Download Guiones

Construcción DNA recombinante
1
Práctica 1
CLONAJE DE GENES EN PLÁSMIDOS BACTERIANOS: Construcción del
DNA recombinante
Introducción
Los plásmidos bacterianos son moléculas de DNA extracromosómico capaces de
replicar autónomamente. La mayoría están constituidos por un DNA bicatenario circular
cerrado de tamaño muy variable (1 a >200 kb), que se puede aislar de la bacteria en
forma superenrollada. Se encuentran en una gran variedad de especies bacterianas, pero
suelen tener un rango de hospedador estrecho. La replicación y transcripción de los
plásmidos dependen, en mayor o menor extensión, de proteínas codificadas por genes
de la bacteria. A su vez, los plásmidos contienen con frecuencia genes que codifican
enzimas útiles para la bacteria hospedadora como genes de resistencia a o producción de
antibióticos, de degradación de compuestos orgánicos, de toxinas, y de producción de
enzimas de restricción y modificación, entre otros.
Los plásmidos pueden utilizarse como vectores de clonaje y amplificación de
fragmentos de DNA que se hayan insertado en los mismos mediante técnicas de
Ingeniería Genética. Estos fragmentos replican y se transmiten a las células hijas
conjuntamente con el resto del plásmido. Los primeros plásmidos usados como vectores
eran de origen natural, pero en la actualidad se usan plásmidos modificados en los que
se han introducido características útiles para el clonaje, a expensas de eliminar muchas
secuencias innecesarias del plásmido original. Por ejemplo:
1. Marcadores de selección. Generalmente genes de resistencia a antibióticos como
ampicilina, kanamicina, tetraciclina, etc.
2. Un sitio de policlonaje que es una secuencia sintética que contiene las secuencias
reconocidas por varias enzimas de restricción.
3. Este sitio de policlonaje puede estar insertado dentro de un gen marcador lo que
permite la selección directa de los recombinantes. Por ejemplo, existen plásmidos en
los que el sitio de policlonaje se encuentra dentro de una secuencia de DNA que
codifica un fragmento () N-terminal de la -galactosidasa. En la Práctica 2
usaremos este gen marcador para la selección de transformantes.
4. El origen de replicación deriva normalmente del plásmido ColE1. Este origen
permite conseguir un número de copias elevado del plásmido. Muchos plásmidos
que se usan en Ingeniería Genética, como el que usamos en estas prácticas,
contienen un segundo origen de replicación derivado de un fago con DNA
monocatenario (M13, f1), que permite replicar una sola de las cadenas del plásmido
originando copias monocatenarias del DNA clonado, útiles para secuenciación,
mutagénesis, etc.
5. Promotores de fagos (T7, SP6) delante del sitio de policlonaje. Útiles para la
transcripción in vitro del DNA clonado, o para su expresión regulada in vivo si el
plámido recombinante se introduce en bacterias que expresan la RNA polimerasa
viral.
6. En los vectores de expresión, se suelen introducir además de promotores regulables,
para expresar el gen clonado en respuesta a cambios en las condiciones de cultivo, la
secuencia Shine-Dalgarno (“ribosome binding site”, RBS) que confiere alta
eficiencia de traducción, y una secuencia de nucleótidos que codifica un pequeño
polipéptido (una “etiqueta”) que puede ser reconocido por anticuerpos específicos.
El gen clonado y la etiqueta se expresan conjuntamente originando una proteína de
Construcción DNA recombinante
2
fusión, fácilmente detectable con los anticuerpos. También existen “etiquetas” (p.ej.
6 His) que permiten la purificación rápida de la proteína de fusión por cromatografía
de afinidad.
7. Muchos plásmidos vectores contienen secuencias complementarias a “primers”
universales que permiten secuenciar cualquier inserto introducido.
Las enzimas de restricción del tipo II constituyen la herramienta enzimática esencial
para la construcción de DNAs recombinantes. Se trata de endonucleasas que reconocen
secuencias cortas y específicas en el DNA, cortándolo por dicha región siempre que
determinadas bases de la secuencia no estén metiladas. Existen enzimas de restricción,
denominadas isoesquizómeras, que reconocen total o parcialmente la misma secuencia.
El corte puede producir extremos protuberantes (también denominados cohesivos) o
romos. Se denominan con varias letras y un número romano. La primera letra se refiere
al género, las dos siguientes a la especie y la última a la cepa de la bacteria de donde se
aisló. Los números se usan cuando hay más de un sistema de restricción-modificación
en la misma bacteria. Otras enzimas importantes en la construcción de DNAs
recombinantes son las DNA ligasas, que catalizan la formación del enlace fosfodiéster
entre los extremos 3´-OH y 5´-P adyacentes en un DNA, utilizando como cofactor ATP
o NAD+. La más usada es la DNA ligasa del fago T4 que puede unir extremos
cohesivos e incluso romos en presencia de ATP/Mg2+.
El fraccionamiento, identificación y purificación de moléculas de DNA se hace
normalmente mediante electroforesis en geles de agarosa (o de poliacrilamida cuando se
quieren resolver pequeños fragmentos de DNA de tamaños muy parecidos ya que tiene
mayor nivel de resolución). La agarosa es un polímero lineal constituido por unidades
alternantes de D- y L-galactosa unidas por enlaces glicosídicos -(13) y -(14). Se
funde bien a temperaturas elevadas y al bajar la temperatura gelidifica formando un
entramado tridimensional con poros de un diámetro entre 50 nm - >200 nm. En estos
geles, las moléculas lineales de DNA migran hacia el polo positivo con una velocidad
inversamente proporcional a su tamaño, dentro de ciertos límites. Estos geles también
son útiles para distinguir diversas estructuras que puede formar una misma molécula de
DNA bicatenaria, como DNA lineal, DNA circular cerrado superenrollado o DNA
circular abierto. La movilidad del DNA lineal depende principalmente de su tamaño, de
la presencia o no de agentes intercalantes, del voltaje aplicado, de la concentración
iónica del tampón de electroforesis y de la concentración de agarosa, ya que a mayor
concentración menor es el tamaño del poro formado. Por lo tanto, se deben usar
concentraciones más altas a medida que se desea analizar moléculas más pequeñas de
DNA. A los geles de agarosa se suele añadir bromuro de etidio (3,8 diamino-6-etil-5fenilfenatridium bromuro) para visualizar el DNA. Este compuesto, que es un mutágeno
y carcinógeno muy potente, se intercala entre las bases del DNA. Absorbe radiaciones a
302 y 366 nm (emitidas por las fuentes comerciales de luz ultravioleta), reemitiendo
parte de la energía absorbida a 590 nm, que corresponde a la región rojo-naranja del
espectro visible.
Para la construcción de un plásmido recombinante que contenga el fragmento de
DNA que deseamos clonar, el plásmido vector elegido se digiere con una o dos enzimas
de restricción y, posteriormente, se incuba con el DNA que se desea clonar, conteniendo
extremos compatibles con los extremos generados en el vector, y DNA ligasa.
Construcción DNA recombinante
3
Objetivos
En esta primera práctica se pretende que el alumno obtenga una visión global de los
pasos experimentales que hay que realizar para construir un plásmido recombinante
constituido por el plásmido vector y un fragmento de DNA insertado en el mismo. En
concreto, como vector elegimos inicialmente el plásmido de expresión pRSET-T7
(http://products.invitrogen.com), por tener unas características muy interesantes que se
discutirán en prácticas, y como fragmento de DNA a insertar un cDNA que codifica el
factor de iniciación de la traducción eIF4E de Drosophila melanogaster. Este cDNA fue
aislado a partir de una genoteca de expresión de D. melanogaster construida en el fago
lambda, y posteriormente clonado en el sitio EcoRI del plásmido pBluescript
(www.stratagene.com; http://www.genomics.agilent.com). En consecuencia, el proceso
de construcción del plásmido recombinante en esta Práctica consistiría en:
1) Digestión del plásmido recombinante pBluescript-cDNA(eIF4E) y del plásmido
vector pRSET-T7 con EcoRI. Análisis cualitativo de los productos de la digestión
mediante electroforesis en gel de agarosa.
2) Purificación del pRSET-T7 digerido mediante extracción con fenol/cloroformo y
precipitación con etanol.
3) Aislamiento y purificación del cDNA(eIF4E) mediante electroforesis preparativa en
gel de agarosa, elución de la banda correspondiente al cDNA del gel y
cromatografía.
4) Cuantificación de las concentraciones de ambos DNAs lineales purificados
(pRSET-T7 y cDNA) mediante electroforesis analítica en gel de agarosa.
5) Ligación de los dos DNAs lineales en presencia de DNA ligasa del fago T4.
Sin embargo, dado el tiempo oficialmente permitido para el desarrollo del conjunto
de prácticas (experimentales y de ordenador) de esta asignatura, se ha optado por hacer
un protocolo experimental alternativo al anterior mucho más reducido, que se resume en
los siguientes apartados:
1) Digestión del plásmido recombinante pBluescript-cDNA(eIF4E) con EcoRI.
