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LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
EL LABORATORIO DE
BIOLOGIA
MOLECULAR EN UN
HOSPITAL COMARCAL
Dr. Ricardo Molina Gasset, Mayo 2012
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
1902
1945
1949
1953
1960-80
1977-80
1985
1990-04
20022008-
A. Garrod
Beadle y Tatum
Pauling e Ingram
Watson y Crick
varios
Maxam y Gilbert/Sanger
Mullis
varios
varios
varios
Estudios sobre la alcaptonuria
Beadle y Tatum Hipótesis "un gen-un enzima"
Bases moleculares de la anemia falciforme
Estructura de doble hélice del DNA
Técnicas de DNA recombinante
Técnicas de secuenciación del DNA
Técnica de PCR
Proyecto Genoma Humano
Proyecto HapMap
Proyecto 1000 Genomes (next-generation
sequencing)
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•Proyecto del genoma humano (2000) revolucionó
la manera en la cual los científicos estudian los
mecanismos moleculares de la enfermedades
•De 100,000 to 23,000 genes.
•Tests que identifican marcadores moleculares y
genéticos de forma individual.
•Esos marcadores determinan el beneficio
potencial de una terapia específica o el riesgo de
desarrollar una enfermedad u otra condición de
salud
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
12000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
10000
8000
6000
4000
2000
0
Publicaciones Biologia molecular humana
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Industria del diagnóstico molecular
•$5.5 Billones en el 2009
•$8 Billones para el 2010
•40 millones de test anuales en USA.
•En el futuro próximo serán 1/3 de todos los test diágnosticos
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•55% - Enfermedades infecciosas •23% - Cribado sanguineo
•13% - Test genéticos
• 7% - Cancer
Predicción de riesgos – Oncotipos.
Detección temprana – Cromosoma X fragil.
Clasificación de enfermedades – Leucemias.
Terapia dirigida a determinadas dianas.
Predicción de toxicidad y respuesta – Herceptin (Herp2).
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BIOLOGÍA MOLECULAR
Disciplina que se ocupa del estudio de la vida a nivel molecular
Procesos celulares involucrados en la transferencia y
transmisión de la información genética en la célula
La medicina molecular es la ciencia biomédica que utiliza las
técnicas de la biología molecular en el estudio de las
enfermedades humanas.
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Dogma central de la biología molecular
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CLASIFICACIÓN MOLECULAR DE LAS ENFERMEDADES HUMANAS
Exógenas: infecciones, intoxicaciones, nutricionales....
Según el tipo de
célula
Germinales
Somáticas (cáncer)
Génicas
Genéticas
Mutaciones puntuales
Inserciones y delecciones
Según el tipo de
alteración
Cromosómicas
nucleares
Según el genoma
y cromosoma
afectados
numéricas
estructurales
Autosómicas
Ligadas al sexo
mitocondrial
Complejas o multifactoriales: en parte exógenas y en parte genéticas
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Biología molecular en las ciencias médicas
La medicina molecular
•La medicina genómica
•El diagnóstico molecular
•La farmacogenómica
•La terapia génica
Avance en:
Conocimiento de la patogenia de las enfermedades
Desarrollo de novedosas estrategias terapéuticas
Mejora de tratamientos farmacológicos
Implementación de métodos diagnósticos precisos y exactos
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La medicina molecular
Todas las enfermedades humanas poseen un componente genético bien
hereditario o como resultado de la respuesta del organismo a los estímulos del
medio, como las toxinas o los virus
El genotipo relacionado con la génesis y evolución de la enfermedad.
Con el conocimiento de las bases moleculares de las enfermedades es posible
Identificar marcadores para el
diagnóstico temprano
Nuevos blancos
terapéuticos
Desarrollar estrategias terapéuticas novedosas y efectivas
que en su conjunto permitan mejorar la atención a la salud
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Variaciones genotípicas: variaciones en la secuencia del DNA
Diferencias fenotípicas: Las diferencias morfológicas,
fisiológicas, bioquímicas y moleculares entre individuos de la
misma especie
Cambios en la secuencia del
DNA con una incidencia > 1%
Polimorfismos
(SNPs (polimorfismos de una
sola base) explican alrededor
del 90% de la diversidad
fenotípica en el humano.
Cambios en la secuencia del
DNA con una incidencia < 1%.
Mutaciones
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Medicina genómica
Estudio de los polimorfismos y su asociación con las enfermedades
Susceptibilidad genética
Polimorfismos que confieren propensión genética al
desarrollo o complicaciones de ciertas enfermedades
Predicción con cierta exactitud los
riesgos de padecer enfermedades
donde los genes jueguen un papel
fundamental
Predicción de evolución de la
enfermedad y su respuesta a las
terapias farmacológicas
Aplicación de medidas preventivas que limiten o incluso
eviten la enfermedad y mejora en los tratamientos
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Dot Blot
Diagnóstico Molecular. Las técnicas generadas por la Biología Molecular ofrecen
ventajas sobre las técnicas convencionales en el diagnóstico de enfermedades
hereditarias y adquiridas.
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Farmacogenómica
Se trata una enfermedad, no al individuo.
