenciación de tejidos y órganos en embriones.
 Mecanismos de auto-renovación, diferenciación y proliferación de las
células madre hematopoyéticas.
 El genoma humano tiene al menos 20 genes que codifican para
proteínas Wnt: glipoproteínas secretadas que regulan los procesos
implicados en el desarrollo y son las que inician la cascada de señales.
Vía Wnt
INACTIVA
ACTIVA
CICLINA D1 / C-Myc
CICLINA D1 / C-Myc
Vía Wnt
La vía Wnt se puede encontrar desregulada por alteración de los
componentes de la vía:
Gen
Enfermedad
Referencia
WNT1
Cáncer de mama murino
Nurses & Varnus 1982
APC
Cáncer de colon
Polakis, 1997
AXINA-1
Carcinoma hepotocelular
Clevers, 2000
Β-catenina
Cáncer de colon y melanomas
Su, 1993 & Rubinfeld 1993
LRP5
Defectos de la densidad ósea
Boyden et al. 2002
Axina 2
Formación de los dientes
Lammi et al. 2004
Vía Wnt
La vía Wnt en LMA
Constitutive activation of the Wnt/b-catenin signalling pathway in acute myeloid leukaemia.
Simon et al. Oncogene. 2005
Translocation products in acute myeloid leukemia activate the Wnt signalling pathway in hematopoietic
cells. Müller-Tidow et al. Mol Cell Biology. 2005
Flt3 tandem deplicarion mutations cooperate with Wnt signalling in leukemic signal transduction.
Tickenbrock et al. Blood. 2006
Inhibidores / Activadores Wnt
20 LLA + 32 LPA + 50 LMA
Chim et al. Leukemia 2006
Wif1
Metilación Wif: factor pronostico independiente en LPA
sFRPs 1 ,2 ,3 ,4 y 5
Dkk 1, 2, 3, y 4
Hdpr1
WNT16
FZD3
PCR ESPECÍFICA
DE METILACION
CON ADN
TRATADO CON
BISULFITO
RT-PCR
CUANTITATIVA EN
TIEMPO REAL
TCF1/LEF1
Ciclina-D1
Líneas celulares + 261 LLA
Román-Gómez et al. Blood 2007
Regulación epigenética de vía Wnt + Activación constitutiva de vía Wnt
Hipótesis
La activación de la vía Wnt ocurre en muchos tipo de cáncer,
siendo el cáncer de colon el mejor estudiado. Esta desregulación
ocurre por la alteración de los componentes de la vía Wnt o sus
genes antagonistas.
En la LLA uno de los mecanismos que alteran los genes
antagonistas de la vía Wnt es la metilación.
En la LMA se ha demostrado que la vía Wnt se encuentra activada
de forma constitutiva. Nos proponemos investigar si la metilación
de algunos de los genes antagonistas es responsable en parte de
esta activación.
Objetivos
 Determinar si los genes represores-Wnt se inactivan
por metilación en la LMA.
 Determinar si dicha metilación activa la vía de señales
Wnt.
 Determinar
el
papel
de
la
patogénesis y pronóstico de la LMA.
