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LA ACTIVACIÓN DE LA VÍA DE SEÑALES WNT POR INHIBICIÓN EPIGENÉTICA DE SUS GENES REPRESORES SE ASOCIA AL PRONÓSTICO DE LA LMA Vía Wnt La vía de señalización Wnt es una de las rutas que comunica la membrana con el núcleo celular. Desarrollo y diferenciación de tejidos y órganos en embriones. Mecanismos de auto-renovación, diferenciación y proliferación de las células madre hematopoyéticas. El genoma humano tiene al menos 20 genes que codifican para proteínas Wnt: glipoproteínas secretadas que regulan los procesos implicados en el desarrollo y son las que inician la cascada de señales. Vía Wnt INACTIVA ACTIVA CICLINA D1 / C-Myc CICLINA D1 / C-Myc Vía Wnt La vía Wnt se puede encontrar desregulada por alteración de los componentes de la vía: Gen Enfermedad Referencia WNT1 Cáncer de mama murino Nurses & Varnus 1982 APC Cáncer de colon Polakis, 1997 AXINA-1 Carcinoma hepotocelular Clevers, 2000 Β-catenina Cáncer de colon y melanomas Su, 1993 & Rubinfeld 1993 LRP5 Defectos de la densidad ósea Boyden et al. 2002 Axina 2 Formación de los dientes Lammi et al. 2004 Vía Wnt La vía Wnt en LMA Constitutive activation of the Wnt/b-catenin signalling pathway in acute myeloid leukaemia. Simon et al. Oncogene. 2005 Translocation products in acute myeloid leukemia activate the Wnt signalling pathway in hematopoietic cells. Müller-Tidow et al. Mol Cell Biology. 2005 Flt3 tandem deplicarion mutations cooperate with Wnt signalling in leukemic signal transduction. Tickenbrock et al. Blood. 2006 Inhibidores / Activadores Wnt 20 LLA + 32 LPA + 50 LMA Chim et al. Leukemia 2006 Wif1 Metilación Wif: factor pronostico independiente en LPA sFRPs 1 ,2 ,3 ,4 y 5 Dkk 1, 2, 3, y 4 Hdpr1 WNT16 FZD3 PCR ESPECÍFICA DE METILACION CON ADN TRATADO CON BISULFITO RT-PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL TCF1/LEF1 Ciclina-D1 Líneas celulares + 261 LLA Román-Gómez et al. Blood 2007 Regulación epigenética de vía Wnt + Activación constitutiva de vía Wnt Hipótesis La activación de la vía Wnt ocurre en muchos tipo de cáncer, siendo el cáncer de colon el mejor estudiado. Esta desregulación ocurre por la alteración de los componentes de la vía Wnt o sus genes antagonistas. En la LLA uno de los mecanismos que alteran los genes antagonistas de la vía Wnt es la metilación. En la LMA se ha demostrado que la vía Wnt se encuentra activada de forma constitutiva. Nos proponemos investigar si la metilación de algunos de los genes antagonistas es responsable en parte de esta activación. Objetivos Determinar si los genes represores-Wnt se inactivan por metilación en la LMA. Determinar si dicha metilación activa la vía de señales Wnt. Determinar el papel de la patogénesis y pronóstico de la LMA. metilación en la Material y Métodos Pacientes 184 LMA al diagnóstico 110 hombres y 74 mujeres Mediana de edad: 60 años (extremos 16 – 92) Mediana de leucocitos: 9.4 x 109/L (extremos 0.6 – 620) Clasificación FAB: 14 M0; 45 M1; 48 M2; 26 M4; 27 M5; 18 M6; 2 M7; 4 Otros 