Download clase presentacion Genetica Molecular 2016

Descubrimiento del DNA
siglo XIX
Johan Friedrich Miescher (Suiza, 1844-1895), biólogo y médico suizo
en plena revolución industrial
Cuando era estudiante, a partir de glóbulos blancos de
pacientes, o sus núcleos, tratados con solución salina
acidificada → precipitado gelatinoso que consistía en
sustancia rica en P y N, a la cual llamó nucleína (= el DNA
que llamamos hoy).
No se le atribuyó ninguna función biológica en esa época
A principios del siglo XX, en la Universidad de Columbia, Thomas
Morgan (1866-1945) y sus alumnos comprobaron que los “genes” son
“entes” que se encuentran alineados a lo largo de los cromosomas,
que veían al microscopio, consistentes con los resultados de Mendel, y
elaboraron mapas detallados de los cuatro cromosomas de la mosca
de la fruta.
Morgan recibió el premio Nobel en 1933.
Nacimiento de la Biología Molecular en el
mundo
Nace a partir de la Física
en el Siglo XX
Niels Bohr
físico danés (1885-1962) que realizó contribuciones fundamentales para la comprensión de la
estructura del átomo y la mecánica cuántica. Premio Nobel de Física en 1922.
Reconoció la importancia de las características atómicas, fundamentales en las funciones de los seres vivos:
certificado de defunción del vitalismo
Sin embargo, introdujo la idea de que los conceptos físicos tradicionales no son
suficientes para entender los fenómenos biológicos.
Estas ideas fueron presentadas en una conferencia titulada Light and life (Luz y vida),
en el Congreso Mundial de Luminoterapia en 1932, a la cual asiste Max Delbrück
Mientras tanto, escuelas de pensamiento más biológicas………
experimento pionero de transformación genética (1928!!)
Frederick Griffith (UK)
médico estudioso de la neumonía, atrás Hoy se interpreta así: DNA de cepa dadora (WT) complementó a
cepa receptora (mutante en algún gen de síntesís de la cápsula) mediante
de una vacuna (1879-1941)
recombinación homóloga
Max Delbrück (Berlín, nació ya en siglo XX, 1906)
Promotor de las ideas de Bohr, creció en el mismo barrio en que vivía el también físico Max Planck.
Doctor en Física, Universidad de Gotinga, importante polo de desarrollo de la naciente mecánica cuántica. Post-doc
en Dinamarca con Niels Bohr.
Delbrück comenzó a interesarse en la biología gracias a las ideas de Bohr .
Así, un pequeño grupo de físicos y biólogos empezaron a reunirse en la casa de Delbrück desde 1934. A partir de
estas reuniones surgió su corto artículo de1935 en el que proponía una explicación a las mutaciones inducidas por
rayos X con base en la mecánica cuántica, primera teoría molecular de la genética con base en principios físicos,
fuente de inspiración a Schrödinger: libro What is life? en 1944.
Gracias a una beca Rockefeller, en 1937 emigró a USA para trabajar con Morgan en Caltech. Sin embargo,
encontró difícil adaptarse a la jerga de los estudiosos de la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster), por lo que
empezó a colaborar con Emory Ellis investigando sobre fagos.
Al estallar la Segunda Guerra Mundial, en 1939, Delbrück decidió permanecer en USA, en el Departamento de
Física de la Universidad de Vanderbilt (Nashville, Tennessee) y así conoció al italiano Salvador Luria
(Bloomington, Indiana) y nació el club de los fagos de los 1940s
la idea de “gen” como entidad responsable
de los fenotipos heredables en bacterias
estaba flotando… pero no era formulada
claramente…los experimentos no incluían
estudios químicos
Salvatore Luria
Médico radiólogo y
estudiante posgr Física en Roma
y luego en Inst. Curie, de París a
USA (1940, plena II Guerra, Mussolini)
interesado igual que Barbara McClintock en
efectos biológicos de rayos X funda
el
“club de los fagos” junto a
Delbrűck y Hershey (premios
Nobel 1969) : las bacterias
exhiben fenotipos, detectados
por selección artificial, resultado
de cambios (mutaciones) que
ocurren ocasionalmente (10-9)
pre-adaptativos, heredables
“MUTATIONS OF BACTERIA FROM VIRUS
SENSITIVITY TO VIRUS RESISTANCE”
S. E. LURIA and M. DELBRUCK. 1943
dicen:
además descubrieron la “restricción” de los
fagos de multiplicarse en cepas bacterianas
diferentes de la original: concepto
antecesor (30 años) al de los sistemas
enzimáticos de modificación/restricción
(= escudo/armamento).
la idea del gen en el DNA estaba flotando….