Análisis cualitativo de los productos de la digestión mediante electroforesis en gel
de agarosa.
2) Purificación de los productos de la digestión (pBluescript y cDNA) mediante
extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol.
3) Ligación de los dos DNAs lineales en presencia de DNA ligasa del fago T4. Es
decir, se reconstruye el plásmido recombinante original.
Es importante destacar que esta modificación del protocolo experimental tiene varias
ventajas, adicionales al objetivo de reducción del tiempo, que se resumen en: a) La
utilización del plásmido pBluescript nos permite hacer una doble selección (resistencia
a ampicilina y color de las colonias) para distinguir los clones bacterianos que contienen
el plásmido recombinante de los clones que contienen el plásmido recircularizado sin
inserto según se verá en la Práctica 2. Por el contrario, el plásmido pRSET no permite
esta doble selección. b) La ligación del DNA vector (pBluescript) con el cDNA no se
hace en una relación molar óptima lo que nos permite introducir al alumno aspectos de
cuantificación de DNA, a los que está poco habituado, e interpretativos del resultado
obtenido (% de bacterias con plásmido recombinante). Por otra parte, el protocolo
reducido no ofrece ninguna desventaja significativa pues los alumnos siguen realizando
todas las técnicas previstas en el protocolo inicial ya que una cromatografía similar a la
suprimida en esta Práctica se realiza en la Práctica 3 y en las Prácticas 3 y 4 se hacen
dos electroforesis adicionales en geles de agarosa.
Construcción DNA recombinante
4
Materiales
Nota: Se utiliza material estéril. Material de vidrio y plástico se esteriliza en autoclave.
Medios líquidos, a excepción de compuestos orgánicos (fenol, cloroformo, etanol), se
esterilizan en autoclave o por filtración.
Equipo y Materiales generales ubicados en las mesas y vitrinas laterales:
 Papel para secarse las manos; Jabón y escobillas; Papel de filtro; Pinzas; Cinta
adhesiva de colores y para autoclave; Asas de siembra (6-12); Asas de extensión de
plástico estériles (o de vidrio y vasos con etanol para esterilizarlas); Rotuladores
para pizarra de varios colores y borrador; Probetas, vasos y matraces de
vidrio/plástico de diversos tamaños; Pipetas estériles de 1 ml y 5 ml; Propipetas;
Bolsas con tubos eppendorf de todos los tamaños y puntas de pipeta para reponer;
Bolsas de plástico grandes para desechar material contaminado con Bromuro de
Etidio (1) y placas de Petri usadas (1); Dos baños termostatizados con agitación a
37ºC: uno con gradilla para tubos de dilución y flotadores para tubos eppendorf; y el
otro con abrazaderas para matraces de 100 ml y 25 ml; Frigorífico con congelador;
Transiluminador luz UV y gafas protectoras (y/o pantalla protectora); Bloque
térmico; Espectrofotómetro y cubetas de plástico; Pipetas Pasteur de plástico;
Equipo PCR; Estufa a 30-37ºC; Balanza/granatario para equilibrar tubos con dos
vasos; Centrifuga de mesa con rotor para tubos Falcon de 50 ml; Balanza de
precisión; Papel de aluminio para pesar; Espátulas; Microondas y guantes
aislantes(2); Maquina de hacer hielo y contenedores para hielo; Agarosa
(Hispanaagar, low electroendosmosis).
Equipo y Materiales generales ubicados en las mesas (3) de los alumnos:
 Papel de filtro (1/pareja); Guiones de prácticas (1/alumno); Gradillas plástico
(1/pareja); Gradillas acero para tubos dilución (2/mesa); Gradillas para tubos
eppendorf de 0,1 ml (2/mesa); Pipetas automáticas (1 juego/pareja); Puntas de pipeta
estériles de tres tamaños (2 juegos/mesa); Contenedores para desecho de las puntas
(2/mesa); Tubos eppendorf estériles en botes de vidrio de 1,5 ml, 0,5 ml y 0,1 ml (2
juegos/mesa); Rotuladores para tubos (2/mesa); Parafilm (1/mesa); Tijeras (1/mesa);
Guantes tres tamaños (1 juego/mesa); H2O estéril (2 botellas de 50 ml /mesa);
Equipos de electroforesis (1/mesa para la Practica 1; 2/mesa para las Prácticas 3+4);
Fuentes de alimentación (1/mesa); Microfugas (1-2/mesa); Matraces de 250 ml
(1/mesa) y probetas de 100 ml (1/mesa); Garrafa con H2O destilada (1/laboratorio);
Mecheros de gas (2-4/mesa) y cerillas (2/mesa);
Otros materiales necesarios para la Práctica 1:
 Plásmido
recombinante
pBluescript
www.stratagene.com;
http://www.genomics.agilent.com)
con
el
cDNA(eIF4E)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ; “search: nucleotide, “for”: U16139; referencia
original: Hernández, G. & Sierra, J. M. 1995 Biochim Biophys Acta 1261,427-31)
clonado en el sitio EcoRI. Sin diluir y diluido 1/20.
 EcoRI y tampón H para la reacción de digestión. Consultar características en la
información de la casa comercial que tiene el Profesor.
 Tampón TAE: 40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA.
 Bromuro de etidio (5 mg/ml).
 Marcadores de masa molecular de DNA del fago 29 digerido con HindIII.
Construcción DNA recombinante
5
 Tampón de carga de electroforesis (6X) que contiene los colorantes bromophenol
blue y xylene cyanol FF, así como sacarosa o glicerol en agua.
 Fenol (Sigma). Antes de la práctica preparar alícuotas de 0,5 ml en tubos eppendorf
(2/mesa).
 Cloroformo (Merck). Antes de la práctica preparar alícuotas de 0,5 ml en tubos
eppendorf (2/mesa).
 3 M NaAc, pH 5,2. Antes de la práctica preparar alícuotas de 0,5 ml en tubos
eppendorf (2/mesa).
 Etanol (Merck). Varias botellas conteniendo etanol absoluto y etanol al 70% en agua
destilada estéril. Se guardan en el congelador del frigorífico.
 DNA ligasa del bacteriófago T4 y tampón de ligación. Consultar características en
la información de la casa comercial que tiene el Profesor.
Procedimiento
A) Digestión del plásmido recombinante pBluescript-cDNA(eIF4E) con EcoRI.
1. Preparar el termoblock a 37ºC.
2. En un tubo eppendorf de 1,5 ml, rotulado con el número de la pareja, preparar la
mezcla de incubación siguiente, añadiendo los componentes en el orden indicado
(el alumno debe calcular previamente los volúmenes a añadir de DNA, tampón H
y H2O estéril):
Componente
Concentración
del stock
Concentración o
cantidad requerida
en la mezcla de
incubación
Volumen a
añadir
H2O estéril
l
Tampón H
10X
1X
l
DNA (pBlue-4E)
4000
ng
0,8 g/l
l
EcoRI
10 unidades/l
2 l*
Volumen final
25 l
* EcoRI se suministra en un tampón que contiene 50% glicerol. Las concentraciones
superiores al 5% de glicerol en la mezcla de digestión pueden afectar a la actividad
enzimática por lo que el volumen de EcoRI no debe superar 1/10 del volumen final de la
mezcla de reacción.
3. Poner los tubos en el termoblock e incubar a 37ºC durante 60-90 min.
4. Detener la reacción elevando la temperatura del termoblock a 65ºC e incubando
las muestras durante 5 min.
5. Mantener las muestras en la nevera hasta su uso.
B) Análisis de los productos de la digestión mediante electroforesis en gel de agarosa en
presencia de bromuro de etidio.
Notas de advertencia importantes sobre posibles peligros:
 El bromuro de etidio es un agente mutagénico y carcinogénico muy potente. Es
obligatorio usar guantes para su manipulación y la de los geles, cubetas, puntas de
Construcción DNA recombinante


6
pipeta, etc., que hayan estado en contacto con este compuesto. Si hubiese que
preparar una disolución stock habría que usar mascarilla para pesarlo.
La electroforesis se realiza con corriente continua a 100 voltios por lo que una
descarga eléctrica es peligrosa. Si fuese necesario manipular la cubeta durante la
electroforesis hay que desenchufar previamente la fuente de alimentación.
La visualización de las bandas de DNA en el gel de electroforesis se hace haciendo
pasar luz ultravioleta a través del gel. Está absolutamente prohibido mirar el gel sin
la debida protección con gafas y/o pantalla protectoras para evitar que la luz UV
dañe la retina del ojo.
Se preparará un único gel por mesa por lo que las operaciones que se indican a
continuación se deben distribuir entre los alumnos de cada mesa como se considere más
oportuno:
1. Preparar el soporte donde se colocará la agarosa sellándolo con cinta adhesiva en los
dos laterales abiertos y colocar el peine adecuado en la posición indicada. Mantener
encima de un papel de filtro fuera de la cubeta de electroforesis.
2. Una pareja de alumnos se encargará de preparar 2-3 litros de tampón TAE (1X) a
partir de un stock TAE (50X) y de distribuir a todas las parejas y mesas.
