Download clase imprinting 2015

IMPRONTA GENOMICA
(“IMPRINTING”)
Conocimientos requeridos:
clases previas de Cromatina y Epigenética
Definición:
“marca” epigenética que determina la expresión de 1 solo alelo de un
cierto locus dependiendo del sexo del progenitor que transmitió ese alelo
(parent of origin)
ocurre en mamíferos y en plantas
Una determinada marca (ya sea de activación o de inactivación) existe en
un alelo pero no el otro en células somáticas. Dichas marcas se borran y
establecen de novo en la línea germinal, pero de manera diferente en la
masculina y femenina
concepto relativamente moderno
Primer trabajo que menciona la palabra “imprinting” en contexto biológico
(de comportamiento):
Klopfer et al., Proc Natl Acad Sci U S A. (1964) 52: 911–914.
Maternal “Imprinting” In Goats
Primer trabajo que menciona la palabra “imprinting” en contexto genético
bien definido:
Rastan et al. Nature (1983) 303: 635-637.
Interaction between the Xce (X-controlling element) locus and imprinting of
the paternal X chromosome in mouse yolk-sac endoderm.
Modelo sencillo de expresión mono-alélica de dos genes sujetos a imprinting
Erasure = borrón y cuenta nueva
“resetting” del imprinting
epigenéticamente iguales
origen:
P
M
origen:
P
M
epigenéticamente iguales
se mantienen las marcas
que vinieron de los progenitores.
no importa el sexo
del individuo hijo
(el sexo va a importar después a la hora
de transmitir
los alelos a su progenie)
las marcas se establecen de nuevo
de acuerdo a si son gametas
masculinas
o femeninas
ERASURE
“borrón y cuenta nueva”
Andy Bell y Vince Clarke.)
y cel somaticas de adulto
“resetting”: se borra el viejo imprinting
y se establece nuevo imprinting
marcas epigenéticas de
futura no-expresión
marcas epigenéticas
de futura expresión
Lista de genes “imprinteados”
en: a census of mammalian imprinting.
Morison et al., Trends Genet. 21: 457-65 (2005 )
Ejemplos:
1
2
3
SNRPN
UBE3A
IGF2
H19
Xist
Tsix
cromosoma
15
expresión
paterna
materna
11
paterna
materna
X
paterna*
materna*
* Solamente en embrión antes de implantación; después es al azar
Ejemplo 1: cromosoma 15q11-q13
(brazo largo)
son genes que se expresan en sistema nervioso central
IC SNRPN _______otros genes _________UBE3A
←-----------------------------------36 Kb--------------------------------------→
expr. paterna
expr: materna
IC: “imprinting center”: region que controla el imprinting de toda la región
SNRPN y UBE3A son de expresión excluyente en cis, es decir:
si se expresa SNRPN, no se expresa UB3A en el mismo alelo, y viceversa
¿En qué células se establece (se “resetea”) el imprinting
del gen SNRPN?
metodología: medición de status de metilación en islas CpG (entre ellas, las
del IC=Imprinting Center) mediante la técnica del bisulfito
Geuns et al., Hum. Mol. Genet. 12: 2873-9 (2003)
embrión temprano
línea germinal femenina
consistente con un alelo
metilado y el otro no
muy metilada
línea germinal masculina
nada metilada
Síndrome de Prader Willi
(PWS)
Causa 1: deleción en el alelo SNRPN
de origen paterno (70% de los casos)
Expresión NO
de la región
NO
Síndrome de Prader Willi
(PWS)
causa 2: Disomía* Maternal (25% de los casos)
*Disomía uniparental en general puede surgir por:
1) error en meiosis dando gametas con cromosomas duplicados provenientes de un mismo
progenitor y posterior pérdida en cigoto del cromosoma heredado por el otro progenitor
2) o por recombinación entre cromosomas homólogos en mitosis en embrión temprano
Expresión:
NO
NO
Síndrome de Prader Willi
(PWS)
causa 3:
Defecto en el IC 3’ (PWS-IC) de origen paterno, que
(si bien causa insensibilidad a marcas epigenéticas
inactivadoras), tampoco permite que actúen las marcas
activadoras
(5% de los casos)
Expresión:
NO
NO
Página de PWS association
http://www.pwsausa.org/index.html
Síntomas
• Neonatal hypotonia
• Feeding problems in infancy
• Excessive weight gain
• Facial features
• Hypogonadism
• Developmental delay
• Hyperphagia
• Hypopigmentation
• Small hands and/or feet
• Eye abnormalities
• Thick viscous saliva
• Articulation defects
problemas de comportamiento
•
Sleep disturbance
Síndrome de Angelman (AS)
Causa similar pero la deleción es en la región
que se expresa a partir del alelo de origen materno:
gen UBE3A
•
•
Angelman Syndrome Foundation
http://www.angelman.org/angel/
Síndrome de Angelman (AS)
Síntomas
•
•
•
•
•
•
developmental delay
mental retardation
gross and fine motor difficulties
suck/swallowing disorder
wide-spaced teeth
hypopigmentation
Problemas de comportamiento
•
•
•
•
speech disorder (in most cases, lack of speech)
hypermotoric behavior
easily excitable personality
frequently happy demeanor.