Oswald Avery, (1877-1955). Médico e investigador canadiense, estudió en la Columbia Univ y trabajó en el
hospital del Instituto Rockefeller, NY, USA. Uno de los primeros biólogos moleculares
Repitió el experimiento de Griffith con lisados de bacterias transformantes pero previamente
digieriendo enzimáticamente azúcares, proteínas y RNA.
En 1944: el principio transformante era DNA!! (simultáneo con el libro de Erwin
Schrödinger “¿Qué es la vida?”)
entonces los “genes” reportados por el “club de los fagos” estaban hechos de DNA!
(aunque Delbrűck no citó a Avery luego de 1444)
Erwin Schrödinger
físico austríaco
(1887-1961)
En 1944 publicó un pequeño libro titulado ¿Qué es la vida? (What is life?). Aportó dos ideas
fundamentales:
1) la vida no es ajena a las leyes de la termodinámica.
2) la química de la herencia debe basarse en un «cristal aperiódico», compatible con una
secuencia informativa.
Esta obra menor ha tenido gran influencia en James Watson y en el desarrollo posterior de la
biología molecular.
…por lo tanto, la idea del gen en el ADN ya era
aceptada….pero cuál era su forma?
James Watson (1928-)
zoólogo
de USA tesista doctoral de
Luria, Ph. D. a los 22 años!:
“X-ray inactivated bacteriophages”
a UK (a aprender Química!:
la estructura del DNA)
con Max Perutz y
luego con Crick
Francis Crick
(UK) físico
Estructura de proteínas
por rayos X (con
Wilkins).
Se le unen Watson y
Peter Pauling en
Cambridge (1951)
Después también con Sidney
Brenner, Mathew Meselson:
concepto de mRNA (1960-1964)
por fin llegó el modelo correcto* de estructura 3-D de DNA
1953
inspirados por el libro de Schrödinger y las reglas (1950) de Erwin Chargaff (Austria, 1905-2002)
*en oposición al modelo incorrecto de Linus Pauling
(padre de Peter) de triple hélice con los fosfatos hacia adentro
regla
1) se fortalece la Biología como una ciencia en la cual “se mide”
2) el modelo era consistente con una supuesta fiel replicación del DNA
tomando como templado a sí mismo (A-T y C-G)
otros grosos en los 50s y 60s
cigarrillo!
François Jacob y Jack Monod
(con André Lwoff) introdujeron concepto de operones, operadores y
genes reguladores (1958) confirmado luego por Walter Gilbert, que
aisló la proteína represora (1966)
otros grosos en los 60s
Walter Gilbert
Boston, USA (1932- )
purificó el represor lac en 1967
Premio Nobel 1980
Severo Ochoa
España (1905-1933)
descifró el código genético, en USA
Premio Nobel 1959 (junto a su discípulo Arthur Kornberg)
Dijo: “el amor es la fundición de física y química». Joaquín Sabina
reconoce haber tomado de ahí el título para su álbum "Física y
Química".
dato no menor:
todos los brillantes científicos nombrados se
opusieron al régimen nazi imperante en
Europa (1933-1945)
→ la búsqueda de la verdad fue
acompañada de denuncias a la brutal
criminalidad y de sentimientos de
humanidad
y en las décadas siguientes….
los 70s: nacen la Biología y Genética Molecular, en Deptos
de Bioquímica, como las entendemos hoy, con la
posibilidad de manipular y analizar el DNA:
• vectores de clonado
• enzimas de restricción (Werner Arber, premio Nobel 1978)
• técnicas de secuenciación (Maxam-Gilbert; Sanger, Nobel 2
veces)
Descubrimiento de RT por David Baltimore (premio Nobel
1975)
los 80s:
ribozimas (Thomas Cech, premio Nobel 1989)
técnica PCR (Kary Mullis, premio Nobel 1993)
los descubrimientos y avances en las
décadas siguientes (1990s-2010s) los
veremos a lo largo de la
cursada……..