3. Preparar el gel de agarosa al 1%:
 Pesar 0,7 g de agarosa y ponerla en un matraz de 250 ml.
 Añadir 70 ml de TAE (1X).
 Calentar en el microondas hasta que la agarosa quede fundida (unos 2 min).
Sacar el matraz usando guantes aislantes.
 Dejar enfriar unos minutos y añadir 7 l de una disolución stock de bromuro de
etidio de 5 mg/ml (concentración final en el gel: 0,5 g/ml).
 Verter inmediatamente en el soporte preparado según el apartado 1. Dejar unos
10 min en reposo para que el gel polimerice.
 Retirar con cuidado la cinta adhesiva y el peine e introducir el soporte con el gel
en la cubeta de electroforesis (¿dónde deben quedar situados los pocillos del gel
con respecto a los electrodos de la cubeta?).
 Añadir suavemente tampón TAE (1X) hasta sobrepasar el nivel del gel.
Nota: Normalmente el tampón TAE (1X) usado en la electroforesis se suplementa
con bromuro de etidio (concentración final 0,5 g/l) para mejorar la visualización
de las bandas de DNA. Sin embargo, nosotros no lo añadimos para evitar la
generación de grandes volúmenes de material de desecho que no pueden ser
eliminados por la pila. En todo caso, la visualización de las bandas de DNA en
nuestras condiciones es adecuada.
4. Aplicación de las muestras y electroforesis:
 Preparar ocho tubos eppendorf de 0,5 ml según se indica en la Tabla siguiente:
Construcción DNA recombinante
1
3 l
Mezcla de digestión
Parejas 1(5, 9)
Mezcla de digestión
Parejas 2 (6, 10)
pBlue-4E sin digerir
(dilución 1/20)
Marcadores DNA
(29)
Mezcla de digestión
Parejas 3 (7, 11)
Mezcla de digestión
Parejas 4 (8, 12)
pBlue-4E sin digerir
(dilución 1/20)
o
Mezcla de digestión
de una pareja
Marcadores DNA
(29)
o
Mezcla de digestión
de una pareja
H2O
(ajustar hasta 10 l)
7 l
Tampón de carga
(6X)
2 l
2
7
3
4
5
6
7
8
3 l
6 l
4 l
3l
3 l
4 l
o
1 l
3 l
o
1 l
7 l
4 l
6 l
7 l
7 l
2 l
2 l
2 l
2 l
2 l
6 l
o
9 l
2 l
7 l
o
9 l
2 l
Nota: Calcular los ng de DNA total presente en la mezcla de digestión y en la muestra
del pBlue-4E sin digerir que ha puesto en cada tubo.





Aplicar suavemente los 12 l totales de cada muestra en los pocillos
correspondientes del gel. Hay que evitar perforar el fondo del pocillo o que la
muestra se salga por la parte superior del mismo. Cada alumno debe aplicar una
muestra.
Cerrar con cuidado la cubeta de electroforesis y conectarla a la fuente de
alimentación. Correr la electroforesis a 100 V durante 90-120 min (hasta que el
colorante azul esté próximo al final del gel). El bromophenol blue migra
aproximadamente como un DNA bicatenario lineal de 300 bp (prácticamente
con el frente) y el xylene cyanol FF como un DNA bicatenario lineal de 4 kb.
Parar la electroforesis y desconectar la cubeta de la fuente de alimentación.
Sacar el soporte con el gel escurriéndolo bien y ponerlo encima de un papel de
filtro doblado.
Llevar el soporte con el gel al transiluminador y visualizar los DNAs haciendo
pasar luz ultravioleta. NO mirar el gel sin gafas o pantalla protectora. Se pueden
sacar fotografías con ayuda de un teléfono móvil que tenga cámara fotográfica.
Analizar los resultados obtenidos y contestar a las preguntas que se formulan en
el apartado de “Resultados y cuestiones”.
Construcción DNA recombinante
8
C) Purificación de los productos de la digestión (pBluescript y cDNA) mediante
extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol.
1. Pasar la mezcla de digestión restante conteniendo los dos DNAs a un tubo
eppendorf de 0,5 ml, estimando el volumen remanente. El tubo debe estar marcado
con el número de pareja.
2. Eliminar la proteína contaminante añadiendo un volumen de fenol saturado y
mezclar bien.
3. Centrifugar a 12000 rpm en microfuga durante 2 minutos a temperatura ambiente.
NOTA: Como los tubos de 0,5 ml son mas pequeños que los huecos de la centrifuga
hay que ponerlos DENTRO de un tubo eppendorf de 1,5 ml al que se ha cortado
previamente la tapa.
4. Retirar la fase acuosa (la superior), con cuidado de no recoger la interfase que
contiene la proteína desnaturalizada, y pasar a otro tubo eppendorf de 0,5 ml,
marcado con el número de pareja, estimando el volumen recogido.
5. Si el volumen de esta fase acuosa es superior a 15 l (si es inferior NO es
aconsejable hacer la extracción con cloroformo), añadir un volumen igual de
cloroformo, mezclar bien y repetir la centrifugación y obtención de la fase acuosa
como antes (pasos 3 y 4). El cloroformo elimina los restos de fenol que queden en la
fase acuosa.
6. Precipitar el DNA añadiendo a la fase acuosa final (la obtenida después de la
extracción con fenol o con cloroformo) 1/10 vol final de 3M NaAc, pH 5.2 y 2
volúmenes de etanol absoluto (enfriado a –20ºC). Mezclar suavemente y guardar en
el congelador del frigorífico hasta el día siguiente.
7. Al día siguiente, sacar los tubos del congelador y centrifugar a 12000 rpm en
microfuga durante 15 minutos. Marcar la posición del tubo en la microfuga.
Decantar el sobrenadante sobre un papel de filtro.
8. Lavar el precipitado de DNA añadiendo 300 l de etanol al 70%. Agitar suavemente
y centrifugar de nuevo en la microfuga durante 5 minutos. Decantar el sobrenadante
sobre un papel de filtro y con golpecitos suaves para eliminar el resto de líquido.
9. Dejar secar a temperatura ambiente unos 5 minutos, manteniendo el tubo abierto
entre los dedos.
10. Resuspender el DNA en 20 l de agua destilada estéril. Guardar en nevera hasta su
uso. Los tubos deben seguir marcados con el número de la pareja.
D) Ligación de los DNAs linearizados y desproteinizados (cDNA del eIF4E y plásmido
pBluescript).
1. Preparar un tubo eppendorf de 0,1 ml marcado con el número de cada pareja
conteniendo los componentes siguientes, añadidos en el orden que se indica:
Componente
Volumen
H2O estéril
7 o 5 l
Tampón para la ligasa (10X)
1
1 l
Mezcla de DNAs resuspendidos
1 o 2 l
en 20 l de H2O estéril (*)
DNA ligasa de T4 (1 U/l)
1 o 2 l
Volumen final
10 l
(*) Hay que tener presente que para favorecer la formación de moléculas recombinantes
se debe usar, como mínimo, una razón molar inserto/vector de 3/1. Los alumnos deben
Construcción DNA recombinante
9
determinar la razón molar que usamos en este experimento y qué implicaciones tendrá
en relación con los porcentajes de colonias bacterianas que se obtendrán conteniendo el
plásmido recombinante y el plásmido recircularizado sin inserto.
2. Incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos (normalmente la incubación se
hace a 16ºC durante toda la noche).
Resultados y cuestiones
1) a) Buscar la secuencia de nucleótidos del cDNA del eIF4E de Drosophila
melanogaster usado en esta práctica en la base de datos del NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ; “search: nucleotide, “for”: U16139). b) Fíjese en la
secuencia de aa de la proteína codificada y deduzca los codones de iniciación y
terminación de la traducción usados. c) ¿Cómo buscaría vd el codón de iniciación
de un mRNA que codifica una proteína eucariótica?. Explique la respuesta. ¿Podría
aplicar el mismo criterio para un mRNA procariótico?.
Nota: El mapa de restricción de este cDNA, con ayuda del programa informático
accesible en la dirección: http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php , lo hará en las
prácticas de Bioinformática de esta asignatura. ¿Esperaría vd encontrar una diana
para EcoRI dentro de este cDNA?. Explique la respuesta.
2) Busque los mapas de los plásmidos pBluescript (Stratagene), usado en esta práctica,
y pRSET-T7 (Invitrogen) y explique de forma concisa en su cuaderno de prácticas
las características que le parecen más significativas y útiles de los mismos.