Responde
Responde
Toxicidad
No responde
Muy poco
Dosis
Dosis
Responde
No responde
Muy poco
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RESPONDEDORES
NO RESPONDEDORES
Un medicamento
funciona bien en
una persona pero
poco o nada en
otra con la misma
patología.
EFECTOS SECUNDARIOS ADVERSOS
Unas personas los
toleran bien mientras que
otras desarrollan efectos
adversos.
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FACTORES QUE CONDICIONAN ESTA RESPUESTA DIFERENCIAL
EDAD
INTRÍNSECOS
SEXO, PESO
ENFERMEDADES
GENES
ESTADO NUTRICIONAL
EXTRÍNSECOS
HÁBITOS DE VIDA (DIETA, TABAQUISMO,
ALCOHOL, DROGAS)
AMBIENTE
OTROS MEDICAMENTOS
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Farmacogenómica:
Evalúar la influencia de los polimorfismos genéticos en la
respuesta a los fármacos
Reacciones individuales tanto terapéuticas como toxicas
Las evaluaciones farmacogenómicas permiten aumentar
la eficiencia y bioseguridad de los tratamientos
farmacológicos para generar un tratamiento justo a la
medida del genotipo.
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Vía principal en el
metabolismo de los fármacos
Oxidación por familia de enzimas hepáticas:CYP450
Proporción de fármacos Metabolizados por algún miembro de P450
CYP2C9/10
P4502C9/10
P4502D6
CYP2D6
CYP21A2
P4501A2
P4502A6
CYP2A6
P4502C19
CYP2C19
P4502E1
CYP2E1
CYP3A
P4503A
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Concentraciones de fármaco según Fenotipo Metabolizador
Fenotipo metabolizador
Genotipo
Ultrarápido
Tipo de respuesta a dosis típicas
= Reacciones adversas
Conc.
= Intervalo terapéutico
Tiempo
Eficiente
Actividad
Actividad
normal
reducida
= No efectivo
= Reacciones adversas
= Intervalo terapéutico
= No efectivo
Intermedio
no actividad
= Reacciones adversas
= Intervalo terapéutico
= No efectivo
Lento
= Reacciones adversas
= Intervalo terapéutico
= No efectivo
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Familia CYP2
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Farmacogenómica:
Enzimas citocromo P450
Se ha estimado que una dosis diaria de 10-20 mg de
nortriptilina es suficiente para un paciente metabolizador
lento CYP2D6 y, sin embargo, un metabolizador
ultrarrápido que herede múltiples copias del gen
requeriría más de 500 mg al día
Enzimas glutatión S-transferasas
Numerosos estudios reportan asociación entre los
polimorfismos en los genes GST y la eficacia y/o toxicidad
en la quimioterapia del cáncer
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TÉCNICAS QUE SE REALIZAN EN EL LABORATORIO
Microbiologia:
Carga viral HIV, Carga viral Hepatitis C, Carga viral Hepatitis B
Genotipado HCV, Detección HPV, Genotipado HPV, Detección
Chlamydia Trachomatis, Detección Neisseria Gonorrhoeae, Detección
HSV1,Detección HSV2, Detección CMV, Detección EBV, Detección
VZ, Detección HH6, Detección enterovirus, Semicuantificación CMV
Hematología:
Polimorfismo FII, Mutación FVleiden, Mutación MTHFR ,
Gen Hemocromatosis
Oncología:
Mutaciones Kras, Mutaciones BRAF
Farmacogenómica:
Genotipo IL28B
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• Hemocromatosis: Grupo de trastornos
caracterizados por depósito de hierro en el
organismo
• Hemocromatosis hederitaria: Grupo de
trastornos genéticos caracterizados por
aumento en la absorción intestinal y depósito
de hierro en el organismo
• Mayoría: mutación gen HFE
80-90% homocigotos para
mutación C282Y
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Hemocromatosis
hereditarias
Sobrecargas de hierro
secundarias
Causas
de sobrecarga de hierro
• ASOCIADA AL GEN HFE
• No asociadas al gen HFE
H juvenil (2A hemojuvelina, 2B hepcidina), H asociada
receptor transferrina 2, ferroportina 1, mutación en
la ferritina H
• Enfermedades hematológicas
Talasemia mayor, A. sideroblásticas, A.
hemolíticas crónicas, A. aplásicas…
• Sobrecarga parenteral de hierro: transfusiones de
hemoconcentrados, hierro iv, hemodiálisis,
• Enfermedades hepáticas crónicas
Hepatitis B y C, enfermedad hepática
alcohólica, EHNA,etc
• Miscelánea
– Hemocromatosis neonatal, Atransferrinemia,
– Aceruloplasminemia
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Disminución de Hepcidina por mutación HFE
MUTADO
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Autosómica recesiva. 3 mutaciones gen de HFE (brazo corto crom. 6)
C282Y
(Cys por Tyr). La principal
•No se une a la b2M y no se expresa en membrana.
•Alta penetrancia para homocigotos. Más en > 40 años. Más en hombres.
•Incluso para homocigotos C282Y de > 40 años, aunque la sobrecarga férrica es
habitual (♀: 80% - ♂: 95%), no lo es la sintomatología (♀:13% - ♂:15%).
H63D (Hys por Asp)
•Se altera la estructura terciaria, se expresa en membrana y se une a B2M, no es
capaz de bloquear la unión HFE- sTfR.