metilación
en
la
Material y Métodos
Pacientes
 184 LMA al diagnóstico
 110 hombres y 74 mujeres
 Mediana de edad: 60 años (extremos 16 – 92)
 Mediana de leucocitos: 9.4 x 109/L (extremos 0.6 – 620)
 Clasificación FAB: 14 M0; 45 M1; 48 M2; 26 M4; 27 M5;
18 M6; 2 M7; 4 Otros
 164 casos citogenética valorable:
15 grupo riesgo citogenético FAVORABLE
111 grupo riesgo citogenético INTERMEDIO
38 grupo riesgo citogenético ADVERSO
Material y Métodos
Modificación química del ADN
NaOH + Hidroquinona + Bisulfito sódico
55ºC o/n
MSP-PCR
Control negativo
 Primers específicos metilación:
sFRP1, sFRP2, sFRP4, sFRP5, DKK1 y DKK3
 Plataforma LIGHTCYCLER
 Sybr Green
Niveles de expresión
 Primers específicos: CICLINAD1, TCF1 y LEF1
 Plataforma LIGHTCYCLER
 Sybr Green
Control positivo
Material y Métodos
Sybr Green
Material y Métodos
Modificación química del ADN
NaOH + Hidroquinona + Bisulfito sódico
55ºC o/n
MSP-PCR
Control negativo
 Primers específicos metilación:
sFRP1, sFRP2, sFRP4, sFRP5, DKK1 y DKK3
 Plataforma LIGHTCYCLER
 Sybr Green
Niveles de expresión
 Primers específicos: CICLINAD1, TCF1 y LEF1
 Plataforma LIGHTCYCLER
 Sybr Green
Control positivo
Resultados
I. Porcentaje de metilación de los genes antagonistas de la vía Wnt
Metilación Antagonistas WNT
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
41
32
31
22
16
4
sFRP-1
DKK-1
sFRP-2
sFRP-5
DKK-3
sFRP-4
 Los genes antagonistas de la vía Wnt están metilados en la LMA
Resultados
I. Porcentaje de metilación de los genes antagonistas de la vía Wnt
Nº Genes Metilados
40
35
30
25
20
15
10
5
0
36
20
21
15
6
2
1
0 GENES 1 GENES 2 GENES 3 GENES 4 GENES 5 GENES 6 GENES
 Los genes antagonistas de la vía Wnt están metilados en la LMA
Resultados
I. Porcentaje de metilación de los genes antagonistas de la vía Wnt
Péfil de Metilación
64
70
60
50
40
36
30
20
10
0
0 GENES
1-6 GENES
 Los genes antagonistas de la vía Wnt están metilados en la LMA
 La metilación aberrante es un evento frecuente en la LMA: el 64% de los
pacientes presentan algún gen metilado
Resultados
II. Sobre-expresión de los genes de la vía Wnt
n=37
0 gen
1-6 gen
n=40
0 gen
1-6 gen
n=31
0 gen
1-6 gen
↓ TCF1
9
17
↓ CD1
10
22
↓ LEF1
5
18
↑ TCF1
0
11
↑ CD1
0
8
↑ LEF1
0
8
 La sobre-expresión de genes de vía Wnt ocurre entre los pacientes con fenotipo
metilador
0.014
0.002
0.01
 Los niveles medios de expresión de los genes de vía Wnt fueron significativamente
más alta en los pacientes con fenotipo metilador
Resultados
III. Relación de la metilación aberrante de los genes antagonistas de Wnt
con las características clínico-biológicas de los pacientes
sFRP1
sFRP2
sFRP4
sFRP5
DKK1
DKK3
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
FLT3ITD+
62
38
69
31
96
4
73
27
69
31
87
13
58
42
n.s
NPM1+
60
40
68
32
84
16
80
20
80
20
75
25
52
48
n.s
> 60
61
39
52
46
98
2
76
24
67
33
84
16
59
41
n.s
< 60
57
43
48
52
95
5
80
20
70
30
85
15
54
46
56
44
61
59
96
4
74
26
64
36
83
17
51
49
63
37
39
41
96
4
84
16
74
26
87
13
65
35
> 10.000
61
39
68
32
96
4
80
20
68
32
84
16
59
41
< 10.000
57
43
70
30
96
4
76
24
68
32
85
15
54
46
Perfil
+
p valor
EDAD
SEXO
Hombre
Mujer
LEUCOS
CITOGEN
n.s
n.s
0.015
