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Aislamiento de Acidos Nucleicos
Liza Jiménez, PhD, JA Cardé, PhD
Biol 4019 –
Lab Biología Celular Molecular
Universidad de Puerto Rico, Aguadilla
Objetivos
• Explicar diferentes métodos de aislamiento de
ácidos nucleicos.
• Contrastar las ventajas y desventajas de los
diferentes métodos de aislamiento de ácidos
nucleicos.
• Describir las funciones de las diferentes
soluciones utilizada en las técnicas de aislamiento
de ácidos nucleicos.
• Realizar una extracción de DNA utilizando los
métodos de lisis hipotónica, lisis enzimática y
fenol - cloroformo.
Introducción
• Los ácidos nucleicos y las proteínas se
encuentran bajo estudio constantemente.
• Los investigadores necesitan familiarizarse con las
técnicas utilizadas estudiarlas.
• Los problemas asociados con el estudio de estas
son particulares y únicos para cada uno: DNA,
RNA, proteínas
• Nos centraremos en el estudio de las técnicas de
aislamiento de ácidos nucleicos.
• Las técnicas de aislamiento de proteínas serán
discutidas posteriormente
DNA
• Molécula muy resistente
• La mayor preocupación es la contaminación.
• El DNA aislado puede ser genómico o extracromosomal
(figura 1). El DNA genómico es de gran tamaño
• El DNA extracromosomal es aislado de bacterias en
forma de fagos o plásmidos.
• El método de aislamiento y almacenamiento del DNA
extracromosomal es distinto al del DNA genómico.
• En este módulo estudiaremos las técnicas de aislamiento
de DNA genómico.
DNA Genómico vs Extracromosomal
Lísis
• El rompimiento o lísis celular es el primer paso
para obtener el DNA genómico.
• Varias técnicas son utilizados para provocar
lísis celular.
• Entre ellas se encuentran:
– lisis hipotónica
– lisis enzimática.
Métodos: Lisis Hipotónica
• Se utiliza una solución hipotónica que causa la hinchazón de la célula y
el rompimiento de la membrana plasmática y/o de la pared celular.
• Junto a las sales se pueden añadir detergentes, que ayudan a degradar
los lípidos de la membrana. (Detergentes no iónicos, i.e. Tween 20 y
Triton X-100, utilizados con células de mamíferos y detergentes iónicos
i.e. SDS para células con pared celular o cutícula externa que la
protege)
• En algunos casos es necesario utilizar un poco de fuerza mecánica
(homogenizadores y nitrógeno líquido).
• A veces bacterias, esporas y levaduras se agitan junto a glass beads.
• En otras ocasiones se utiliza nitrógeno líquido. Este equilibra la célula y
cuando la presión se libera, el nitrógeno sale de la solución formando
unas burbujas que rompen la membrana celular. El frío generado por el
nitrógeno protege las proteínas de ser degradadas.
Métodos: Lisis Enzimática
Parecida a la lisis hipotónica. Se utilizan las mismas soluciones y
detergentes anteriormente mencionados además de enzimas que catalizan
la reacción.
La función principal de la enzima es la degradación de los peptidoglicanos
presentes en la pared celular (i.e. bacterias Gram positivas). Entre las
enzimas utilizadas en esta técnica se encuentran lisozima y proteinasa K.
Posterior a la lisis hipotónica y la lisis enzimática se realiza una extracción
fenólica.
Utilizada para remover proteínas que se encuentran contaminando el DNA.
El fenol y/o cloroformo no se mezclan con el agua formando fases
separadas cuando se tratan de mezclar. Cuando la solución acuosa de DNA
se mezcla con fenol y/o cloroformo las proteínas se mueven a la fase
orgánica, formada por el fenol y/o cloroformo, dejando así el DNA en la
fase acuosa (figura 2).
La fase acuosa con el DNA se remueve y el DNA es precipitado utilizando
etanol y sales.
Extracción Fenólica
RNA
Su aislamiento es considerado más difícil que el de
DNA y es necesario utilizar una mayor precaución.
Por esta razón se sugiere el uso de reactivos y
amortiguadores preparados por compañías
especializadas para la preparación de los mismos.
Algunos de estos reactivos y amortiguadores son
específicos para el aislamiento de mRNA que
comprende, generalmente, entre un 5-10 % del RNA
total en una célula.