•Solo tienen penetrancia relevante (aunque menor que en el caso anterior) si son
heterocigotos mixtos con C282Y.
S65C (Ser por Cys). La menos importante
•Pese a que se expresa en membrana y se une a B2M, está afectada la zona de
unión entre HFE y sTfR.
•Solo tienen algo de penetrancia (< 1%) en heterocigosis mixta con C282Y. Se
llama, también, mutación benigna. Muy poco prevalente en España.
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Enfermedad genética más frecuente en Occidente
Portadores 10%
Prevalencia de HH: 1/200-400 europeos caucásicos
Europa:
Norte: 80-90% C282Y-C282Y
Cuenca mediterránea: 50-70% C282Y-C282Y
Mayoría asintomáticos
40 – 50 años
10 ♂: 1♀
C282Y H63D
+/+
-/-/+
-/+
-/-/-
%
85%
5%
10%
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Cribado del gen de la hemocromatosis en el laboratorio
•Campo de aplicación: pacientes de primaria
•Ferritina > 400 en dos análisis
•Reactantes de fase aguda negativos (PCR < 0.5)
•Marcadores Hepatitis negativos
•Enzimas hepaticas no mayores de 200
•Hemoglobina > 12 mujeres o 13 hombres (descartar anemias
hemoliticas, sideroblasticas o megaloblasticas)
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1000
800
600
400
200
155
220
248
291
0
Nº Pacientes
2011
2010
2009
2008
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
50
45
7
40
7
35
30
16
25
20
15
10
5
6
4
4
7
18
0
Homozigotos C282Y
Heterozigotos dobles
(C282Y+ H63D)
2011
2010
2009
2008
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2%
5%
93%
Negativos
Homozigotos C282Y
Heterozigoto doble (C282Y+ H63D)
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Prevalencia en España de los genotipos HFE
GENOTIPO HFE
FRECUENCIA% IC 95%
HOMOCIGOTOS C282Y
0.1
0.0005-0.0014
HETEROCIGOTOS C282Y
4.5
0.033-0.06
HOMOCIGOTOS H63D
4.0
0.03-0.05
HETEROCIGOTOS H63D
31.0
0.28-0.34
C282Y/H63D
1.0
0.005-0.02
Prevalencia de la población estudiada en Alcoy de los genotipos HFE
GENOTIPO HFE
FRECUENCIA %
HOMOCIGOTOS C282Y
2.3
HETEROCIGOTOS C282Y
7.5
HOMOCIGOTOS H63D
9.1
HETEROCIGOTOS H63D
28.9
HETEROCIGOTOS S65C
0.8
C282Y/S65C
0.2
C282Y/H63D
5.5
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TÉCNICAS QUE SE REALIZAN EN EL LABORATORIO
Microbiologia:
Carga viral HIV, Carga viral Hepatitis C, Carga viral Hepatitis B
Genotipado HCV, Detección HPV, Genotipado HPV, Detección
Chlamydia Trachomatis, Detección Neisseria Gonorrhoeae, Detección
HSV1,Detección HSV2, Detección CMV, Detección EBV, Detección
VZ, Detección HH6, Detección enterovirus, Semicuantificación CMV
Hematología:
Polimorfismo FII, Mutación FV Leiden, Mutación MTHFR ,
Gen Hemocromatosis
Oncología:
Mutaciones Kras, Mutaciones BRAF
Farmacogenómica:
Genotipo IL28B
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Trombofilias hereditarias
• Resistencia a la PCa (FV Leiden)
• Aumento de Protombina (G20210A)
• Hiperhomocisteinemia
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Resistencia a la PCa y Factor V Leiden
Daño Vascular
XII
colágeno
Calicreína
VE
VI
XIIa
PK
HMWK
XI
HMWK
Sist. PC
XIa
Ca+2
IX
FT
VII
VIII
VIIa
VIIa-FT
Ca+2
IXa-VIIIa
Se inactiva por rotura de su cadena
cofactor de conversión de protombina a trombina
pesada por el complejo PCa (rotura
V
se activa por la trombina Arg506)
Ca+2
X
Mutación de guanina por adenina
en nucleotido 1691 (FVleiden),
Ca+2
cambia Arg506 por Glut y se hace
XIIIa resistente a la acción de la PCa
XIII
Xa-Va
Ca+2
Protombina
Trombina
Fibrinógeno
Fibrina
Fibrina estable
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Resistencia a la PCa
• 20-25% de las trombosis venosas (Casos seleccionados)
• Mutación en el gen del FV (FV Leiden)
Gen FV, crom 1, 25 exones
G1691A
H2N
A
Arg
Pca
A
A
Arg Glu
Trombina
FV Leiden:
• Menos sensible a la degradación por PCa
• Actividad procoagulante aumentada
C
C
COOH
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Factor V Leiden
Apacere en:
-Heterozigosis (95% casos)
-Homozigosis (1% casos)
-FV leiden + déficit FV (pseudohomozigotos)
-Mayor riesgo si aparece junto a déficit de PS, PC, AT, polimorfismo de la
protombina, niveles elevados FVIII, hiperhomocistinemia, embarazo,
anticonceptivos orales, terapia hormonal sustitutoria
-Factor de riesgo genético para trombofilias, mas frecuente en paises
occidentales
-Homozigotos tienen clínica de trombosis venosa
-Heterozigotos suelen ser asintomáticos
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POLIMORFISMO de la Protrombina
5´
E1
Polimorfismo
E14
A
G
20210
[ Protrombina ]
en plasma
Genotipo 20210G
Genotipo 20210A
1,05 U/ml
1,32 U/ml
Coagulación normal
Riesgo
3´
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Polimorfismo G20210A del Gen de la Protombina
5´
3´
Gen de Protombina, 14 exones G20210A
Síntesis de Protombina
(mayor nivel en plasma; 30%)
• Asociación con trombosis venosa y tromboembolismo
pulmonar
•
3-6 veces el riesgo de T. venosa (
asociado a ACO)