3) En la Figura se muestra un gel semejante al obtenido en esta Práctica: plásmido
recombinante pBluescript-cDNA(eIF4E) digerido (canales 2, 3) o sin digerir
(canales 4, 5) (160 ng, canales 2, 4 y 320 ng, canales 3, 5); marcadores de DNA de
29 digerido con HindIII (canales 1, 6) cuyos tamaños (en pb) y cantidades (en ng)
se indican en la Tabla. En su cuaderno de prácticas dibuje un esquema del resultado
real obtenido en su mesa y conteste a las preguntas siguientes: a) ¿Hubo digestión
del plásmido recombinante?, ¿Fue una digestión parcial o completa?. b) ¿Cuáles
son los tamaños aproximados (en pb) de los DNAs obtenidos en la digestión?. ¿Son
los tamaños esperados?. c) ¿Puede vd deducir alguna conclusión al comparar la
movilidad del plásmido recombinante no digerido con respecto a la movilidad de los
dos DNAs linearizados?. Explique su respuesta. d) ¿Podría vd estimar, de forma
aproximada, la cantidad de DNA presente en las bandas correspondientes al
cDNA(eIF4E) y al pBluescript linearizado resultantes de la digestión?. ¿Por qué
disminuye la cantidad de DNA presente en las bandas al disminuir el tamaño del
fragmento?.
Fragmento Tamaño (pb) Cantidad (ng)
1
2
3
4
5
6
1
4370
227
2
2899
150
3
2498
130
4
2201
114
5
1933
100
6
1331
69
7
1150
60
8
759
39
Construcción DNA recombinante
10
4) En el canal 5 de la Figura anterior, que corresponde a una muestra en la que se puso
un exceso de plásmido recombinante sin digerir, se vislumbran bandas minoritarias
con menor o mayor movilidad electroforética que la del plásmido recombinante. La
mayoría de estas bandas parece que han desaparecido en la muestra digerida
correspondiente (canal 3). a) ¿Qué tipo de DNA puede estar presente en una banda
minoritaria que migra más lentamente que el plásmido recombinante sin digerir?. b)
¿Y en una banda que migra más rápidamente?. c) Las preguntas anteriores tienen
varias contestaciones posibles, ¿cómo podría vd distinguir experimentalmente cada
una de estas posibilidades?. Razone con detalle sus respuestas.
5) a) ¿Por qué hemos tenido que usar EcoRI para hacer la digestión y no otra enzima
de restricción?. b) En el caso de que hubiésemos usado el pRSET como vector ¿con
qué enzima de restricción lo hubiésemos digerido?. Explique la respuesta. c)
Escriba la secuencia diana de EcoRI. ¿Qué tipo de extremos genera esta enzima?.
¿Qué ventajas tienen este tipo de extremos para la clonación de fragmentos de
DNA?.
6) En el laboratorio de prácticas hemos usado para la digestión 5 l de un stock 0,8
g/l de pBluescript-cDNA(eIF4E) (4,2 kb). De los 25 l de la mezcla de digestión,
se usaron 3 l para analizar los productos de la digestión y 22 l para la extracción
con fenol/cloroformo seguida de precipitación con etanol. El DNA precipitado se
resuspendió en 20 l de agua estéril. Suponga que durante todo el proceso anterior
hemos recuperado solamente el 30% del DNA presente en los 22 l iniciales.
Finalmente, en la reacción de ligación (volumen final, 10 l) hemos usado 1 o 2 l
de los 20 l de disolución acuosa de DNA. Otros datos: la masa molar de 1 pb es
660 g/mol.
a) Calcule los nanomoles del plásmido recombinante pBluescript-cDNA(eIF4E)
añadidos a la mezcla de digestión. b) ¿Cuántos nanomoles de pBluescript
linearizado y de cDNA(eIF4E) hemos obtenido después de la digestión con EcoRI?.
¿Y nanogramos de estos dos DNAs?. c) ¿Cuántos nanogramos de pBluescript
linearizado y de cDNA(eIF4E) estima vd que tenemos en los 20 l de disolución
acuosa de DNA teniendo en cuenta el % de recuperación indicado?. ¿Y nanomoles?.
d) ¿Qué cantidad (en nanogramos) de DNA total estima vd que tendremos en la
mezcla de DNA ligado?.
7) a) ¿Cuál es la proporción molar cDNA(eIF4E) / pBluescript que hemos usado en la
reacción de ligación realizada en esta práctica?. b) Por qué se recomienda que la
proporción molar inserto/vector sea al menos 3/1 para una reacción de ligación?. c)
¿Qué otras dos estrategias se le ocurren para resolver los problemas que acaba de
comentar?.
Transformación de bacterias
1
Práctica 2
CLONAJE DE GENES EN PLÁSMIDOS BACTERIANOS: Transformación de
células competentes de Escherichia coli y selección de transformantes.
Introducción
Para el clonaje y amplificación del plásmido recombinante preparado en la práctica
anterior es necesario introducirlo en una bacteria mediante un proceso que se denomina
“transformación”. La mayoría de las bacterias, como por ejemplo E. coli, son
impermeables a la entrada de ácidos nucleicos exógenos en condiciones normales de
crecimiento. Sin embargo, se han desarrollado métodos químicos y físicos que facilitan
este proceso al menos en E. coli.
Todos los métodos químicos de transformación que se utilizan actualmente derivan
de la observación de Mandel y Higa (1970, J. Mol. Biol. 53, 159-162) según la cual las
bacterias tratadas en frío con una disolución de CaCl2, y a continuación sometidas a un
choque térmico a 42ºC, se hacen “competentes” y permiten la entrada del DNA del fago
lambda. Este método se extrapoló posteriormente a DNA de plásmidos (Cohen et al.,
1972, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110-2114). Los métodos actualmente en uso son
variaciones del original, encaminadas a optimizar la eficiencia de transformación de
cada cepa bacteriana, que suele oscilar entre 106 a 109 transformantes por g de DNA
plasmídico. Una posible explicación sobre el mecanismo molecular por el que las
células se hacen “competentes” a la entrada de DNA exógeno lo puede ver en el
siguiente enlace: http://www.dnalc.org/resources/animations/transformation2.html
Por otra parte, de entre los métodos físicos de transformación de bacterias podemos
destacar la “electroporación”. Consiste en exponer las células de E. coli a una descarga
eléctrica, que induce la formación transitoria de poros en las membranas por donde
penetran las moléculas de DNA.
Los plásmidos que estamos usando en estas prácticas de clonaje (pBluescript o
pRSET-T7) tienen el gen de resistencia a ampicilina (bla). Este gen codifica una lactamasa que hidroliza el anillo -lactámico de la ampicilina, inactivándola. La
ampicilina es una aminopenicilina con actividad antimicrobiana de amplio espectro.
Inhibe la síntesis del péptidoglicano, constituyente de la pared bacteriana, en células en
fase activa de crecimiento. Las bacterias que contienen este tipo de plásmidos se pueden
seleccionar creciéndolas en presencia de ampicilina. Obviamente, las bacterias que no
han incorporado el plásmido no crecerán en este medio de cultivo.
Para diferenciar las bacterias que han incorporado el plásmido recombinante de las
que han incorporado el plásmido recircularizado sin inserto se pueden usar varios
métodos. Uno de los más conocidos es el de la complementación del fragmento  de la
-galactosidasa. Este método requiere que el vector usado (por ejemplo, el plásmido
pBluescript pero no así el plásmido pRSET-T7) contenga el sitio de policlonaje dentro
de la región codificante del fragmento y la bacteria hospedadora exprese el otro
fragmento de la -galactosidasa necesario para la complementación (lacZM15;
presente normalmente en el profago 80 o en F´). En los plásmidos recombinantes, la
incorporación del inserto inactiva el fragmento  de forma que las bacterias que
contienen estos plásmidos carecen de actividad -galactosidasa, originando colonias
blancas en un medio de cultivo que contiene el sustrato incoloro X-GAL. Las bacterias
Transformación de bacterias
2
transformadas con plásmidos sin inserto aparecen como colonias azules en este medio
pues son capaces de sintetizar -galactosidasa.
Objetivos
Preparación de bacterias “competentes” de E. coli, su transformación posterior
mediante un choque térmico con los plásmidos obtenidos en la Práctica 1, y selección
de los clones bacterianos conteniendo específicamente el plásmido recombinante
pBluescript-cDNA(eIF4E) de Drosophila melanogaster. Uno de estos clones se
utilizará en la Práctica 3.
Materiales
Equipo y Materiales generales: ver Práctica 1
Otros materiales necesarios para la Práctica 2:
 2%
(p/v)
X-GAL
(5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-galactósido)
en
dimetilformamida.
 20% (p/v; 0,8 M) IPTG (isopropil-tio--D-galactósido).
 Placas de Petri con medio LB (Luria-Bertani) sólido (10 g de triptona, 5 g de
extracto de levadura, 10 g de NaCl, 15g de bacto agar, y agua destilada hasta 1000
ml) SIN ampicilina. Estas placas las utiliza el Profesor para crecer la bacteria usada
en la transformación.
 Placas de Petri con medio LB (Luria-Bertani) sólido CON AMPICILINA (0,1
mg/ml). Para crecer bacterias transformadas.
 E. coli XL1-Blue (ver características en www.stratagene.com ) (1-2 placas de Petri
con colonias/mesa).
 Medio LB líquido (igual composición que el LB sólido pero sin agar y SIN
ampicilina): Tubos de dilución con 2 ml de medio y matraces de 100 ml con 25 ml
de medio. Para crecer la bacteria antes de la transformación.