Genética Molecular
¿Qué onda esta materia?
historia de la materia
• 1998 (en su actual formato)
• # aprox alumnos: 1000 alumnos en total
han pasado
objetivos de la materia
• brindar al alumno herramientas conceptuales
• ejercitar el razonamiento en una amplia gama de aspectos de
la Biología Molecular moderna, con énfasis en aspectos
genéticos
p. ej. hablamos de:
• alelos
• recombinación genética
• mutaciones (dominantes vs. recesivas)
• modos de herencia
Priorizamos lograr:
• visión de cómo funcionan las células
• racionalidad en la elección de estrategias y organismos modelo
por sobre variantes de técnicas
• Enfrentar al alumnos con situaciones variadas
¿superposición con la materia Biología Molecular? No
asignaturas cuyos conocimienos
son necesarios
• IBMC
• Genética I
bibliografía
trabajos científicos originales y reviews
recomedados en
página web de la materia (www.fbmc.fcen.uba.ar
link materias, link Genética Molecular)
•
•
cómo se construye el conocimiento de primera mano
“verdades” no inmutables
organización general
actividades:
1) teóricas
2) seminarios (papers) y problemas de
ejercitación
3) TPs:
Epigenética. Herencia transgeneracional?
Modelo Drosophila
material didáctico
• Guía de Problemas de ejercitación basados en
papers científicos recientes
• Guía de Seminarios que incluye papers,
recientes (o no tanto, a propósito)
Ambas Guías son actualizadas todos los años.
Para figuras en color, visualizarlas en los archivos subidos al sitio web
Las clases teóricas correspondientes siempre son dictadas con
antelación.
tipos de evaluaciones
• escritas, a libro abierto (60% de la nota final)
• orales, en grupo (de a 3), exponiendo un
trabajo elegido por los alumnos de cada
grupo (25% de la nota final)
• oral de T.P. : (15% de la nota final)
• contenidos y conceptos más
importantes transmitidos
Origen de la vida
• Oparin, Darwin, Miller… ¿Meteoritos?
• CURIOSIDADES DEL MUNDO BIOLOGICO
PRIMITIVO:
• RNA como primera macromolécula. Riboorganismos, modelos de replicación de RNA sin
proteínas, con proto-ribosoma
• Genes con intrones en procariotas y por lo tanto
primitivos, intrones codificantes (RT como proteína
muy ancestral)
• Woese, celulas primitivas, Archeones extremófilos
• Teorías primeros eukas y organelas (hipótesis del
H2)
bloque 1:
Organizacion y evolucion de los
genomas
• Familias génicas, reloj molecular
• elementos repetitivos, junk DNA? desmitificar la
creencia de que no son codificantes p. ej:
• retrotranspones LINES llevan genes codif.
- posibles causas de su relativa inactividad
- ejemplos de enfermedades causadas por ellos
- estrategias para medir retroposición in vivo
• secuencias Alu (origen en primates) se transcriben
Abundancia relativa de elementos de ADN en
Genoma Humano.
Tipo de elemento de ADN
Genes para proteínas (incl. intrones)
Transposones (cientos de miles)
Genes de ncARN
Centrómeros
Telómeros
Repeticiones no transcriptas
el resto
(se supone regiones intergénicas)
%
33
45
1.3
0.75
0.01
3
17
retrotransposones: modelos de integración
simultánea a su síntesis por RT: targeted primed reversed
transcription
• Proyectos Genoma en general (mayor énfasis en Humano: Renato
Dulbecco [1914-2012])
• metodología general (virtudes de vectores BACs) y conclusiones
bioinformáticas.
• Técnicas modernas y rápidas: Deep (o highthroughput) sequencing
• Arrays: CGH y para genómica funcional (ej. primates, aportes de
Svante Paabo: Antropología Evolutiva)
Dinamismo del genoma
• Recombinación homóloga e ilegítima. Enfatizar
la usual baja frecuencia de la homóloga
• Reparación de DSBs
• Transposición:
• DNA transposones (Tn, P1 de Drosophila)
• RNA transposones (LINES, retro-like con LTR,
SINES no-autonómos, ej. Alu)
• Similitud de estos tres procesos a nivel bioq.:
corte, ligación, replicación (interfase genéticabioquímica)
Clonado e identificación de genes
por función o fenotipo
• Complementacion, Tn-tagging, Clonado
posicional (genética reversa) en plantas y
animales
Investigando función fisiológica de
genes clonados
• KO
• En unicelulares: bacterias y levaduras
• En mamíferos: antecedentes de Evans y Kaufman: ES
cells en cultivo para garantizar recombinación homóloga
targeted de baja frecuencia → necesidad de selección
de ES - KO → quimeras.