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Homocisteína (Hcy)
• Aminoácido tiól
• No esencial
• Intermediario en el metabolismo de la Metionina
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B12
(MTHFR)
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5,10 Metilentetrahidrofolato Reductasa (MTHFR)
Mutación C677T
Ala
Enzima con menor actividad
30-40% menos en heterozigótos,
60-70% menos en homozigótos)
Val
MTHFR termolábil
de Homocisteína
plasmática (pHcy)
Factor de riesgo de Trombosis
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Hiperhomocisteinemia y Trombosis
•
•
•
•
•
Daño directo del endotelio
Disminución de expresión de la Trombomodulina
Disminución de actividad de la PC
Aumento de actividad de FV
Aumento de la actividad plaquetaria
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TÉCNICAS QUE SE REALIZAN EN EL LABORATORIO
Microbiologia:
Carga viral HIV, Carga viral Hepatitis C, Carga viral Hepatitis B
Genotipado HCV, Detección HPV, Genotipado HPV, Detección
Chlamydia Trachomatis, Detección Neisseria Gonorrhoeae, Detección
HSV1,Detección HSV2, Detección CMV, Detección EBV, Detección
VZ, Detección HH6, Detección enterovirus, Semicuantificación CMV
Hematología:
Polimorfismo FII, Mutación FVleiden, Mutación MTHFR ,
Gen Hemocromatosis
Oncología:
Mutaciones Kras, Mutaciones BRAF
Farmacogenómica:
Genotipo IL28B
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
KRAS
Homólogo humano del Oncogen Kirsten Rat Sarcoma Virus
KRAS es un proto-oncogen, es una proteina de la cascada de transducción
de señal del EGFR (RTK)
Es una GTPase: el
GTP se hidroliza a
GDP inactivando el
RAS, asegurando
que la transducción
de señales no es
eterna.
RTK
proliferación
diferenciación
supervivencia
modulación del metabolismo
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
Anticuerpos Monoclonales Anti-EGFR
•Un descontrol en la cascada del EGFR
puede ser la causa de procesos neoplásicos
debido a un incremento en el número de
receptores del EGF
•Anticuerpos monoclonales anti-EGFR se unen al dominio
extracelular del EGFR bloqueando la unión del ligando y la
activación del receptor.
Cetuximab (Erbitux) –
Merck
Panitumumab (Vectibix) – Amgen
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
Fármacos Anti-EGFR y mutaciones del KRAS
Mutaciones del KRAS (RAS) conducen a una transducción de señales
independientes del EGFR (RTK)
Las terapias Anti- EGFR
no son útiles
en células tumorales que
contienen KRAS mutado.
RAS Mutado se une al GTP pero no puede hidrolizarlo a GDP
•RAS siempre está en su ESTADO ACTIVO
•Descontrol de la transducción de señales
•Estimulación permanente de la proliferación celular
CANCER
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Mutaciones del KRAS
Mutationes en el gen KRAS ocurren con una frecuencia del 40-45% en pacientes con Cáncer Colorrectal
metastásico
Mutation
Exon
Base Change
12 Asp
12 Ala
12 Arg
12 Cys
12 Ser
12 Val
13 Asp
1
1
1
1
1
1
1
Gly12Asp (GGT>GAT)
Gly12Ala (GGT>GCT)
Gly12Arg (GGT>CGT)
Gly12Cys (GGT>TGT)
Gly12Ser (GGT>AGT)
Gly12Val (GGT>GTT)
Gly13Asp (GGC>GAC)
>97.0% mutationes occurren en los codones 12 and 13
Cosmic
ID
521
522
518
516
517
520
532
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
K-RAS: Utilidad clínica
•Orientación de terapias anti-EGFr (m-CRC) en cáncer de colon metastásico
wt (35-45%): fármacos anti-EGFr
(antireceptor de factor de crecimiento epidérmico)
K-RAS
fármacos anti-VEGF
(antifactor de crecimiento endotelial antivascular)
mut (55-65%): fármacos anti-VEGF
•Biomarcador de pronóstico:
Cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC)
Cáncer de pancreas
Cáncer de vejiga
Terapias anti-EGFR eficaces sólo en pacientes con K-RAS no mutado
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
TÉCNICAS QUE SE REALIZAN EN EL LABORATORIO
Microbiologia:
Carga viral HIV, Carga viral Hepatitis C, Carga viral Hepatitis B
Genotipado HCV, Detección HPV, Genotipado HPV, Detección
Chlamydia Trachomatis, Detección Neisseria Gonorrhoeae, Detección
HSV1,Detección HSV2, Detección CMV, Detección EBV, Detección
VZ, Detección HH6, Detección enterovirus, Semicuantificación CMV
Hematología:
Polimorfismo FII, Mutación FVleiden, Mutación MTHFR ,
Gen Hemocromatosis
Oncología:
Mutaciones Kras, Mutaciones BRAF
Farmacogenómica:
Genotipo IL28B
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
Predictores de respuesta terapia Hepatitis C
• Factores huésped
– Edad
– Sexo
– Etnia
– Alcohol
– Resistencia Insulina
– Fibrosis/Cirrosis
– Adherencia
– Genética
• Factores del tratamiento
– Régimen
– Dosis y duración
– Efectos adversos
• Factores virales
– Carga viral
– Genotipo
– Cuasiespecies
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Polimorfismo
Promotor de la IL28B en posición -3176 C/T (rs12979860)
Genotipo CC > tasa aclaramiento espontáneo del VHC
Tillmann HL. Gastroenterology. 2010;139:1586-92.