Modelo molecular sencillo para explicar expresión mono-alélica (paterna)
p
de los genes de la región (excepto de UBE3A, que tiene patrón
de
expresión opuesto en cis)
_____
factores específ de línea germ fem
_____
metilación → inactivo
IC = Imprinting Center; región regulatoria bipartita: parte 5’ (AS-IC): promueve la acción de metilasas;
parte 3’ (PWS-IC): isla CG receptora de esas metilasas
no hay factores
sin metilar → activo
● : alelos que no se expresan
○ : alelos que se expresan
IC = Imprinting Center
¿Por qué la expresión excluyente en cis
entre SNRPN y UBE3A?
No hay un modelo molecular convincente, pero probablemente se
deba a un aislante transcripcional influido por una DMR
(región diferencialmente metilada) que actúa a distancia,de
modo similar a lo indicado en el ejemplo 2 (BWS)
Ejemplo 2:
Beckwith–Wiedemann
syndrome (BWS):
se transmite por vía materna
●
-
no se preocupen por el * (portadores
de la mutación) en las personas sanas
de la generación III
- macroglosia
- hepatomegalia
- tumor de Wilms
CTCF es un aislante transcripcional que se
ubica en la DMR (región diferencialmente metilada)
cuando no está metilada; e impide la acción
a distancia del enhancer sobre IGF2
(CTCF no tiene efecto sobre H19, pero éste
región en cromosoma 11p15:
genes IGF2 y
H19 (no relacionado
a la enfermedad) regulados por
el mismo enhancer atípico
ubicado 3’
requiere DMR no metilada)
Normalmente el alelo paterno
está metilado → CTCF no se pega
→ IGF2 se expresa
enhancer
CTC
F
Normalmente el alelo materno
no está metilado → CTCF se pega →
IGF2 no se expresa
En BWS, el alelo materno tiene una deleción
en DMR → CTCF no se pega →
IGF2 se expresa,
lo cual explica el tumor de Wilms (sobreexpresión de IGF2 a partir de ambos alelos)
Si hay deleción similar en alelo paterno,
no causa cambios en la expresión de IGF2
porque desaparece la plataforma para el
pegado de CTCF, que igual normalmente
es inefectiva debido a metilación
Ejemplo 3
INACTIVACION DEL CROMOSOMA X
en células XX de mamíferos
antecedentes:
Mary F. Lyon, UK (1925- 2014)
descubrió en 1966 que:
corpúsculo de (Murray) Barr (1949), es debido a un X como
heterocromatina en células somáticas XX en interfase
sexado en las Olimpíadas (para detectar transexuales XY): the presence of
Barr bodies indicates femaleness whereas their absence indicates maleness. This test was previously
used in the International Olympic Committee Medical Commission in 1968. This test
later was replaced by PCR (Y chromosome).