164 casos citogenética valorable: 15 grupo riesgo citogenético FAVORABLE 111 grupo riesgo citogenético INTERMEDIO 38 grupo riesgo citogenético ADVERSO Material y Métodos Modificación química del ADN NaOH + Hidroquinona + Bisulfito sódico 55ºC o/n MSP-PCR Control negativo Primers específicos metilación: sFRP1, sFRP2, sFRP4, sFRP5, DKK1 y DKK3 Plataforma LIGHTCYCLER Sybr Green Niveles de expresión Primers específicos: CICLINAD1, TCF1 y LEF1 Plataforma LIGHTCYCLER Sybr Green Control positivo Material y Métodos Sybr Green Material y Métodos Modificación química del ADN NaOH + Hidroquinona + Bisulfito sódico 55ºC o/n MSP-PCR Control negativo Primers específicos metilación: sFRP1, sFRP2, sFRP4, sFRP5, DKK1 y DKK3 Plataforma LIGHTCYCLER Sybr Green Niveles de expresión Primers específicos: CICLINAD1, TCF1 y LEF1 Plataforma LIGHTCYCLER Sybr Green Control positivo Resultados I. Porcentaje de metilación de los genes antagonistas de la vía Wnt Metilación Antagonistas WNT 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 41 32 31 22 16 4 sFRP-1 DKK-1 sFRP-2 sFRP-5 DKK-3 sFRP-4 Los genes antagonistas de la vía Wnt están metilados en la LMA Resultados I. Porcentaje de metilación de los genes antagonistas de la vía Wnt Nº Genes Metilados 40 35 30 25 20 15 10 5 0 36 20 21 15 6 2 1 0 GENES 1 GENES 2 GENES 3 GENES 4 GENES 5 GENES 6 GENES Los genes antagonistas de la vía Wnt están metilados en la LMA Resultados I. Porcentaje de metilación de los genes antagonistas de la vía Wnt Péfil de Metilación 64 70 60 50 40 36 30 20 10 0 0 GENES 1-6 GENES Los genes antagonistas de la vía Wnt están metilados en la LMA La metilación aberrante es un evento frecuente en la LMA: el 64% de los pacientes presentan algún gen metilado Resultados II. Sobre-expresión de los genes de la vía Wnt n=37 0 gen 1-6 gen n=40 0 gen 1-6 gen n=31 0 gen 1-6 gen ↓ TCF1 9 17 ↓ CD1 10 22 ↓ LEF1 5 18 ↑ TCF1 0 11 ↑ CD1 0 8 ↑ LEF1 0 8 La sobre-expresión de genes de vía Wnt ocurre entre los pacientes con fenotipo metilador 0.014 0.002 0.01 Los niveles medios de expresión de los genes de vía Wnt fueron significativamente más alta en los pacientes con fenotipo metilador Resultados III. Relación de la metilación aberrante de los genes antagonistas de Wnt con las características clínico-biológicas de los pacientes sFRP1 sFRP2 sFRP4 sFRP5 DKK1 DKK3 - + - + - + - + - + - + - FLT3ITD+ 62 38 69 31 96 4 73 27 69 31 87 13 58 42 n.s NPM1+ 60 40 68 32 84 16 80 20 80 20 75 25 52 48 n.s > 60 61 39 52 46 98 2 76 24 67 33 84 16 59 41 n.s < 60 57 43 48 52 95 5 80 20 70 30 85 15 54 46 56 44 61 59 96 4 74 26 64 36 83 17 51 49 63 37 39 41 96 4 84 16 74 26 87 13 65 35 > 10.000 61 39 68 32 96 4 80 20 68 32 84 16 59 41 < 10.000 57 43 70 30 96 4 76 24 68 32 85 15 54 46 Perfil + p valor EDAD SEXO Hombre Mujer LEUCOS CITOGEN n.s n.s 0.015 Fav 53 47 80 20 100 0 73 27 67 33 87 13 67 33 Int 58 42 66 44 97 3 83 17 68 32 86 14 58 42 Adv 68 32 63 37 97 3 60 40 68 32 84 16 47 53 n.s Resultados III. Relación de la metilación aberrante de los genes