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TECNICA HISTOLÓGICA
y
MICROSCOPÍA
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ANATOMÍA e HISTOLOGÍA: permite reconocer la constitución y forma humana.
El estudio comprende: Dimensión Microscópica: HISTOLOGÍA
Dimensión Macroscópica: ANATOMÍA.
Observación Microscópica: Se realiza por medios especiales ópticos o electrónicos
que permiten la observación de detalles invisibles al ojo humano y requiere
someter el tejido a procedimientos especiales que en conjunto constituyen la
“Técnica Histológica”.
Observación Macroscópica: Se realiza sobre organismos vivos, sobre cadáveres
frescos o conservados, sobre esqueletos humanos verdaderos o artificiales ó,
sobre maquetas de cuerpos humanos. Se realiza por medio de la observación
directa del ojo humano desnudo o ayudado por lupas en ciertos casos.
La observación microscópica puede realizarse en forma inmediata o mediata.
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Inmediata: se realiza sobre el ser vivo al estado fresco, en algunos casos
recurriendo a colorantes vitales que pueden ser ácidos como el azul trípano,
azul de pirrol, carmín tritinado entre otros o básicos como el rojo neutro, verde
janus, azul de metileno, azul crecil, azul nilo, etc. La coloración vital puede ser a
su vez intravital por ingestión o inyección o supravital, la coloración se realiza
sobre el elemento vivo, pero separado del organismo o sea in-vitro.
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Mediata o post mortem:requiere una serie de pasos para conservar el material
de la descomposición natural cadavérica.
En forma resumida los pasos a seguir para la observación microscópica son:
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Obtención del material: por necropsia o biopsia.
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Fijación: para evitar descomposición y conservar las estructuras.
Fijadores físicos: Calor (llama directa, estufa) ó frío (gas carbónico).
Fijadores químicos: Simples (formol, alcohol, acetona, etc.) ó compuestos (líquido
de muller, fleming, zenquer, vastarini, etc.).
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Inclusión: para facilitar los cortes que se realizan con navajas especiales o
micrótomos. Lo más usado para inclusión es la parafina (para observación en
microscopio óptico) y celoidina (para observación en microscopio electrónico).
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Corte y primer montaje: las láminas cortadas se montan o fijan sobre un
portaobjetos.
Coloración: para magnificar diferencias y contrastes de las estructuras tisulares.
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Se utilizan:
1.
Reactivos colorantes que pueden ser:
a) Colorantes naturales de origen animal como el carmín
b) Colorantes de origen vegetal como orceína, hematoxilina, azafrán.
c) Colorantes artificiales o anilinas.
d) Colorantes indiferentes: son sustancias coloreadas que se disuelven en ciertas
partes de las células como sudán III ó escarlata R que se disuelven en las grasas.
e) Colorantes metálicos como las sales de plata y oro que se depositan en
ciertas formas tisulares.
2.
Reactivos diferenciantes: para eliminar el exceso de color en métodos de
coloración regresiva. Por ejemplo agua amoniacal para el pasaje de la
coloración de hematoxilina a la coloración con eosina.
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Conservación y segundo montaje: para la conservación se utilizan sustancias
que evitan la descomposición de los tejidos y mantienen el color de las
preparaciones como el bálsamo de canadá o el balsamo de tolú. El segundo
montaje ó montaje definitivo sería la colocación del cubreobjetos para la
conservación total del preparado.
MICROSCOPÍA:
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Entre los microscopios que se utilizan para las distintas observaciones
encontramos: Microscopio óptico, microscopio de polarización, microscopio de
contraste de fase, microscopio de interferencia, microscopio de fondo oscuro,
microscopio electrónico.
El microscopio óptico es el más utilizado. Es un microscopio basado en lentes
ópticas, también llamado microscopio de luz o de campo claro, puede ser
monocular o binocular.
Está constituido por una parte mecánica, una óptica y una de iluminación.
La parte mecánica es la que sostiene a los elementos ópticos, elementos de
iluminación y los preparados a examinar. También se lo suele llamar estativo o
montura. Está compuesto por el pie, columna, tubo, mecanismo de movimiento y
platina.
El pie es sólido y pesado, sostiene y da estabilidad al instrumento, generalmente
tiene forma de herradura y los más modernos tienen una base cuadrada donde se
incluye la fuente de luz.