Mayor eficacia del tratamiento antiviral con interferón
Genotipo CC >respuesta viral rápida
Thompson AJ, et al. Gastroenterology. 2010; 139:120-9.
Genotipo CC >2 veces respuesta viral sostenida
55-80% genotipo CC, 20-40% genotipo CT o TT
Ge D, et al. Nature. 2009;461:399-401.
Suppiah V, et al. Nat Genetics. 2009;41:1100-1104.
Tanaka Y, et al. Nat Genetics. 2009;41:1105-1109.
Thompson AJ, et al. Gastroenterology. 2010; 139:120-9.
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Polimorfismo IL28B (rs 12979860 CC) se asocia con RVS
1628 pacientes HCV G1
Ge D, et al. Nature. 2009;461:399-401
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
Predictores de RVS con Interferón/Ribavirina
Caucásicos (n = 871)
Afro Americanos (n = 191)
Factores Asociados con RVS
Hispanos (n = 75)
Odds Ratio (IC 95%)
7.3
4.2
Genotipo IL28B rs12979860 (CC vs TT)
3.0
6.1
HCV RNA Basal (< vs ≥ 600,000 IU/mL)
5.1
1.1
5.6
Fibrosis Basal (METAVIR F0-F2 vs F3-F4)
2.4
1.0
Ge D, et al. Nature. 2009;461:399-401.
4.1
10.0
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
Prevalencia de Alelos IL28B
explicar variación geográfica en RVS
En Europa predice la respuesta al
tratamiento con Interferón/Ribavirina
Thomas DL, et al. Nature. 2009;461:798-802.
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
Tecnicas que se podrían
incorporar en el
laboratorio de Biología
molecular de este hospital
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
TÉCNICAS QUE SE PUEDEN INCORPORARAL LABORATORIO
Metabolicas:
Detección del polimorfismo C-13910T en MCM6
Genotipo Apo E
Farmacogenómica:
Detección de polimorfismos CYP2D6*3, CYP2D6*4
Detección de polimorfismos CYP2C19*2 and CYP2C19*3
Detección de polimorfismos CYP2C9*2 and CYP2C9*3
Deteccion polimorfismos VKORC1
Varios:
Genotipo alfa 1 antitripsina
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
Frecuencia de tolerancia a la lactosa en el mundo
TOLERANTE
INTOLERANTE
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
Bases moleculares para la tolerancia a la lactosa
D2S3010
D2S3013
D2S3015
D2S3016
LCT
C/T -13910
El alelo T de un
polimorfismo C/T
localizado en una región
potencialmete reguladora
13.9 Kb arriba del gen
de la lactasa se encontro
que esta asociado con
persistencia a la
lactasa en población
del Norte de Europa.
G/A -22018
Su frecuencia
iguala la
frecuencia de las
lactosa
persistentes
esperados de test
de hidrogeno
espirado
Estamos ante un
nuevo test de
tolerancia de la
lactosa
El alelo A de
G/A-22018
polimorfismo
está altamente,
pero no
completamente
asociado en las
mismas
poblaciones
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
Evidencia de asociación
-13910 kb C/T locus
PERSISTENTE
NO PERSISTENTE
CT
TT
AG
AA
CC
-22018 kb G/A locus
PERSISTENTE
NO PERSISTENTE
GG
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
TÉCNICAS QUE SE PUEDEN INCORPORAR AL LABORATORIO
Metabolicas:
Detección del polimorfismo C-13910T en MCM6
Genotipo Apo E
Farmacogenómica:
Detección de polimorfismos CYP2D6*3, CYP2D6*4
Detección de polimorfismos CYP2C19*2 and CYP2C19*3
Detección de polimorfismos CYP2C9*2 and CYP2C9*3
Deteccion polimorfismos VKORC1
Varios:
Genotipo alfa 1 antitripsina
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
POLIMORFISMO APOE
1. Alelos:
E2 (cisteínas en 112 y 158)
E3 (cisteína en 112 y arginina en 158)
E4 (argininas en 112 y 158)
2. Genotipos:
E2-E2 ( 1.5%)
E3-E4 (13.0%)
E2-E3 (11.5%)
E2-E4 ( 0.5%)
E3-E3 (72.6%)
E4-E4 ( 0.8%)
3. CT y LDL-colesterol muy altas entre los portadores del alelo E4.
4. E4 => hiperreactividad a cambios dieta e hiporespuesta a estatinas.
5. E4 => factor de riesgo para demencias y EA
6. La respuesta al tratamiento con Tacrine en pacientes con Alzheimer :
E2-E3 respuesta 4 veces mayor que E4-E4.