Fav
53
47
80
20
100
0
73
27
67
33
87
13
67
33
Int
58
42
66
44
97
3
83
17
68
32
86
14
58
42
Adv
68
32
63
37
97
3
60
40
68
32
84
16
47
53
n.s
Resultados
III. Relación de la metilación aberrante de los genes antagonistas de Wnt
con las características clínico-biológicas de los pacientes
sFRP1
sFRP2
-
+
-
+
-
RC (1º ciclo)
52
52
51
56
RC (2º ciclo)
8
5
9
RESISTENC
22
22
MUERTE
17
22
p valor
n.s
Perfil
sFRP5
DKK1
+
-
+
-
+
-
+
52
75
54
46
53
49
53
48
2
7
0
8
3
8
4
8
4
23
18
22
25
17
40
20
27
20
35
17
25
19
0
20
11
18
20
19
13
n.s
sFRP4
n.s
0.03
n.s
DKK3
n.s
-
+
55
48
9
3
20
26
16
23
n.s
Resultados
IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los
genes antagonistas de Wnt en la LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE
Serie Total
Supervivencia Global
1,0
0.004
Supervivencia acum
,8
,6
,4
0-1
,2
2-6
0,0
0
20
40
60
Meses
80
100
120
Resultados
IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los
genes antagonistas de Wnt en la LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE
Serie Total
SLE
1,0
0.06
Supervivencia acum
,8
,6
,4
,2
0-1
2-6
0,0
0
20
40
60
Meses
80
100
120
Resultados
IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los
genes antagonistas de Wnt en la LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE
Serie Total
SLR
1,2
0.2
Supervivencia acum
1,0
,8
,6
,4
0-1
,2
2-6
0,0
0
Meses
20
40
60
80
100
120
Resultados
IV. Papel pronóstico de características clínico-biológicas relevantes en la
LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE
Serie Total
SG
EDAD
< 0.001
FLT3-ITD
0.1
NPM1
0.4
FLT3ITD + NPM1
0.06
SEXO
0.6
LEUCOS > 10.000
0.1
FAB
0.5
RC1º / RC2º
0.6
CITOGENETICA
0.008
sFRP1
0.01
sFRP2
0.7
sFRP4
0.1
sFRP5
0.03
DKK1
0.8
DKK3
0.2
Resultados
IV. Papel pronóstico de características clínico-biológicas relevantes en la
LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE
Serie Total
SLE
EDAD
< 0.001
FLT3-ITD
0.03
NPM1
0.4
FLT3ITD + NPM1
0.01
SEXO
0.2
LEUCOS > 10.000
0.2
FAB
0.5
RC1º / RC2º
0.3
CITOGENETICA
0.008
sFRP1
0.08
sFRP2
0.5
sFRP4
0.1
sFRP5
0.7
DKK1
0.6
DKK3
0.2
Resultados
IV. Papel pronóstico de características clínico-biológicas relevantes en la
LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE
Serie Total
SLR
EDAD
FLT3-ITD
NPM1
0.1
0.005
0.3
FLT3ITD + NPM1
0.003
SEXO
0.09
LEUCOS > 10.000
0.1
FAB
0.8
RC1º / RC2º
0.5
CITOGENETICA
0.1
sFRP1
0.08
sFRP2
0.4
sFRP4
0.8
sFRP5
0.7
DKK1
0.3
DKK3
0.3
Resultados
IV.I Papel pronóstico de la metilación aberrante de los genes antagonistas
de Wnt en la LMA
SG: Menor 60 años & Cariotipo Intermedio
SG - sFRP2
SG - sFRP1
SG - sFRP4
1,0
1,0
1,0
0.5
0.03
0.09
,6
,4
,8
Supervivencia acum
,8
Supervivencia acum
Supervivencia acum
,8
,6
,4
,4
,2
,2
0,0
,2
0
20
40
60
80
100
0,0
0
120
20
40
60
80
100
120
,4
,4
Meses
80
100
120
2-6
,4
,2
0,0
0,0
60
0-1
,6
,2
0,0
120
,8
,6
,2
100
0.035
0.8
Supervivencia acum
Supervivencia acum
,6
80
SG - DKK3
,8
,8
60
1,0
0.04
40
40
Meses
1,0
1,0
20
20
SG - DKK1
SG - sFRP5
0
0
Meses
Meses
Supervivencia acum
,6
0
20
40
60
Meses
80
100
120
0
20
40
60
Meses
80
100
120
Resultados
IV.I Papel pronóstico de la metilación aberrante de los genes antagonistas