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La columna es el vástago vertical que se sostiene en el pie, en su punto medio,
está destinada a ponerse en relación con el tubo del microscopio en forma directa
o mediante brazos articulados. Presenta además, el mecanismo de cremalleras,
que permite el acercamiento del preparado al objetivo, mediante los tornillos
macro y micrométricos, para dar el enfoque adecuado, gracias al desplazamiento
del objetivo o en algunos casos de la platina.
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El tubo sustenta el ocular en uno de sus extremos y el objetivo en el otro. Es un
segmento cilíndrico fijado a la columna por la cremallera (tubo móvil) o formando
cuerpo con ella (platina móvil). El ocular es la lente que corresponde al orificio
proximal donde se apoya el ojo del observador, en los microscopios modernos
permite acoplar cámaras fotográficas, proyector de láminas, etc. En el extremo
inferior o distal se atornilla la lente objetivo. Lo más habitual es el uso del sistema
de revólver, que es portador de varias lentes de distintos aumentos que con un
simple giro interponen una de las lente objetivo en el trayecto óptico. El
mecanismo de cremallera con tornillos macro y micrométricos puede desplazar
tanto al tubo como a la platina.
• La platina es una sección plana generalmente de metal, redonda o
cuadrada que en su centro tiene un orificio que permite el paso de los
rayos luminosos procedentes del sistema de iluminación, donde se coloca
el preparado a observar.
• El condensador es una lente que concentra los rayos luminosos sobre la
preparación o sea que produce un haz de luz que ilumina el objeto
estudiado.
• El diafragma es un sistema que regula la cantidad de luz que llega al
condensador.
• El Foco dirige los rayos luminosos hacia el condensador
• Básicamente el microscopio de lentes actúa como un artefacto
amplificador en dos etapas. La lente objetivo proporciona la
amplificación inicial y la ocular amplifica a su vez esta imagen primaria, o
sea que el objetivo aumenta el objeto y proyecta la imagen sobre el
ocular y el ocular aumenta aún más la imagen y la proyecta sobre la
retina del ojo del observador.
• El aumento total resultante se determina mediante el producto del
aumento del objetivo por el aumento del ocular.
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El poder de resolución: distancia mínima que debe existir entre dos puntos del
objeto para que se visualicen separados .
 Depende de la longitud de onda de la luz utilizada y de las aperturas numéricas del
objetivo y del condensador.
 La calidad de una imagen depende del poder de resolución de un microscopio.
Ojo! El ocular solo actúa aumentando la imagen del objetivo pero no mejora el
poder de resolución). En general un microscopio corriente de buena calidad, puede
dar ampliaciones de hasta 1.500 a 2.000 veces el tamaño del objeto observado, con
una resolución de 0,2 micras, aunque con los preparados de rutina habituales rara
vez excede de 0,5 micras.
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La capacidad de refracción o índice de refracción de un medio se define como la
relación entre la velocidad de la luz en el vacío y en el medio en cuestión (aire,
aceite, etc). Por lo tanto, el IR es una medida de la velocidad de dispersión de una
onda luminosa a través del medio.
La apertura numérica es una medida de la capacidad del microscopio de agrupar las
refracciones de la luz producidas por los detalles finos del objeto y se expresa como
AN= n x sen u, donde n es el índice de refracción del medio que separa el
cubreobjeto del preparado de la lente frontal del objetivo, y u es la mitad del ángulo
superior del haz de luz
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La resolución de los microscopios ópticos, suponiendo que las aberraciones
ópticas (geométricas o cromáticas) fueran despreciables, sería:
El poder de resolución es función de la NA del objetivo y el condensador y de la
longitud de onda de la luz utilizada.
Y suponiendo una λ de entre 400 y 700 nm (0,4 y 0,7 μm). Si el medio es el aire la
AN práctica máxima es de 0,95 y si el medio es aceite es de hasta 1,5 implicando
que incluso el mejor microscopio óptico está limitado a una resolución de 0,2 μm
(200 nm)
Amplificación de la imagen observada
Microscopio óptico
TEJIDOS FUNDAMENTALES
Revestimiento
EPITELIAL Glandular
Neuroepitelio
Conectivo propiamente dicho
CONECTIVO
De sostén
Cartílago
Hueso
Hematopoyético
Mieloideo
Linfoideo
MUSCULAR
Estriado
Liso
Cardíaco
NERVIOSO
Central
Periférico
Receptores especiales