(Farlow, et al, 1996 Ann NY Acad Sci 802: 101-110)
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
TÉCNICAS QUE SE PUEDEN INCORPORARAL LABORATORIO
Metabolicas:
Detección del polimorfismo C-13910T en MCM6
Genotipo Apo E
Farmacogenómica:
Detección de polimorfismos CYP2D6*3, CYP2D6*4
Detección de polimorfismos CYP2C19*2 and CYP2C19*3
Detección de polimorfismos CYP2C9*2 and CYP2C9*3
Deteccion polimorfismos VKORC1
Varios:
Genotipo alfa 1 antitripsina
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
CYP2D6
El citocromo P450 son monooxigenasas las cuales
catalizan muchas reacciones envueltas en el metabolismo
de las drogas.
El citocromo P450 2D6 (CYP2D6) esta localizado en el
hígado y metaboliza sobre el 20% de los fármacos de uso
común, en particular agentes cardiovasculares y
psicotrópicos.
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
Sustratos del CYP2D6
β-bloqueantes: Carvedilol, Metoprolol
Antiarrítmicos de Clase I: Lidocaina, flecainida, Clorfenamina, Debrisoquina,
Metoclopramid, Ondansetron, Tropisetron
Opioides: Codeína, Tramadol, Dextrometorfano
Antidepresivos: Imipramina, Amitriptilina, Notriptilina, Venlafaxine, Fluoxetine,
Paroxetine, Tamoxifen, Vincristina
Inhibidores del CYP2D6
Antihistamínicos: Clorfenamida, Difenidramina
Antipsicóticos: Clorpromazina, Haloperidol
Inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina: Citalopram, Fluoxetina
Bupropion, Celecoxib, Cimetidina, Clomipramina, Cocaina, Doxorubicina,
Metoclopramida
Metadona, Moclobemida, Quinidina, Ranitidina, Ritonavir, Terbinafina
Inductores del CYP2D6
Dexametasona
Rifampicina
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
Gen altamente polimórfico, con un gran número de alelos identificados,
teniendo relevancia médica los alelos CYP2D6*3, CYP2D6*4 y CYP2D6*6
Fenotipo asociado a cada alelo (población Caucasiana)
Alelo
Actividad Enzimática
CYP2D6*1
CYP2D6*2
CYP2D6*3
CYP2D6*4
CYP2D6*5
CYP2D6*6
CYP2D6*8
CYP2D6*9
CYP2D6*10
CYP2D6*14
CYP2D6*17
CYP2D6*35
CYP2D6*41
Actividad normal
Actividad normal
Ausencia total de actividad metabólica
Ausencia total de actividad metabólica
Ausencia total de actividad metabólica
Ausencia total de actividad metabólica
Ausencia total de actividad metabólica
Disminución de la actividad enzimática
Disminución de la actividad enzimática
Ausencia total de actividad metabólica
Disminución de la actividad enzimática
Aumento de la actividad enzimática
Disminución de la expresión génica
Frecuencia
36.0%
33.0%
1.0%
19.0%
4.0%
1.0%
2.5%
2.0%
5.2%
8.4%
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
Principales alelos según su funcionalidad en población Caucasiana
Alelos funcionales: *1, *2,*35
Alelos parcialmente funcionales: *9, *10, *17, *41
Alelos no funcionales: *3, *4, *5, *6
Diferencias Interétnicas según los tipos de alelos
Etnia
Alelos
Alelos
funcionales no funcionales
Alelos
parcialmente funcionales
Caucasianos
71%
26% (CYPD6*4)
3%
Asiáticos
50%
9%
41% (CYP2D6*10)
Africanos
50%
15%(CYPD6*4,*5)
35% (CYP2D6*17)
La detección de las variantes alélicas de CYP2D6 permite una
farmacoterapia individualizada y mas segura.
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
Tipo metabolización
Prevalencia en poblacion caucasica
metabolizadores lentos : 2 copias (combinadas de cualquier
modo) de estos 4 alelos: CYP2D6*3, CYP2D6*4, CYP2D6*5 y
CYP2D6*6
5-10%.
metabolizadores intermedios: heterocigotos, con un alelo
funcional y otro no funcional, o bien homocigotos para alelos
parcialmente funcionales..
80-94%.
metabolizadores rápidos: heterocigotos u homozigotos para
alelos funcionales.
metabolizadotes ultrarrápidos: múltiples copias del gen
funcional La frecuencia de dicho fenotipo en la población
Caucasiana puede variar entre 1-10%.
1-10%.