 Tubos Falcon de 50 ml (1/pareja).
 0.1 M CaCl2 estéril (2 botellas/mesa). Mantener en frío (nevera; hielo).
 Mezcla de ligación realizada en la Práctica 1.
 Plásmido recombinante pBluescript-cDNA(eIF4E) sin digerir y diluido 1/80.
Procedimiento
A) Adición de IPTG y X-GAL a placas de Petri con medio LB + ampicilina
1. La tarde anterior al inicio de la práctica (día 1º) distribuir 3 placas de Petri
conteniendo medio LB + ampicilina por pareja mas 2 placas por mesa. Cada
pareja marcará en la base sus 3 placas con el número de pareja seguido de 1, 2, 3,
respectivamente. Las dos placas sobrantes se marcaran con el número de la mesa.
2. Para cada mesa preparar en un tubo eppendorf de 1,5 ml, el “premix” que se
indica en la última columna de la tabla siguiente:
Componente
l / placa
l / 15 placas (1 mesa)
X-GAL (2%)
40
600
IPTG (20%)
7
105
Volumen final
47
705
Transformación de bacterias
3
3. Poner 47 l del “premix” anterior en el centro de cada una de las placas de Petri
y extender uniformemente con ayuda de un asa de plástico estéril.
4. Dejar secar las placas boca arriba y tapadas hasta el día siguiente. Si no se usaran
este día se guardarán en la nevera.
B) Crecimiento de Escherichia coli.
1. La tarde anterior al inicio de la práctica (día 1º) cada pareja picará una colonia de
bacterias E. coli XL1-Blue de un placa de Petri conteniendo medio LB preparada
recientemente y la transferirá a un tubo de dilución con tapón conteniendo 2 ml
de medio LB (sin ampicilina). Sujetar el tapón del tubo con cinta aislante sin
bloquear la entrada de aire al tubo, marcar con el número de pareja e incubar en
baño a 37ºC con fuerte agitación durante toda la noche.
2. A la mañana siguiente (13:30-13:45 h), transferir 0,5-0,8 ml del cultivo crecido
en cada tubo a sendos matraces de 100 ml conteniendo 25 ml de medio LB fresco
precalentado a 37ºC. Incubar con fuerte agitación en baño a 37ºC.
3. A las 15:30-15:45 h, medir la A550 nm del cultivo. Parar el crecimiento cuando se
alcance un valor 0,28-0,32, poniendo el matraz con el cultivo en hielo.
Nota: En estas condiciones de crecimiento el número de bacterias duplica en unos
20 min.
C) Preparación de células competentes.
1. Transferir el cultivo enfriado a un tubo Falcon de 50 ml estéril y mantener en
hielo.
2. Equilibrar tubos de dos en dos con ayuda de una balanza/granatario.
3. Recuperar las bacterias por centrifugación a 5000 rpm durante 10 min. Tener
cuidado de poner enfrentados los tubos que se han equilibrado previamente en
parejas.
4. Decantar el sobrenadante rápidamente en la pila. Dejar el tubo invertido sobre el
papel de filtro durante 1 min con objeto de eliminar los restos de medio.
5. Resuspender las bacterias en 5 ml de 0,1 M CaCl2 frío usando la propipeta
P1000. Mezclar con suavidad con ayuda de la pipeta eliminando completamente
todos los agregados de células.
6. Después de unos 20 min en hielo, recuperar las bacterias por centrifugación a
5000 rpm durante 10 min, y decantar de nuevo el sobrenadante como antes.
7. Resuspender las bacterias en 0,5 ml de 0.1 M CaCl2 frío y mantener en hielo.
Notas:
a) Dado que la centrifuga que disponemos en el laboratorio sólo tiene capacidad
para 6 tubos Falcon de 50 ml, y el número de parejas por grupo es de 12, se
puede reducir el número de centrifugaciones a la mitad mezclando los cultivos
crecidos de dos parejas en un tubo Falcon. En este caso, las bacterias se
resuspenderían inicialmente en 10 ml de de 0,1 M CaCl2 frío y después en 1,0 ml.
Finalmente, cada pareja recuperaría 0,5 ml de esta última suspensión de
bacterias.
b) En el caso de que las bacterias competentes no se vayan a utilizar
inmediatamente para la transformación se pueden dividir en alícuotas, congelar
rápidamente y conservar a –70ºC siguiendo el protocolo siguiente: A 1 ml de
bacterias añadir 35 l de DMSO (dimetilsulfóxido) y mezclar suavemente,
manteniendo la suspensión en hielo durante 15 min. Añadir otros 35 l de
DMSO, mezclar y volver a poner en hielo. Enfriar tubos eppendorf en hielo
Transformación de bacterias
4
seco/etanol (o nitrógeno líquido) y poner alícuotas de 100-107 l de la
suspensión de bacterias con DMSO en cada tubo. Las alícuotas se mantienen
congeladas a -70ºC. Cuando se necesiten, descongelar el tubo con la mano y
mantener en hielo durante 10 min.
D) Transformación de las bacterias.
1. Preparar 3 tubos eppendorf de 1,5 ml por pareja en hielo. Marcarlos con el
número de pareja y los números 1, 2 y 3, respectivamente. Añadir a cada uno de
ellos los componentes que se indican en la tabla siguiente:
Componente
Células competentes
Mezcla ligación (práctica 1)
pBluescript-eIF4E sin digerir
(dilución 1/80)
H2O estéril
Tubo 1
100 l
2 l
----------
Tubo 2
100 l
-------2 l
----------
-----------
Tubo 3
100 l
----------------2 l
2. Mantener en hielo durante 30 min agitando suavemente la suspensión de vez en
cuando.
3. Transferir los tubos a un bloque térmico a 42ºC y mantener 2 min.
4. Detener el choque térmico transfiriendo los tubos a contenedores con hielo.
E) Crecimiento y selección de los transformantes.
1. Añadir a cada tubo 500 l de medio LB SIN ampicilina e incubar a 37ºC con
agitación intensa durante 1 hora. Si la incubación se hace sin agitación, conviene
agitar las células a intervalos de tiempo para resuspenderlas.
2. Plaquear alícuotas de 100 l de cada uno de los tubos en las placas de Petri
correspondientes (es decir, tubo 1 a placa 1, etc.) conteniendo medio LB sólido
CON ampicilina + IPTG + X-GAL preparadas el día anterior. Extender
uniformemente la suspensión de bacterias sobre la superficie de la placa con
ayuda de un asa de plástico estéril (usar un asa distinta para cada placa).
Mantener las placas boca arriba y tapadas hasta que sequen bien.
3. Una vez secas, invertir las placas, comprobar que están debidamente marcadas e
incubarlas en estufa a 37ºC durante unas 24-36 horas.
4. Recoger las placas de la estufa y analizar los resultados: número y color de las
colonias; uniformidad de las colonias en la placa; etc.
Resultados y Cuestiones
1) a) Busque las características de la cepa bacteriana usada en esta práctica e
interprételas brevemente en su cuaderno. b) ¿Cuál le parece más imprescindible
para la selección de clones recombinantes que hemos realizado en este
experimento?.
2) ¿Para qué se crecen las bacterias en medio LB líquido sin ampicilina durante una
hora antes de pasarlas al medio sólido que contiene ampicilina (+IPTG + X-GAL)?.
3) a) ¿Por qué se crecen las bacterias durante toda la noche en un medio sólido con
ampicilina?. b) ¿Qué resultado esperaría vd encontrar si nos hubiésemos olvidado
de añadir ampicilina al medio de cultivo?.
Transformación de bacterias
5
4) a) ¿Para qué usamos IPTG y X-GAL en el medio de cultivo?. b) ¿Qué tipo de
colonias (blancas o azules) aparecen mas frecuentemente en su placa 1?. ¿Por qué?.
c) ¿De qué color son las colonias que aparecen en la placa 2?. ¿Por qué?. d) ¿Para
qué nos sirve el análisis de la placa de Petri número 3 procedente del tubo 3?.
Interprete los resultados que vd ha obtenido en dicha placa.
5) El método de selección de bacterias conteniendo plásmidos recombinantes basado
en la complementación del fragmento  falla en ocasiones, observándose resultados
contrarios a lo esperado: colonias azules de bacterias transformadas con el plásmido
recombinante y colonias blancas de bacterias transformadas con el plásmido sin
inserto. ¿A qué se pueden deber estos resultados?.
6) Determine la eficiencia de transformación (número de colonias/g de DNA)
utilizando la placa de Petri número 2 procedente de la transformación con el
plásmido recombinante pBluescript-cDNA(eIF4E) no digerido y diluido 1/80 (tubo
2) suponiendo que en esta placa ha obtenido 100 colonias.
7) ¿Podríamos hacer una estimación de la cantidad de DNA (plásmido recombinante +
plásmido sin inserto) presente en la mezcla de ligación de la Práctica 1 usada en la
transformación del tubo 1 observando los resultados de la placa 1?. Explique su
respuesta y haga los cálculos en su cuaderno de prácticas suponiendo que en esta
placa ha obtenido 70 colonias.
