Download electroporación. células competentes

Competencia y Transformación
JA Cardé, PhD
Biol – 4019 -Lab Biología Celular
Molecular
Universidad de Puerto Rico - Aguadilla
Objetivos
• Definir los conceptos de células competentes
y transformación.
• Comparar y contrastar las ventajas y
desventajas de los diferentes métodos
utilizados para preparar células competentes.
• Preparar células competentes usando el
método de cloruro de calcio.
Introducción
• En muchas ocasiones el DNA purificado es
introducido en células eucariotas y microorganismos,
con la intensión de alterar el genotipo del recipiente.
• Existen varios mecanismos por los cuales las
bacterias pueden recombinar información
genéticamente.
• Transformación, la habilidad que posee una bacteria
de obtener una molécula de DNA exógeno e
insertarla en su propio genoma En algunas bacterias
la transformación es un proceso natural en otras es
un proceso creado por la manipulación humana.
Introducción …
• La técnica de transformación es utilizada en los
en Biología Celular y Molecular para introducir
artificialmente una molécula de DNA dentro de
una célula bacteriana.
• Este procedimiento permite amplificar clones
de DNA que serán utilizados para estudios y
análisis posteriores .
• La bacteria puede ser transformada con un
vector de expresión que contiene la secuencia
de DNA que codifica para la proteína
Células Competentes
• La membrana plasmática se compone de una
doble capa de fosfolípidos, que crea un
interior hidrofóbico que no permite el paso de
moléculas exógenos a través de ella.
• Varios métodos son utilizados para aumentar
la permeabilidad de la membrana plasmática
y que el DNA exógeno pueda atravesar la
barrera.
• método químico y electroporación.
• células competentes.
Método Químico
• La bacteria es tratada con altas concentraciones
de Cloruro de Calcio (CaCL2) y temperaturas frías
para aumentar la permeabilidad de la
membrana.
• Los iones de cloruro de calcio neutralizan la
repulsión entre la carga negativa de las cabezas
de los fosfolípidos y la carga negativa de los
grupos fosfatos del DNA.
• Las células competentes producidas por este
método pueden ser almacenadas a -70 ºC..
Electroporación
• El método de electroporación fue desarrollado
originalmente para transformar células eucariotas.
• Desde el 1988 se esta utilizando para transformar E. coli
y otras bacterias.
• Este método capitaliza la naturaleza débil de las
interacciones hidrofóbicas e hidrofílicas de la bicapa de
fosfolípidos y la capacidad espontánea de la membrana
de auto-sellarse después de un disturbio.
• La célula recibe una corriente eléctrica que altera
temporalmente la estabilidad de ciertas áreas de la
membrana plasmática, permitiendo que moléculas
polares puedan atravesar la membrana.
Electroporación
• La electroporación produce una transformación más
eficiente que los métodos químicos.
• La eficiencia de este procedimiento depende de la fuerza
del campo eléctrico, el largo del pulso eléctrico y la
concentración del DNA.
Materials
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Centrífuga clínica
Cloruro de Calcio 0.1 M
Cultivo de E. Coli
Hielo
Microtubos de 1.5 ml
Pipetas desechables de 5 ml
Pipetas desechables de 1 ml
Protocolo: Método Químico
• Obtenga un tubo con cultivo de E. coli y colóquelo por 10
minutos a 0º C (hielo).
• Centrifugue el tubo con el cultivo de E. coli por 10
minutos a 4,000 rpm.
• Decante el sobrenadante. Debe observar las células
formando un precipitado en el extremo inferior del tubo.
• Invierta el tubo sobre un papel toalla. Déjelo reposar por
un minuto. Esto permite eliminar cualquier residuo del
medio que quede en el tubo.
• Resuspenda el precipitado en 5 ml de 0.1 M CaCl2 (frío).
Colóquelo en hielo por 10 minutos.
Protocolo: Método Químico
• Centrifugue el tubo por 10 minutos a 4,000 rpm.
• Decante el sobrenadante. Invierta el tubo sobre un papel
toalla y déjelo reposar por un minuto.
• Resuspenda el precipitado de células competentes en
500 µl de 0.1M CaCl2 (frío).
• Transfiera los 500 µl de células competentes a un
microtubo de 1.5 ml.
• Rotule correctamente su microtubo y guárdelo a – 70º C.
Preguntas
Compare y contraste las semejanzas y diferencias entre los dos
métodos principales por los cuales las bacterias son inducidas al
estado de competencia.
Explique porqué algunas cepas de la bacteria E. coli pueden ser
inducidas al estado competente y otras cepas no.
¿Tendrá el CaCl2 el mismo efecto en una bacteria gram positiva que
en una bacteria gram negativa? Explique su respuesta.
¿Qué efecto tienen las temperaturas frías en la preparación de
célula competente a través del método químico?
Usted preparó células competentes por el método de cloruro de
calcio. ¿Cómo usted comprobaría que estas células se encuentran
en su estado de competencia? Explique su respuesta.