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
TÉCNICAS QUE SE PUEDEN INCORPORAR AL LABORATORIO
Metabolicas:
Detección del polimorfismo C-13910T en MCM6
Genotipo Apo E
Farmacogenómica:
Detección de polimorfismos CYP2D6*3, CYP2D6*4
Detección de polimorfismos CYP2C19*2 and CYP2C19*3
Detección de polimorfismos CYP2C9*2 and CYP2C9*3
Deteccion polimorfismos VKORC1
Varios:
Genotipo alfa 1 antitripsina
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
CYP2C19
•El gen es polimórfico con mas de 20 alelos
•Los alelos CYP2C19*2 y CYP2C19*3 tiene relevancia, porque presentan
una actividad enzimática disminuida
•En el CYP2C19*2 hay una sustitución de G681>A causando un error de
lectura y produciéndose una proteína modificada
•En el CYP2C19*3 hay una sustitución de G636>A creándose un codón de
parada anterior y produce una proteina truncada
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
Sustratos del CYP2C19
Antidepresivos: amitriptilina, citalopram, clomipramina, fluoxetina, imipramina,
moclobemida
Antiepilépticos: fenitoína, fenobarbitona, S-mefenitoína
Benzodiacepinas: diazepam
Inhibidores bomba protones: lansoprazol, omeprazol, pantoprazol
Miscelánea: carisoprodol, ciclofosfamida, hexobarbital, indometacina, Rmefobarbital, nelfinavir, nilutamida, primidona, progesterona, proguanil,
propanolol, tenipósido, (R)-warfarina (8-OH)
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
Polimorfismo del CYP2C19:
CYP2C19*1: Alelo normal
CYP2C19*2: Alelo actividad disminuida
CYP2C19*3: Alelo actividad disminuida
Distribución de los atendiendo a su genotipo:
GENOTIPO
FENOTIPO
Homozigoto CYP2C19*1 // CYP2C19*1 - metabolizadores rápidos.
Heterozigoto CYP2C19*1 // CYP2C19*2 - metabolizadores rápidos.
Heterozigoto CYP2C19*1 // CYP2C19*3 - metabolizadores rápidos.
Homozigoto CYP2C19*2 // CYP2C19*2 - metabolizadores lentos.
Homozigoto CYP2C19*3 // CYP2C19*3 - metabolizadores lentos.
Heterozigoto CYP2C19*2 // CYP2C19*3 - metabolizadores lentos.
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
TÉCNICAS QUE SE PUEDEN INCORPORARAL LABORATORIO
Metabolicas:
Detección del polimorfismo C-13910T en MCM6
Genotipo Apo E
Farmacogenómica:
Detección de polimorfismos CYP2D6*3, CYP2D6*4
Detección de polimorfismos CYP2C19*2 and CYP2C19*3
Detección de polimorfismos CYP2C9*2 and CYP2C9*3
Deteccion polimorfismos VKORC1
Varios:
Genotipo alfa 1 antitripsina
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
Accenocumarol inhibe el ciclo de la Vitamina K
Epoxido
Reductasa
Accenocumarol
CYP2C9
Inactivación
Farmacocinética
 -Carboxylasa
(GGCX)
Factores de coagulacion Vit. K dependientes
(FII, FVII, FIX, FX, Protein C/S)
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
CYP 2C9*2 y CYP 2C9*3
•El Citocromo P-450-2C9 localizado en el hígado metaboliza fármacos de uso
común: : S-warfarin, Ibuprofen, Diclofenaco, accenocumarol.
•El gen es polimórfico.
Los alelos CYP2C9*2, CYP2C9*3, CYP2C9*6, CYP2C9*15 Y CYP2C9*25
son inactivos.
•Los pacientes con un genotipo metabolizador lento probablemente necesitan
dosis mas bajas de S-Warfarina o Acenocumarol, teniendo mayor riesgo de
sangrado.
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
• La principal via para la eliminación del acenocumarol es a través de la
oxidación en el hígado por el CYP2C9
•Metabolismo del Acenocumarol en función de los polimorfismosCYP2C9:
CYP2C9*1 (salvaje)
- normal
CYP2C9*2 (Arg144Cys) - bajo/intermedio
CYP2C9*3 (Ile359Leu) - bajo
•Frecuencia de alelos CYP2C9 de bajo metabolismo:
Europeos: CYP2C9*2 - 10.7%
CYP2C9*3 - 8.5 %
Asiaticos: CYP2C9*2 CYP2C9*3 -
0%
1-2%
Africanos: CYP2C9*2 CYP2C9*3 -
2.9%
0.8%
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
Accenocumarol inhibe el ciclo de la Vitamina K
Epoxido
Reductasa
Accenocumarol
CYP2C9
Inactivación
Farmacocinética
 -Carboxylasa
(GGCX)
Factores de coagulacion Vit. K dependientes
(FII, FVII, FIX, FX, Protein C/S)
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
VKORC1
•La subunidad 1 del complejo vitamina K epoxi (VKORC1) es una
proteína de membrana localizada en los hepatocitos.
•VKORC1 tiene un papel importante en la ruta de la vitamina K, la
cual es esencial para la coagulación.
•Alta actividad de VKORC1 esta asociada con un incremento de la
eficiencia de la coagulación.
•El efecto anticoagulante de los derivados cumarínicos es por la
inhibición de la actividad VKORC1.