Práctica 3
CLONAJE DE GENES EN PLÁSMIDOS BACTERIANOS: Aislamiento de DNA
plasmídico y análisis del mismo por digestión con enzimas de restricción.
Introducción
La aparición de colonias blancas en placas con ampicilina, si bien es un buen indicio, no
garantiza que contengan el vector recombinante, ya que puede tratarse de falsos positivos, como
sería el caso de dímeros de vectores religados o la presencia de mutaciones en la -galactosidasa.
Por esa razón es imprescindible, después de la selección, hacer un análisis de los clones para
comprobar la presencia del inserto digiriendo el DNA plasmídico con enzimas de restricción y
analizando los fragmentos resultantes por electroforesis en gel de agarosa. Una vez comprobada la
presencia del inserto, en algunas ocasiones hay que secuenciarlo para asegurarse que no contiene
mutaciones. Los vectores de clonaje tienen secuencias flanqueantes al sitio de policlonaje
complementarias a primers denominados universales, pues sirven para cualquier inserto.
Objetivos
Los clones recombinantes seleccionados en presencia de ampicilina y de color blanco debido
a la inactivación de la -galactosidasa, se crecerán en medio LB en presencia de ampicilina y se
aislará el DNA plasmídico para su posterior análisis. El análisis estructural de los plásmidos
recombinantes tiene un doble objetivo: 1) la identificación y confirmación de la presencia del
inserto en los clones que contengan el vector y 2) la determinación de la orientación del mismo.
Todo ello se llevará a cabo mediante análisis de restricción del DNA plasmídico e identificación
de los fragmentos resultantes por electroforesis en agarosa.
Materiales
Además del material general descrito en la Práctica 1, en esta práctica utilizaremos:
- Erlenmeyer con 5 ml de medio LB conteniendo 100 µg/ml de ampicilina.
- Kit Wizard® Plus SV Minipreps (Promega).
- Enzimas de restricción Eco RI, Bam HI y Kpn I, y sus correspondientes tampones.
- Para la electroforesis necesitamos:
Agarosa
Tampón TAE: 40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA.
GelRed
DNA Molecular Weight Marker XVI, 250bp ladder
Solución de carga de electroforesis conteniendo azul de bromofenol y xylene cyanol
FF.
Procedimiento
A) Crecimiento de clones bacterianos. (dia 2)
Coger una colonia blanca seleccionada de placas con ampicilina, IPTG y X-gal con un asa de
cultivo e inocular un erlenmeyer con 5 ml de LB conteniendo 100 µg/ml de ampicilina. Crecer a
37°C con agitación durante la noche.
B) Aislamiento del DNA plasmídico (Miniprep). (dia 3)
Al día siguiente se aislará el DNA plasmídico a pequeña escala por el método de la lisis alcalina
utilizando el Kit comercial Wizard® Plus SV Minipreps (Promega). Información suministrada por
el fabricante en: www.promega.com/tbs/tb225/tb225.pdf
Para ello se seguirá el siguiente protocolo:
- Poner 1.5 ml del cultivo crecido durante la noche en un tubo eppendorf. Recoger las células por
centrifugación a máxima velocidad en minifuga 3 min. Tirar el sobrenadante, escurrir el tubo boca
abajo sobre papel de filtro.
- Resuspender en Vortex o con micropipeta el sedimento celular en 250 l de solución R (50 mM
Tris-HCl pH 7.5, 10 mM EDTA, 100 g/ml RNasa A). QUE NO QUEDEN GRUMOS.
- Lisar las células con 250 l de solución L (0.2 M NaOH, 1% SDS), mezclar suavemente por
inversión. Observar el aumento de viscosidad. NO DEJARLO MÁS DE 5 min, pues el DNA
desnaturalizado es mucho más frágil que el nativo.
- Degradar las proteínas del lisado con 10 l de solución P (proteasa alcalina), mezclar por
inversión. NO DEJARLO MÁS DE 5 min.
- Neutralizar con 350 l de solución N (4.09 M hidrocloruro de guanidina, 0.759 M acetato
potásico, 2.12 M acido acético), mezclar por inversión. Aparecerá un abundante precipitado
blanco correspondiente al DNA bacteriano, que queremos eliminar.
- Centrifugar 10 min.
- En este paso hay que tener especial cuidado, pues es el más crítico. Transferir cuidadosamente
por decantación o con micropipeta el sobrenadante claro conteniendo el DNA plasmídico al filtro
suministrado en el Kit, adaptado a un tubo colector. Debemos coger CUANTO MAS
SOBRENADANTE MEJOR PERO EVITANDO QUE NO CAIGA EL PRECIPITADO
BLANCO. En caso de que esto ocurra, devolverlo al tubo y centrifugar otra vez. Repetir el
proceso.
- Centrifugar 1 min el material del filtro adaptado al tubo colector. Previamente dar dos o tres
pulsos (centrifugación muy corta). El filtro no se tapa, pues la fuerza centrífuga impide que se
salga el líquido. En estas condiciones el DNA plasmídico queda retenido en el filtro.
- Vaciar el tubo colector, lavar el filtro con 750 l de solución W (8.3 mM Tris-HCl, 0.04 mM
EDTA, 60 mM acetato potásico, 60% etanol), centrifugar 1 min.
- Repetir el proceso lavando con 250 l de solución W, centrifugar 2 min.
- Poner el filtro, asegurándose de que no tiene solución W, en un eppendorf nuevo al que
previamente habremos cortado la tapa. La tapa la guardaremos para después de las
centrifugaciones.
.
- Extraer el plásmido del filtro con 60 l de agua sin nucleasas (H). Dejar unos instantes y dar dos
o tres pulsos antes de centrifugar 1 min.
C) Análisis de restricción del plásmido:
El análisis se realizará mediante digestión con tres enzimas de restricción: Bam HI, Eco RI y Kpn I.
El DNA plasmídico se distribuirá en tres tubos marcados E, B y K para digerirlos con Eco RI,
Bam HI y Kpn I, respectivamente, según el siguiente protocolo en el que cada enzima se incuba
con su propio tampón recomendado por el fabricante para optimizar la digestión:
tubo DNA
Tx10
enzima
plasmídico
E
17 µl
2 µl TE
1 µl E
B
17 µl
2 µl TB
1 µl B
K
17 µl
2 µl TK 1 µl K
Los tubos, con un volumen total de 20 µl, se incubarán a 37ºC al menos durante 1 h.
D) Separación de fragmentos de restricción por electroforesis en geles de agarosa (día 4)
Los fragmentos obtenidos en las digestiones enzimáticas se analizarán por electroforesis
análogamente a como se describió en la práctica 1 Procedimiento B).
- Preparar un gel de agarosa de 70 ml al 0.7% (0.49 gr) en TAE 1X, utilizando el peine de 15
pocillos. Añadir a la agarosa fundida 2 l de GelRed.
- Añadir 4 µl de solución de carga a las muestras correspondientes a las digestiones enzimáticas, y
cargar todas las muestras en el gel de electroforesis. Cargar en un extremo, 18 µl de marcadores de
tamaño (Molecular Weight Marker XVI, 250bp ladder).
- Correr el gel a 100V, hasta que el azul de bromofenol esté a 1/3 del final del gel, visualizarlo al
ultravioleta.
E) Análisis y discusión de los resultados.
- Calcular, a partir de la posición de las bandas en el gel, el tamaño de los fragmentos obtenidos
tras la digestión con las distintas enzimas de restricción.
- Determinar la orientación del inserto.
Cuestiones
1) Deducir el número y tamaño de los fragmentos obtenidos tras la digestión con Eco RI, Bam HI
y Kpn I (ver Apéndice, considerar despreciable el tamaño del sitio de policlonaje).
2) ¿Con qué otros enzimas podríamos determinar la orientación del inserto? (ver Apéndice)
3) Buscar en el Apéndice la secuencia codificante del eIF-4E (primer ATG). Teniendo en cuenta
la fase de lectura y el código genético, determinar:
a) el nº de aminoácidos de la proteína.
b) la secuencia de los 5 aminoácidos N-terminales.
c) la secuencia de los 5 aminoácidos C-terminales.
4) Con los datos obtenidos en la cuestión 3, diseña un primer de 10 nucleótidos para obtener por
mutagénesis dirigida el cambio Arg7-Ser.
5) Determinar si en el recombinante con la orientación correcta el gen de la proteína eIF-4E está
en fase con el de la -galactosidasa (ver Apéndice).
En caso negativo a) ¿Cuántos aminoácidos tendría la proteína de fusión resultante?, b) ¿Cómo
se podrían poner en fase el gen de la -galactosidasa y el cDNA del F-4E ?.
6) Teóricamente el inserto se podría colocar en cualquier orientación, sin embargo en el análisis de
los recombinantes mayoritariamente se obtiene una. ¿Podrías proponer una hipótesis para
explicar este resultado?.
7) Diseña los primers para insertar de forma unidireccional (empleando dos enzimas distintas) el
cDNA de eIF-4E en el plásmido pBluescript IIKS, y detalla el procedimiento a seguir en el
clonaje. ¿Qué condiciones deben cumplir las enzimas seleccionados?.