•
cuerpo XY (par XY como heterocromatina [hay recombinación homóloga entre
ellos solamente en cortas regiones]) en células germinales masculinas
durante el inicio de la meiosis; luego se separan en la primera
división, pero el X sigue heterocromatinizado en las gametas
masculinas con X
Ejemplo 3
INACTIVACION DEL CROMOSOMA X
en células XX de mamíferos
• Placentarios (euterianos)
debida a imprinting hasta el momento de la implantación
(estadío blastocisto). Después el imprinting es borrado
(excepto en trofoblasto → placenta) y la inactivación es
al azar por un mecanismo de conteo o dosaje
→ tejidos mosaico
• No placentarios (metaterianos) p. ej. canguros
hay imprinting de todo el X paterno a lo largo de toda la
embriogénesis, que continua en la vida adulta
Genes Xist y Tsix
Jeannie Lee et al., Harvard Medical School
Nature Genetics 21, 400 - 404 (1999)
los genes responsables están localizados en el XIC (X-inactivation Center),
locus definido por genética clásica
RNA: el verdadero inactivador en cis
RNA anti-sense: el verdadero activador en cis
El RNA Xist (un long ncRNA)
recubre a todo el X del cual
provino, y lo inactiva
(indirectamente)
El RNA Tsix (otro long nc RNA),
más largo, es complementario a
Xist (parcialmente solapados);
impide que se sintetice RNA Xist
se detecta Xist
se detecta Tsix
hibridización in situ de RNA
(RNA-FISH)
¿Qué marcas epigenéticas adquieren los X como
consecuencia del RNA Xist?
los clásicos
RNA
Chang et al., Frontiers in Bioscience 11, 852-866, 2006
OK, la inactivación de uno de los dos X es debida a genes del XIC….
pero ¿cuál X es el que se inactiva?¿Es al azar o es parent of origin?
Experimento: mirar expresión de genes Xist y Tsix por RT-PCR sobre
RNA de blastocistos pre-impl. de dos cepas de ratón distintas (para
aprovechar polimorfismos de longitud en RNA Xist y Tsix)
Madre Padre
F1
M
P
en hembras: el RNA Xist es igual
que el del padre !!!
machos no tienen RNA Xist
el RNA Tsix es
el de la madre !!!
Conclusión:
en blastocistos XX pre-implantados,
el X inactivo es el de origen paterno
el X activo es el de origen materno
controles de expresión de un gen del Y y constitutivos
¿Qué le pasa a la progenie de una madre sin Tsix?
(KO para Tsix, en región que no afecta al DNA Xist)
M
P
M
P
F1
*aparece el RNA Xist
*
de la madre!!!
**
**obviamente desaparece
Tsix de la madre
si el KO fue exitoso
Jeannie Lee, Harvard
Mirando los blastocistos pre-implantación wt y KO
detección de RNA Xist mediante RNA-FISH
¿consecuencias de este
KO en la vida de los
ratones?
estos embriones mutantes
knock out
tienen problemas de
superviviencia:
se les inactiva el XM que
tendría que estar activo !!
en los pocos embriones XX
que sobreviven, después de
la implantación y borrón y
cuenta nueva:
se inactiva 1 solo X, pero no
al azar:
preferentemente es en el X
mutado
(y en machos sobrevivientes,
el único X no se inactiva?)
Jeannie Lee, Harvard
Cell 103, 17–27 (2000)
En cambio, los mutantes XM XPΔ no tienen problemas
porque de todos modos X P estaría inactivo
en estas ratonas, después de la implantación, la inactivación del X no es al azar: preferentemente es el X mutado
Modelo sencillo de inactivación del cromosoma X
muestra que el imprinting de todo el X (antes de la implantación) se deberia al imprinting de Tsix (en su IC)
(trofoblasto→placenta)
femenino
borrón y cuenta nueva
metilación?
IC = Imprinting Center
Modelo consistente con la formación del corpúsculo XY en células
germinales masculinas diploides y el borrado del corpúsculo del de Barr en
las germinales femeninas
modelo integrador que muestra asociación entre RNAs Xist/Tsix y
marcas epigenéticas conocidas en el embrión mamífero temprano
RNA Xist
origen Paterno
origen Materno
RNA Tsix
/
/
borrón y cuenta nueva
al azar
Navarro et al.
GENES & DEVELOPMENT (2005) 19:1474-1484
Tsix induces efficient H3-K4 methylation ○
over the entire Xist/Tsix unit.
/
Ojo!!!:
metilación en K4H3
es marca activadora
RNA Xist
RNA Xist
Comprobación experimental (in vivo) del “modelo del beso”
(Jeannie Lee, Science 2006)
MEFs
núcleos de
ES cells XX
luego de extraer los
embriones a distintos
tiempos (de distintas
ratonas preñadas) :
DNA FISH
para ambos X
(verde y rojo)
RNA FISH para
Xist (rojo): se ve
En 1 X solamente
al momento del
“beso”
ocurrió
“beso”
se separan
Xic, green
Tsix, red.