Materiales
4 M Acetato de amonio (Sodio)
Agitadores de vidrio
Centrífuga clínica
Cloroformo
Cultivo de Bacterias
DEB
Etanol al 95 %
Fenol
MIcrocentrifuga
Micropipetas
Microtubos de 1.5 ml
Mosquitos
Pipetas desechables
Plato agitador
Propipetas
Puntas para micropipetas
Tubos de ensayo de 5 ml
DEB
Reactivo
Volumen
Concentración Final
SDS
50 mg
0.5 %
Tris 1M pH 8.0
EDTA 0.5M
0.1ml
0.5 ml
10mM
25 mM
NACl 5M
0.4 ml
0.2M
C1V1 = C2V2
Protocolo: Mosquito
1) Coloque un mosquito en un tubo de 1.5 ml. Añada 500 µl del amortiguador DEB*.
2) Utilizando un agitador de vidrio previamente esterilizado homogenice el mosquito
hasta que no observe pedazos grandes del mismo.
3) Añada 500 µl de fenol y mezcle utilizando el vortex.
4) Centrifugue por 10 minutos a 12,000 rpm.
5) Transfiera el sobrenadante a un tubo limpio de 1.5 ml (figura 2) y añada 250 µl de
fenol y 250 µl de cloroformo. Mezcle utilizando el vortex.
6) Centrifugue por 5 minutos a 12,000 rpm.
7) Transfiera el sobrenadante a un tubo limpio de 1.5 ml y añada 250 µl de
cloroformo. Mezcle utilizando el vortex.
8) Centrifugue por 5 minutos a 12,000 rpm.
9) Transfiera el sobrenadante a un tubo limpio de 1.5 ml y añada 27 µl de 4M acetato de
amonio y 473 µl de 95 % etanol.
10) Coloque el tubo de 1.5 ml sobre el plato agitador y agite por 10 minutos. Guarde el
tubo a – 20 ºC hasta el próximo laboratorio
Protocolo: Bacterias I - Hipotónica
1) Centrifugue por 10 minutos el tubo de ensayo que
contiene en un medio líquido las bacterias.
2) Descarte el sobrenadante y retenga el precipitado de
bacterias. Añada 1 ml del amortiguador DEB* y 1 ml
de fenol. Mezcle utilizando el vortex hasta que no
observe el precipitado de bacterias.
3) Centrifugue por 10 minutos a 4,000 rpm.
4) Transfiera el sobrenadante a un tubo de ensayo
limpio (figura 2) y añada 500 µl de fenol y 500 µl de
cloroformo. Mezcle utilizando el vortex.
5) Centrifugue por 5 minutos a 4,000 rpm.
Protocolo: Bacterias I cont
5) Centrifugue por 5 minutos a 4,000 rpm.
6) Transfiera el sobrenadante a un tubo de ensayo
limpio y añada 500 µl de cloroformo. Mezcle
utilizando el vortex.
7) Centrifugue por 5 minutos a 4,000 rpm.
8) Transfiera el sobrenadante a un tubo limpio de 1.5
ml y añada 27 µl de 4M acetato de amonio y 473 µl
de 95 % etanol.
9) Coloque el tubo de 1.5 ml sobre el plato agitador y
agite por 10 minutos. Guarde el tubo a – 20 ºC hasta
el próximo laboratorio.
Protocolo Bacteria II - Enzimática
•1) Centrifugue a 4,500 g por 20 min.
•2) Añada 1 ml de Buffer de Lysis con 15 µl de
Proteinasa K (200 µg/ml).
•3) Deje por 30 min a 56 ˚ C.
•4) Deje por 10 min a 95 ˚ C
•5) Añada 20 µl de RNasa (1.5 mg/ml) y déjelo a 37 ˚ C
por 30 minutos.
•6) Deje por 15 min a 70 ˚ C
Protocolo de Bacteria II … continuación
•7) Añadir (Lavar) igual volumen de 95 % de etanol.
– Guardar a -20 por una semana.
•8) Centrifugue a 12,000 rpm por 5 minutos
•9) Lavar 3 X veces con 70 % etanol. (1
•10) Después de cada lavada centrifuge a 12,000 rpm
por 5 minutos.
•11) Hidratar con 30-50 % de TE.
Preguntas
 ¿Por qué necesitamos utilizar un sistema de
homogenización cuando aislamos DNA de mosquito?
 Mencione y explique 3 métodos para prevenir la
contaminación del DNA.
 Cuando la solución acuosa de DNA se mezcla con fenol y/o
cloroformo las proteínas se mueven a la fase formada por
el fenol dejando así el DNA en la fase acuosa. Explique este
fenómeno haciendo referencia a la estructura y enlaces de
las macromoléculas.
 Mencione y explique 3 técnicas utilizadas para el
aislamiento de DNA que no se hayan discutido en clase.
 Explique la función de los 4 reactivos del DEB.
Virtual Labs
• DNA Extraction
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