antagonistas de Wnt con las características clínico-biológicas de los pacientes sFRP1 sFRP2 - + - + - RC (1º ciclo) 52 52 51 56 RC (2º ciclo) 8 5 9 RESISTENC 22 22 MUERTE 17 22 p valor n.s Perfil sFRP5 DKK1 + - + - + - + 52 75 54 46 53 49 53 48 2 7 0 8 3 8 4 8 4 23 18 22 25 17 40 20 27 20 35 17 25 19 0 20 11 18 20 19 13 n.s sFRP4 n.s 0.03 n.s DKK3 n.s - + 55 48 9 3 20 26 16 23 n.s Resultados IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los genes antagonistas de Wnt en la LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE Serie Total Supervivencia Global 1,0 0.004 Supervivencia acum ,8 ,6 ,4 0-1 ,2 2-6 0,0 0 20 40 60 Meses 80 100 120 Resultados IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los genes antagonistas de Wnt en la LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE Serie Total SLE 1,0 0.06 Supervivencia acum ,8 ,6 ,4 ,2 0-1 2-6 0,0 0 20 40 60 Meses 80 100 120 Resultados IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los genes antagonistas de Wnt en la LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE Serie Total SLR 1,2 0.2 Supervivencia acum 1,0 ,8 ,6 ,4 0-1 ,2 2-6 0,0 0 Meses 20 40 60 80 100 120 Resultados IV. Papel pronóstico de características clínico-biológicas relevantes en la LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE Serie Total SG EDAD < 0.001 FLT3-ITD 0.1 NPM1 0.4 FLT3ITD + NPM1 0.06 SEXO 0.6 LEUCOS > 10.000 0.1 FAB 0.5 RC1º / RC2º 0.6 CITOGENETICA 0.008 sFRP1 0.01 sFRP2 0.7 sFRP4 0.1 sFRP5 0.03 DKK1 0.8 DKK3 0.2 Resultados IV. Papel pronóstico de características clínico-biológicas relevantes en la LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE Serie Total SLE EDAD < 0.001 FLT3-ITD 0.03 NPM1 0.4 FLT3ITD + NPM1 0.01 SEXO 0.2 LEUCOS > 10.000 0.2 FAB 0.5 RC1º / RC2º 0.3 CITOGENETICA 0.008 sFRP1 0.08 sFRP2 0.5 sFRP4 0.1 sFRP5 0.7 DKK1 0.6 DKK3 0.2 Resultados IV. Papel pronóstico de características clínico-biológicas relevantes en la LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE Serie Total SLR EDAD FLT3-ITD NPM1 0.1 0.005 0.3 FLT3ITD + NPM1 0.003 SEXO 0.09 LEUCOS > 10.000 0.1 FAB 0.8 RC1º / RC2º 0.5 CITOGENETICA 0.1 sFRP1 0.08 sFRP2 0.4 sFRP4 0.8 sFRP5 0.7 DKK1 0.3 DKK3 0.3 Resultados IV.I Papel pronóstico de la metilación aberrante de los genes antagonistas de Wnt en la LMA SG: Menor 60 años & Cariotipo Intermedio SG - sFRP2 SG - sFRP1 SG - sFRP4 1,0 1,0 1,0 0.5 0.03 0.09 ,6 ,4 ,8 Supervivencia acum ,8 Supervivencia acum Supervivencia acum ,8 ,6 ,4 ,4 ,2 ,2 0,0 ,2 0 20 40 60 80 100 0,0 0 120 20 40 60 80 100 120 ,4 ,4 Meses 80 100 120 2-6 ,4 ,2 0,0 0,0 60 0-1 ,6 ,2 0,0 120 ,8 ,6 ,2 100 0.035 0.8 Supervivencia acum Supervivencia acum ,6 80 SG - DKK3 ,8 ,8 60 1,0 0.04 40 40 Meses 1,0 1,0 20 20 SG - DKK1 SG - sFRP5 0 0 Meses Meses Supervivencia acum ,6 0 20 40 60 Meses 80 100 120 0 20 40 60 Meses 80 100 120 Resultados IV.I Papel pronóstico de la metilación aberrante de los genes antagonistas de Wnt en la LMA SLE: Menor 60 años & Cariotipo Intermedio SLE - sFRP1 1,0 SLE - sFRP2 1,0 0.05 ,9 ,6 ,5 ,4 ,3 ,6 ,4 ,2 ,6 ,4 ,2 ,2 ,1 ,0 0,0 0 20 40 60 80 100 120 0,0 0 20 40 SLE 60 80 100 120 1,0 ,8 ,4 120 0.14 ,4 ,6 ,4 ,2 0,0 ,2 0,0 SLE 100 ,8 ,6 ,2 80 80 1,0 0.9 Supervivencia acum Supervivencia acum ,6 60 60 SLE - DKK3 ,8 40 40 SLE - DKK1 1,0 20 20 Meses 0.04 0 0 Meses 0-1 SLE - sFRP5 Supervivencia acum 0.14 ,8 Supervivencia acum ,7 Supervivencia acum 0.6 ,8 Supervivencia acum ,8 SLE - sFRP4 1,0 100 120 0,0 0 20 40 60 Meses 80 100 120 0 20 40 60 Meses 80 100 120 2-6 Resultados IV.I Papel pronóstico de la metilación aberrante de los genes antagonistas de Wnt en la LMA SLR: Menor 60 años & Cariotipo Intermedio SLR - sFRP1 0.15 0.02 0.68 ,9 ,8 ,8 ,7 ,6 ,5 ,4 ,3 Supervivencia acum ,8 Supervivencia acum Supervivencia acum 1,0 1,0 ,9 ,7 ,6 ,5 ,4 ,3 ,2 ,2 ,1 ,1 ,0 20 40 60 80 100 120 ,6 ,4 ,2 0,0 ,0 0 0 20 40 Meses 60 80 100 0 120 20 40 SLR - DKK1 ,9 ,6 ,5 ,4 ,3 ,6 ,4 ,2 ,2 0-1 2-6 ,8 Supervivencia acum Supervivencia acum ,7 120 0.6 ,9 ,8 ,8 100 1,0 0.9 0.03 1,0 80 SLR - DKK3 1,0 1,1 60 Meses Meses SLR - sFRP5 Supervivencia acum SLR - sFRP4 SLR - sFRP2 1,0 ,7 ,6 ,5 ,4 ,3 ,2 ,1 ,1 0,0 ,0 0 20 40 60 80 100 120 Meses ,0 0 20 40 60 Meses 80 100 120 0 20 40 60 Meses 80 100 120 Resultados IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los genes antagonistas de Wnt en la LMA Menor 60 años & Cariotipo Intermedio Supervivencia Global 1,0 0.005 Supervivencia acum ,8 ,6 ,4 ,2 0-1 2-6 0,0 0 20 40 60 Meses 80 100 120 Resultados IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los genes antagonistas de Wnt en la LMA Menor 60 años & Cariotipo Intermedio SLE 1,0 0.001 Supervivencia acum ,8 ,6 ,4 ,2 0-1 2-6 0,0 0 20 40 60 Meses 80 100 120 Resultados IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los genes antagonistas de Wnt en la LMA Menor 60 años & Cariotipo Intermedio SLR 1,0 0.03 Supervivencia acum ,8 ,6 ,4 ,2 0-1 0,0 2-6 0 20 40 60 Meses 80 100 120 Conclusiones Los genes antagonistas de la vía Wnt están metilados en la LMA. El 64% de los pacientes presenta algún gen metilado. Los niveles medios de expresión de los genes de vía Wnt fueron significativamente más alta en los pacientes con fenotipo metilador. La metilación aberrante de los genes antagonistas de Wnt se asocia a la activación de la Vía Wnt en pacientes con LMA. Conclusiones La metilación de los genes no se asoció a las características clínico-biológicas de los pacientes. Excepto sFRP5 que se asoció al grupo de riesgo citogenético adverso y a la resistencia tras la inducción. El fenotipo metilador se asocia al subgrupo de mal pronóstico en los pacientes jóvenes pertenecientes al grupo de riesgo citogenético intermedio. En el análisis univariante el gen sFRP5 se asocio a un mayor riesgo de recaída. Próximos experimentos Estudio in vitro en 4 líneas celulares de LMA: KASUMI-1: FAB-M2; t (8;21) KG1A: FAB-M6 TPH1: FAB-M5; t (9;11) HL60: FAB-M2 (c-myc) METILACIÓN Y EXPRESIÓN AZA METILACIÓN Y EXPRESIÓN DE GENES ANTAGONISTAS DE GENES ANTAGONISTAS EXPRESIÓN DE CD1, TCF1 Y EXPRESIÓN DE CD1, TCF1 Y LEF1 LEF1