DAPI, blue
para ver
resto del
nucleo
Xic DNA, green
Xist RNA, red
Enriquecimiento de
K27H3 en cromosoma
con Xist RNA
Modelos de inactivación al azar del cromosoma X
en mamíferos
Enjambre de factores bloqueadores
de la inactivación, que quedan finalmente
agregados y unidos a 1 solo X
Symmetry-Breaking Model for X-Chromosome Inactivation
modelado b) del “enjambre” de la diapo anterior mediante simulación computacional
Mario Nicodemi & Antonella Prisco
PHYSICAL REVIEW LETTERS (2007)
Variables independientes a setear::
• constante cinética de difusion "k" de Arrhenius
• E = energía de “pegado” entre moléculas de factor de
activación
(valor alto = molec. “pegajosa”)
• distancia entre los dos X
• tiempo
un X
el otro X
Variable dependiente (output):
distribución de moléculas en cada X
a medida que van apareciendo moléculas regulatorias…. When E = 0, a random walk diffusion is found.
The evolution is drastically different for E = 2.4kT, where
droplets (swarm) of particles are formed, ending up in a single
cluster overing just one of the two equivalent chromosomes and,
thus, breaking their binding symmetry.
El modelo encaja mejor cuanto menor sea la distancia
entre los dos Xs,
consistente con el modelo intuitivo del beso
También consistente con situación artificial de 3 X
y queda 1 solo activo
La molécula pegajosa de este modelo bien podria ser
un activador de Tsix. Channnn!
Y en insectos?
es al revés que en mamiferos:
Weake & Workman, Nature Structural & Molecular Biology 16, 801 - 803 (2009)
hay un complejo proteico acetilador de histonas
(HAT) en células de machos que garantiza la
doble expresión de genes en el único
cromosoma X para igualar el nivel de expresión
en hembras que tienen dos X !!
Para tener en cuenta….
• los genes sujetos a imprinting evaden las oleadas de metilación y
desmetilación que ocurren en la reprogramación epigenética en el
desarrollo embrionario temprano en mamíferos
• El imprinting puede perderse en animales clonados por transferencia
nuclear porque se forma un cigoto “parcialmente asexual” que no se
originó a partir de ambas líneas germinales, donde normalmente se
establecen las marcas de imprinting
• Se ha revelado el “imprintoma” de cerebro de ratón adulto (Gregg et
al, agosto 2010): cruzas de ratones endocriados de dos diferentes
cepas (para aprovechar polimorfismos y así después rastrear el origen
parental). En las crías F1 (heterocigotas) se hizo RNA-seq masiva
(pirosecuenciación de todos los cDNAs). Se observó sesgo en la
expresión materna o paterna de 1300 loci.
¿Y la ventajas adaptativas del imprinting?
Morison et al., Trends Genet. 21: 457-65 (2005)
Difíciles de hallar pues el imprinting hace perder la obvia ventaja de la diploidía
1) Hay una teoría (Ishino, Develop. Growth Diff., 2010), que sostiene que el imprinting
surgió en la evolución como defensa contra retrotransposición en una de las dos líneas
germinales (en ambas hubiera sido letal en la descendencia). Los autores la fundamentan
invocando a los genes parental expressed genes (peg), sujetos a imprinting, que tienen
DMRs con similitud de secuencia a los de retrotranposones
2) Hipótesis evolutiva del “Conflicto Genético”
(“cierra” para IGF2, pero no para IGF2-Receptor, que tiene el patrón de imprinting opuesto)
En especies que muestran paternidad mútiple en 1 evento reproductivo (“poliandria”)….
•
•
cada padre intenta privilegiar su propia paternidad a través del tamaño de su propia
descendencia, rivalizando con los otros padres. Y lo hace transmitiendo epialelos activos de
genes que promueven el crecimiento fetal, p. ej. IGF2.
un interés de la madre es distribuir equitativamente sus recursos en toda su progenie, aunque
nazcan pequeños. Y lo hace transmitiendo epialelos inactivos de genes que promueven el
crecimiento fetal, p. ej. IGF2.
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Además, en el caso de IGF2, la ausencia de imprinting causaría su “sobre-expresión” (bialélica, como en la mayoría de los genes) y mayor propensión al tumor de Wilms, como
sucede en BWS