•Los polimorfismos C1173T y G-1639A reducen la actividad de
VKORC1 y así aumenta el efecto de los derivados cumarínicos.
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
POLIMORFISMOS VKORC1
Genotipo
Fenotipo
Dosis
CC
Homozigoto salvaje
Normal
Normal
CT
Heterozigoto
Normal
Normal
TT
Homozigoto mutante Lento
Reducida
GG
Homozigoto salvaje
Normal
Normal
GA
Heterozigoto
Normal
Normal
AA
Homozigoto mutante Lento
Polimorfismo 1173
Polimorfismo 1639
Reducida
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
VKORC1 afecta a la rapidez de respuesta del ciclo de la vitamina K
Polimorfismo 1639
1 dosis oral de accenocumarol 30% de cambio en INR
Bodin, et al. Blood 2005
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
TÉCNICAS QUE SE PUEDEN INCORPORARAL LABORATORIO
Metabolicas:
Detección del polimorfismo C-13910T en MCM6
Genotipo Apo E
Farmacogenómica:
Detección de polimorfismos CYP2D6*3, CYP2D6*4
Detección de polimorfismos CYP2C19*2 and CYP2C19*3
Detección de polimorfismos CYP2C9*2 and CYP2C9*3
Deteccion polimorfismos VKORC1
Varios:
Genotipo alfa 1 antitripsina
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
ALFA 1 ANTITRIPSINA
•Proteína circulante producida en el hígado.
•Formada por 394 aminoácidos con tres cadenas laterales
carbohidratadas.
•Inhibe proteasas (sobre todo elastasa).
•Protege los tejidos de ser dañados por la enzima elastasa presente
en los neutrófilos, monocitos y eosinófilos.
•Cuando hay déficit el tejido pulmonar es uno de los más afectados.
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
ALFA 1 ANTITRIPSINA
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
DÉFICIT ALFA 1 ANTITRIPSINA
•Trastorno hereditario producido por alteración de alfa 1 antitripsina.
•Puede cursar con clínica respiratoria y hepática.
•El déficit aumenta la proteolisis y deposito de proteínas anormales
en los tejidos.
•Los signos clínicos de defecto genético son bronquitis y en casos
mas severos enfisema, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y
hepatitis.
•Afecta 1/2500 y 1/3000.
•Enfermedad respiratoria afecta entre los 30 y 40 años de edad.
•Es una de las causas más frecuentes de trasplante hepático en
niños.
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
FISIOPATOLOGÍA ALFA 1 ANTITRIPSINA
Cuando la proteína AAT es defectuosa, la velocidad de liberación al torrente
circulatorio por los hepatocitos disminuye y se acumula en el hígado
Ocasionando una deficiencia de AAT en la sangre
Daño pulmonar por la elastasa.
Daño hepático en algunos pacientes
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
GEN
• Serpina 1
• Cromosoma 14q32.1
• Longitud de 12,2kb.
• Formado por 7 exónes
• Exones II-V codifican el centro
activo (metionina 358)
• El alelo deficitario más importante
de la AAT (alelo Z)
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
VARIANTES ALFA 1 ANTITRIPSINA
• La AAT normal se denomina M
• Las variantes más frecuentes que producen enfermedad
son la Z y la S.
• Variante Z: Mutación G11940A codificando E342K
(glutamato a lisina )
• Variante S: Mutación T9628A codificando E264V
(glutamato a valina )
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
GENOTIPOS
NORMAL
• La mayoría tienen dos genes normales M (genotipo MM)
• Niveles normales de AAT.
•
•
•
•
•
DEFICIENTES
Los dos alelos deficientes más frecuentes son el S y el Z.
El 3% de la población caucásica es portadora de S o Z.
El gen Z es considerado deficiente grave.
El gen S es considerado deficiente leve.
Deficientes raras
– “M-like”, como la variante MMalton
– “S-like”, como la SSiiyama.
LABORATORIO BIOLOGÍA MOLECULAR
DEFICIENCIA GRAVE
• GENOTIPO ZZ (IPZZ: 10-15%)
– El 95% de las personas con Deficiencia de AAT tienen 2 genes Z (Pi ZZ)
– Nivel AAT menor del 10% del normal.
– Desarrollo enfermedad pulmonar
– Solamente un 5% de los Pi ZZ desarrollan enfermedad hepática crónica.
DEFICIENCIA INTERMEDIA
• GENOTIPO SZ (IPSZ: 40% )
– Con niveles sobre los considerados protectores
– Riesgo incrementado de desarrollar enfermedad pulmonar
• GENOTIPO MZ (IPMZ: 60% )
– Suelen tener un nivel de AAT en torno al 60% de los valores normales
– Generalmente no desarrollan enfermedad, pero los fumadores, tienen un
riesgo mayor para el desarrollo de EPOC.
– Mayor riesgo de desarrollar una enfermedad hepática crónica en presencia de
factores de riesgo como la exposición al virus de la hepatitis y el alcohol.
DEFICIENCIA LEVE
• GENOTIPOS SS(IPSS: 60%) y MS (IPMS: 80%)
– Nivel de AAT al 60-80% de los valores normales.
– El riesgo de enfermedad pulmonar o hepática es muy pequeño