Increíble historia de Mario Capecci
• Nuevas tecnologías: Zn finger-nucleasas y CRISPR
Cromatina y epigenética
• Metilasas en citosinas, de novo y mantenimiento
• HATs/HDACs, metilacion en histonas,
metodologia ChIP
• Posicionamiento de nucleosomas y nuevos
conceptos de relación con transcripción y
splicing
• ¿Hay herencia transgeneracional de marcas
epigenéticas adquiridas debidas al
ambiente? (Lamarck?)
seguimos con la epigenética:
• stem cells
• iPSCs logradas por Shinya Yamanaka
seguimos con la epigenética:
Imprinting
Ejemplos de algunos genes sujetos al
fenómeno y de enfermedades
relacionadas.
DMRs, su metilación (o no) en gametas
como marca de futura expresión o noexpresión en células somáticas.
Modelos de exclusión alélica en cis
modelos
moleculares de
IMPRINTING
for
marcas epigenéticas de
futura no-expresión
“resetting”: se borra el viejo imprinting
y se establece nuevo imprinting
marcas epigenéticas
de
futura expresión
un ejemplo de imprinting:
Inactivacion del cromosoma
X
• trabajos de Jeannie Lee
ratones, placenta, canguros……...
Comprobación experimental del “modelo del
beso” (Jeannie Lee, Science 2006)
• Silenciamiento
TGS relación con epigenética
“paradox of the need for transcription in order to
transcriptionally silence the same region”
PTGS via RNAi maquinarias enzimáticas. Modelos
invertebrados, y plantas (evidencias de que la
señal atraviesa células). El mundo de los RNAs
pequeños
Valoración de científicos pioneros:
Macino, Baulcombe, Hannon
Ciclo celular
• los dos “bandos” de proteínas reguladoras
del ciclo: positivas y negativas
• Telómeros y telomerasas
de insectos: retrotransposones!!
aportes de Elizabeth Blackburn (Nobel 2009) y Tomas Cech
(Nobel 1989)
• Cáncer. Ejercicios de cómo interpretar pathways
bioquímicos para predecir efecto de drogas
terapéuticas
• Virus (DNA y RNA) oncogénicos
Terapia génica,
ejemplo de enfermedades (genes)
target, sobre todo usando vectores
basados en retrovirus
Ciclo de vida
de lentivrus
Ej.: HIV
para entender
retrovirus
defectivos
usados en
terapia génica
producción de partículas infectivas
deficientes en replicación
basadas en retrovirus
diseño con 3
construcciones:
Ψ
LTR
transgen
gag
neo
LTR
transfección
1)
3)
transcripción reversa
gag pol
2)
proteínas
virales
env
transducción
integración
mRNA
RNA
encapsidación
mRNA
RNA de 3
Célula empaquetadora
VIRION
recombinante
proteína
Célula destino
Genética Humana
• Tipos de enfermedades genéticas; causas
monogénicas y multifactoriales
• modos de herencia según la naturaleza de la
mutación: dominantes negativas y por haploinsuficiencia; recesivas
• Análisis de pedigrees
• Ejemplos:
• gen FOXP2 (lenguaje), síndromes neurológicos de
Angelman y Prader-Willi
• enfermedades causadas por mutaciones en genes
sujetos a imprinting
Ejemplo:
Beckwith–Wiedemann
syndrome (BWS):
●
-
se transmite por vía materna
- macroglosia
- hepatomegalia
- tumor de Wilms
CTCF es un aislante transcripcional:
impide la acción a distancia del enhancer
sobre IGF2 (no tiene efecto sobre H19)
región en cromosoma
11p15
Normalmente el alelo paterno
está metilado → CTCF no se pega
→ IGF2 se expresa
enhancer
CTC
F
Normalmente el alelo materno
no está metilado → CTCF se pega →
IGF2 no se expresa
En BWS, el alelo materno tiene una deleción
en DMR → CTCF no se pega →
IGF2 se expresa,
lo cual explica el tumor de Wilms (sobreexpresión de IGF2 a partir de ambos alelos)
Docentes GM 2016
en teóricas:
• Norberto Iusem
en seminarios/problemas:
• Ezequiel Surace
• Liliana Dain
• Rocío Sampayo
en TPs:
• Lucía Chemes
• Manuel Sánchez
• Paula dos Santos Claro