de Wnt en la LMA
SLE: Menor 60 años & Cariotipo Intermedio
SLE - sFRP1
1,0
SLE - sFRP2
1,0
0.05
,9
,6
,5
,4
,3
,6
,4
,2
,6
,4
,2
,2
,1
,0
0,0
0
20
40
60
80
100
120
0,0
0
20
40
SLE
60
80
100
120
1,0
,8
,4
120
0.14
,4
,6
,4
,2
0,0
,2
0,0
SLE
100
,8
,6
,2
80
80
1,0
0.9
Supervivencia acum
Supervivencia acum
,6
60
60
SLE - DKK3
,8
40
40
SLE - DKK1
1,0
20
20
Meses
0.04
0
0
Meses
0-1
SLE - sFRP5
Supervivencia acum
0.14
,8
Supervivencia acum
,7
Supervivencia acum
0.6
,8
Supervivencia acum
,8
SLE - sFRP4
1,0
100
120
0,0
0
20
40
60
Meses
80
100
120
0
20
40
60
Meses
80
100
120
2-6
Resultados
IV.I Papel pronóstico de la metilación aberrante de los genes antagonistas
de Wnt en la LMA
SLR: Menor 60 años & Cariotipo Intermedio
SLR - sFRP1
0.15
0.02
0.68
,9
,8
,8
,7
,6
,5
,4
,3
Supervivencia acum
,8
Supervivencia acum
Supervivencia acum
1,0
1,0
,9
,7
,6
,5
,4
,3
,2
,2
,1
,1
,0
20
40
60
80
100
120
,6
,4
,2
0,0
,0
0
0
20
40
Meses
60
80
100
0
120
20
40
SLR - DKK1
,9
,6
,5
,4
,3
,6
,4
,2
,2
0-1
2-6
,8
Supervivencia acum
Supervivencia acum
,7
120
0.6
,9
,8
,8
100
1,0
0.9
0.03
1,0
80
SLR - DKK3
1,0
1,1
60
Meses
Meses
SLR - sFRP5
Supervivencia acum
SLR - sFRP4
SLR - sFRP2
1,0
,7
,6
,5
,4
,3
,2
,1
,1
0,0
,0
0
20
40
60
80
100
120
Meses
,0
0
20
40
60
Meses
80
100
120
0
20
40
60
Meses
80
100
120
Resultados
IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los
genes antagonistas de Wnt en la LMA
Menor 60 años & Cariotipo Intermedio
Supervivencia Global
1,0
0.005
Supervivencia acum
,8
,6
,4
,2
0-1
2-6
0,0
0
20
40
60
Meses
80
100
120
Resultados
IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los
genes antagonistas de Wnt en la LMA
Menor 60 años & Cariotipo Intermedio
SLE
1,0
0.001
Supervivencia acum
,8
,6
,4
,2
0-1
2-6
0,0
0
20
40
60
Meses
80
100
120
Resultados
IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los
genes antagonistas de Wnt en la LMA
Menor 60 años & Cariotipo Intermedio
SLR
1,0
0.03
Supervivencia acum
,8
,6
,4
,2
0-1
0,0
2-6
0
20
40
60
Meses
80
100
120
Conclusiones

Los genes antagonistas de la vía Wnt están metilados en la
LMA. El 64% de los pacientes presenta algún gen metilado.
 Los niveles medios de expresión de los genes de vía Wnt
fueron significativamente más alta en los pacientes con fenotipo
metilador.
 La metilación aberrante de los genes antagonistas de Wnt se
asocia a la activación de la Vía Wnt en pacientes con LMA.
Conclusiones
 La metilación de los genes no se asoció a las características
clínico-biológicas de los pacientes. Excepto sFRP5 que se
asoció al grupo de riesgo citogenético adverso y a la resistencia
tras la inducción.
 El fenotipo metilador se asocia al subgrupo de mal pronóstico
en los pacientes jóvenes pertenecientes al grupo de riesgo
citogenético intermedio.
 En el análisis univariante el gen sFRP5 se asocio a un mayor
riesgo de recaída.
Próximos experimentos
Estudio in vitro en 4 líneas celulares de LMA:
KASUMI-1: FAB-M2; t (8;21)
KG1A: FAB-M6
TPH1: FAB-M5; t (9;11)
HL60: FAB-M2 (c-myc)
METILACIÓN Y EXPRESIÓN
AZA
METILACIÓN Y EXPRESIÓN
DE GENES ANTAGONISTAS
DE GENES ANTAGONISTAS
EXPRESIÓN DE CD1, TCF1 Y
EXPRESIÓN DE CD1, TCF1 Y
LEF1
LEF1