PRÁCTICA 4
DETECCIÓN DE AGENTES INFECCIOSOS POR PCR (REACCIÓN EN CADENA DE
LA POLIMERASA)
Introducción
Pocos avances en genética molecular han tenido tantos campos de aplicación como la
PCR (reacción en cadena de la polimerasa, vulgarmente conocida como prueba del ADN), de
ahí que, aunque existían precedentes, a quien la desarrolló en su forma actual, Kary Mullis, se
le concediera el Premio Nobel en 1993. La idea es muy simple, la hibridación de unos primers
flanqueantes a la secuencia a amplificar y su posterior elongación, permite la duplicación de
su secuencia. Si la elongación se efectúa con una DNA polimerasa termoestable, la
desnaturalización de los productos elongados y la repetición cíclica del proceso permite una
enorme amplificación de la secuencia inicial, 1012 veces después de 40 ciclos. A pesar de su
simplicidad hay ciertos parámetros que hay que tener muy en cuenta para una correcta
amplificación. En primer lugar es esencial la elección de los primers, que han de hibridar con
una secuencia única, lo que se logra con un tamaño suficientemente largo (20-25 nts), no han
de presentar complementariedad inter o intra-molecular, Tms similares, y a ser posible con
pares GC en sus extremos para una mayor estabilidad. Los mejores resultados se obtienen con
primers distantes entre si, de 100 a 500 nucleótidos. En algunas ocasiones no existe una total
complementariedad, como es el caso de la mutagénesis dirigida, donde el nucleótido
cambiado, la deleción o inserción presente en el primer, debe colocarse en el centro de la
secuencia, nuevamente para mayor estabilidad. Otro parámetro crucial es la temperatura de
hibridación de los primers, unos 5-10°C por debajo de su temperatura de fusión (Tm). Una
temperatura demasiado alta daría lugar a una pobre amplificación, por el contrario una
temperatura demasiado baja podría dar lugar a hibridaciones inespecíficas con secuencias
similares, obteniéndose múltiples productos. . Otro paso importante a tener en cuenta es el
tiempo de extensión empleado, dado que la mayoría de las DNA polimerasas elongan en un
minuto alrededor de 1 Kb de DNA, si se amplificasen fragmentos de mayor tamaño debe
aumentarse dicho tiempo.
Igualmente se puede amplificar una secuencia de RNA utilizando previamente la
transcriptasa inversa para copiarla a DNA, esta técnica, RT-PCR (reverse transcripcion PCR) de
amplia utilización, permite detectar cantidades minúsculas de RNA. La PCR no solo sirve para
amplificar una secuencia, la PCR cuantitativa permite determinar la concentración inicial de un
DNA (qPCR) ó un RNA (qRT-PCR) en una muestra. Utilizando agentes intercalantes
fluorescentes podemos monitorizar la amplificación en tiempo real y, con DNAs de concentración
conocida utilizados como estándar determinar la concentración inicial de nuestra muestra. Los
campos de aplicación de la PCR son enormes, éstos son solo algunos ejemplos: en investigación
es una herramienta imprescindible de uso cotidiano, la mutagénesis dirigida mencionada antes, la
detección de agentes infecciosos, objetivo de esta práctica, diagnosis de enfermedades o riesgo
potencial de padecerlas, pruebas de paternidad y aplicaciones forenses, tanto de identificación de
restos biológicos como de pruebas criminalísticas.
Objetivos
El objetivo de esta práctica es el aprendizaje de la técnica de la PCR y su aplicación en la
detección de agentes infecciosos. En este caso el agente infeccioso es un peligroso virus que
contamina unas muestras de agua (en realidad esto es una simulación, pues el virus utilizado es el
bacteriófago Ø29 que infecta a Bacilus subtillis y por tanto totalmente inocuo). Se suministrarán
dos muestras, una infectada con el virus y otra no, marcadas una de color rojo y otra azul, y
mediante esta técnica se determinará cuál de las muestras está infectada, si la roja o la azul. En
esta práctica se explicarán las bases teóricas de la técnica y se indicarán los parámetros a tener en
cuenta para el diseño de los primers de la reacción.
La reacción en cadena de la polimerasa es la técnica estándar para la amplificación de un
fragmento de DNA incluido en un DNA molde, utilizando oligonucleótidos de secuencia única
(primers) complementaria a ambos lados del fragmento que se desea amplificar. Esta
amplificación se lleva a cabo mediante una serie de ciclos, generalmente 30, cada uno de los
cuales consta de tres etapas: 1) Desnaturalización del DNA; 2) Hibridación de los primers y 3)
Extensión mediante el uso de la enzima Taq polimerasa (u otra DNA polimerasa de características
similares). El desarrollo de la PCR está basado precisamente en el descubrimiento de esta
polimerasa, que, a diferencia de las previamente conocidas, es termoestable y actúa a altas
temperaturas.
Materiales
-
DNA de virus
4 dNTP
Taq polimerasa
Tampón de reacción de PCR (Tris-HCl 100 mM, pH 8.3, KCl 500 mM)
MgCl2
Primers
Termociclador
El material necesario para la electroforesis se describe en la práctica 3.
Procedimiento
A) Preparación de las mezclas de reacción (día 3)
- Preparar las mezclas de reacción para las muestras control y problema, a partir del protocolo
indicado, teniendo en cuenta las concentraciones inicial y final de cada uno de los reactivos
utilizados. Los controles son dos: uno positivo con DNA viral, para comprobar que todo se ha
realizado correctamente y uno negativo sin él, para comprobar que no ha habido ninguna
contaminación en los reactivos empleados. Si los controles son correctos se determinará si nuestra
muestra problema está contaminada o no.
-Componentes:
Muestra problema, DNA molde del virus infeccioso (control positivo) o H20 (control negativo),
dNTPs: dATP, dTTP, dGTP, dTTP,
Taq polimerasa,
MgCl2,
Tampón de reacción (10X): Tris-HCl 100 mM, pH 8.3, KCl 500 mM ,
Primers: GCCCACATACTTTGTTGATTGG
AAAGTAAGCCCCCACCCTCACATG
Para ello se seguirá el siguiente protocolo:
Mezcla de reacción
Concentración Stock
Concentración final
Tampón de la reacción 10X
1X
MgCl2 25 mM
2.5 mM
dNTPs 2.5 mM (cada uno)
250 µM (cada uno)
Primers 5 µM (cada uno)
0.5 µM (cada uno)
Taq polimerasa 5U/µl
1U
Se preparará una única mezcla de reacción para toda la mesa (10 tubos). Calcular el volumen que
hay que añadir de cada uno de los componentes para un volumen final de 200 µl completando con
H20 hasta 180 µl.
Cada pareja deberá poner 18 l de mezcla de reacción en 2 tubos Eppendorf de 0.2 ml numerados
(pequeños de 200 µl, pues de lo contrario no caben en el termociclador), añadiendo 2 l de
muestra problema (tubo rojo o azul) a uno y 2l (20 ng) de DNA molde (10 ng/l) como control
positivo a otro. Adicionalmente una pareja de cada mesa añadirá 2 l de H20 como control
negativo.
CERRAR BIEN LOS TUBOS y ponerlos en el termociclador
B) Programación del termociclador y realización de la PCR
Programar el termociclador, de acuerdo a las siguientes condiciones:
- 4 min de desnaturalización previa a 94°C
- 30 ciclos de amplificación, cada uno consistente en:
 60 sec-desnaturalización a 94°C
 60 sec-reanillamiento a 59°C
 60 sec-extensión a 72°C
- 10 min de extensión a 72°C
En la práctica el termociclador está ya previamente programado.
-Una vez finalizados los ciclos las muestras se mantienen a 4ºC hasta su posterior análisis.
Los tiempos de desnaturalización, reanillamiento y extensión varían según el termociclador y las
muestras utilizadas .
La Tm se calcula por la fórmula Tm=(G+C)x4+(A+T)x2, aunque no es muy exacto, la
simplicidad de la fórmula es útil para tener un valor aproximado.
C) Análisis de los productos de PCR mediante electroforesis en geles de agarosa. (día 4)
Análogo a lo descrito en la práctica 3, Procedimiento D) y práctica 1, Procedimiento B).
- Preparar un gel de 70 ml de agarosa al 1% (0.7 gr) en TAE 1X, utilizando el peine de 15
pocillos. Añadir a la agarosa fundida 2 l de GelRed.
- Añadir 4 µl de solución de carga a cada uno de los tubos y cargar la totalidad de las muestras en
los pocillos del gel de electroforesis. En un extremo cargar 18 µl de marcadores de tamaño (DNA
Molecular Weight Marker XVI, 250bp ladder).
- Correr el gel a 100V, hasta que el Azul de Bromofenol esté a la mitad del gel. Una vez concluida
la misma, visualizar el gel al ultravioleta.
D) Análisis de los resultados
-Comprobar que la mezcla de reacción no está contaminada (control negativo).
-Comprobar que el DNA viral se ha amplificado correctamente (control positivo).
- Determinar cuál de las muestras, la roja o la azul, está contaminada
Cuestiones
1) Calcular la Tm de los primers utilizados (ver la fórmula en el guión de prácticas).
2) Calcular el tamaño del DNA amplificado por PCR a partir de la secuencia del extremo del DNA
de Ø29 (ver Apéndice) y las secuencias de los primers utilizados (ver guión de prácticas).
3) Diseñar los primers (20 nucleótidos) para amplificar 400 pb del extremo izquierdo del DNA del
virus (ver Apéndice).
4) Razonar cuál sería el resultado en una electroforesis de PCRs realizadas en las siguientes
condiciones: a) se te olvida añadir uno de los primers a la mezcla de reacción, b) uno de los
primers hibrida en varios sitios del DNA molde, c) hay un solo corte en banda simple en el DNA
molde entre los primers, d) hay un solo corte en banda doble en el DNA molde entre los primers,
e) si se desea amplificar solo una zona incluida en un DNA de mayor longitud. ¿ A partir de qué
ciclo se obtienen fragmentos de DNA de doble banda del tamaño requerido?
5) En algunos casos, sobre todo cuando la PCR ha fallado, se observa una banda difusa de mayor
movilidad. ¿A qué puede corresponder esta banda?
6) La figura muestra los resultados obtenidos en
cuatro PCRs realizadas a las temperaturas de
reanillamiento indicadas. Las electroforesis se
corrieron durante tiempos distintos, así la muestra
de 60ºC se corrió más que la de 55ºC y ésta más
que la de 52ºC. Cargándose distintas cantidades
de DNA de los mismos marcadores (M)
(60ºC>58ºC y 55ºC>52ºC). Interpreta estos
resultados.
Razona
la
temperatura
de
reanillamiento que utilizarías.
APENDICE
cDNA de eIF-4E (nº acceso U16139)
AATTCGCTCTCTCGCACACACACGCACCAACCAACTATCAACTATCACAAACA
CCGCGACAGAGAGAGAGCGGCAAGTGAATCACGGCGAATCGAAACCGATC
CGAACCCACTCCGGAGCCGAAAAAGAACTGATCCTACCATCAAACGCATCC
AATAAACACGGCCGCCAACATGCAGAGCGACTTTCACAGAATGAAGAACTT
TGCCAATCCCAAGTCCATGTTCAAAACCAGCGCCCCCAGCACCGAGCAGGG
TCGTCCGGAACCACCAACTTCGGCTGCAGCGCCCGCCGAGGCTAAGGATGT
CAAGCCCAAGGAGGACCCACAGGAGACTGGTGAACCAGCAGGCAACACTG
CAACCACTACTGCTCCTGCCGGCGACGATGCTGTGCGCACCGAGCATTTATA
CAAACACCCGCTCATGAATGTCTGGACGCTGTGGTACCTTGAAAACGATCG
GTCCAAGTCCTGGGAGGACATGCAAAACGAGATCACCAGCTTCGATACCGT
CGAGGACTTCTGGAGCCTATACAACCACATCAAGCCCCCATCAGAGATCAA
GCTGGGTAGTGACTACTCGCTATTCAAGAAGAACATTCGTCCCATGTGGGA
GGATGCAGCCAACAAACAGGGCGGTCGTTGGGTCATTACCCTTAACAAAAG
CTCCAAGACCGATCTGGATAACCTATGGCTCGATGTGCTGCTCTGCCTGATT
GGCGAGGCCTTCGATCACTCCGATCAGATCTGCGGCGCTGTTATAAACATTC
GCGGCAAGAGCAACAAGATATCCATCTGGACTGCCGACGGAAACAACGAG
GAAGCTGCCCTTGAGATTGGTCACAAGCTGCGCGATGCCTTGCGTCTGGGA
CGCAACAACTCGCTGCAGTATCAGTTGCACAAGGACACGATGGTCAAGCAG
GGCTCCAACGTGAAATCGATCTACACTTTGTAGGCGGCTAATAACTGGCCG
CTCCTTACTCGGTCCGATCCCACACAGATTAGTTTGTCTTTCATTTATTTATC
GTTATAAGCAACAGTAGCGATTAATCGTGACTATTGTCTAAGACCCGCGTA
ACGAAACCGAAACGGAACCCCCTTTGTTATCAAAAATCGGCATAATATAAA
ATCTATCCGCTTTTTGTAGTCACTGTCAATAATGGATTAGACGGAAAAGTAT
ATTAATAAAAACCTACATTAAAACCGG
NOTA: las dos primeras As no aparecen en la secuencia del banco de datos,
pero están en el fragmento al estar originado por digestión con EcoRI
Sitios únicos de restricción, enzima, posición de la diana y tamaño de los
fragmentos generados.
Enzyme Site
<-- Pos. -->
Eag I c/ggccg
HgiE II accnnnnnnggt
Sty I c/cwwgg
EcoO109 I rg/gnccy
PpuM I rg/gwccy
BsmA I gtctc 1/5
Cfr10 I r/ccggy
Nae I gcc/ggc
Fsp I tgc/gca
BspH I t/catga
Asp718 g/gtacc
Ban I g/gyrcc
Kpn I ggtac/c
Rsa I gt/ac
Pvu I cgat/cg
PflM I ccannnn/ntgg
BstN I cc/wgg
EcoR II /ccwgg
ScrF I cc/ngg
Gsu I ctggag 16/14
Xcm I ccannnnn/nnnntgg
Bgl I gccnnnn/nggc
Hae I wgg/ccw
Stu I agg/cct
Bgl II a/gatct
BstY I r/gatcy
EcoR V gat/atc
Drd I gacnnnn/nngtc
Ban II grgcy/c
Bsp1286 I gdgch/c
Mme I tccrac 20/18
Mae II a/cgt
Cla I at/cgat
Rsr II cg/gwccg
160
243
310
316
316
327
372
372
388
418
439
439
439
440
452
460
466
466
466
518
664
706
718
718
739
739
782
900
917
917
921
925
932
978
161
244
311
317
317
328
373
373
389
419
440
440
440
441
453
461
467
467
467
519
665
707
719
719
740
740
783
901
918
918
922
926
933
979
1043
960
893
887
887
876
831
831
815
785
764
764
764
763
751
743
737
737
737
685
539
497
485
485
464
464
421
303
286
286
282
278
271
225
claves
r=A o G
w= A o T
n= A, T, G o C
y= C o T
TTT
TTC
TTA
TTG
phe
phe
leu
leu
F
F
L
L
TCT
TCC
TCA
TCG
ser
ser
ser
ser
S
S
S
S
TAT
TAC
TAA
TAG
tyr Y
tyr Y
STOP
STOP
TGT
TGC
TGA
TGG
cys C
cys C
STOP
trp W
CTT
CTC
CTA
CTG
leu
leu
leu
leu
L
L
L
L
CCT
CCC
CCA
CCG
pro
pro
pro
pro
P
P
P
P
CAT
CAC
CAA
CAG
his
his
gln
gln
H
H
Q
Q
CGT
CGC
CGA
CGG
arg
arg
arg
arg
R
R
R
R
ATT
ATC
ATA
ATG
ile
ile
ile
met
I
I
I
M
ACT
ACC
ACA
ACG
thr
thr
thr
thr
T
T
T
T
AAT
AAC
AAA
AAG
asn
asn
lys
lys
N
N
K
K
AGT
AGC
AGA
AGG
ser
ser
arg
arg
S
S
R
R
GTT
GTC
GTA
GTG
val
val
val
val
V
V
V
V
GCT
GCC
GCA
GCG
ala
ala
ala
ala
A
A
A
A
GAT
GAC
GAA
GAG
asp
asp
glu
glu
D
D
E
E
GGT
GGC
GGA
GGG
gly
gly
gly
gly
G
G
G
G
Secuencia del extremo izquierdo del DNA del fago Ø29
(nº acceso V01121)
1
61
121
181
241
301
361
421
AAAGTAAGCC
CTCGGCATAC
TAGATAGGTT
TCTGTGTCGC
ATCAACAAAG
TGGAAGTACC
TAATAGTTAA
TC
CCCACCCTCA
CATGATCAGG
TGTCAATGAA
ATGTAAAAGG
TATGTGGGCT
GTACCATTGA
TTCTCCCATT
CATGATACCA
GAGGGAAACT
CAACATAAAA
TTATCAAAGT
GAACTCAATC
TACTACCATT
CTAAAACGAT
TTCTCCTAAT
ACTACTTAAT
CGACACAGAA
AGCGTGCACT
AGGGTTTAAT
ATAGCATACT
TTGATCGTTT
ATCGACATAA
ATATCAATCT
TCCCACGTTT
TTTGCCATGA
CCCCAACATA
CTGTAATAGT
ATTTCTACAA
Marcadores de tamaño (Roche DNA Molecular Weight Marker XVI, 250bp
ladder)
TCCGTCGATC
ATAGACCTAC
TAGCGCTTCG
TTGACAACCA
CACATGACAA
TGTCAAACAT
TTAGATGGAC