Download rayado

ESCUELA SUPERIOR POLITECNICA
DEL LITORAL
Facultad de Ingeniería Mecánica y Ciencias de
la Producción
Tesis de Grado
Previo a la obtención del título de
INGENIERO AGROPECUARIO
Presentado por:
Omar Oswaldo Olvera Vaca
Director: Rodolfo Maribona H.
Guayaquil - Ecuador
2003
“INFLUENCIA DE FACTORES
ABIÓTICOS SOBRE LA
EXPRESIÓN DEL VIRUS DEL
RAYADO DEL BANANO (BSV) EN
PLANTAS DE BANANO”
ANTECEDENTES
• En 1998, la superficie afectada por el “Fenómeno del
Niño” fue de 24.803 ha que afectó a la economía
agrícola ecuatoriana.
• El estrés ocasionado por la saturación hídrica de los
suelos y los cambios de temperatura provocaron el
incremento de síntomas del BSV.
• Oficialmente la intensidad de esta epifítia no ha sido
monitoreada.
• En la actualidad, la presencia del BSV ha comenzado
extendiéndose a lugares tales como: Patricia Pilar,
Quevedo, Empalme, Valencia, La Maná, Vinces, Milagro,
El Triunfo y Bucay.
ANTECEDENTES
- EL BSV frecuentemente se confunde en las primeras
etapas con la infección del Virus del Mosaico del Pepino
(CMV), deficiencia de P. y variación somaclonal.
-El efecto del cultivo de tejidos de meristema no logra un
saneamiento del BSV debido a que se integra al genoma
de la célula de la planta (AAB).
HIPÓTESIS
EXISTE INFLUENCIA DE FACTORES
ABIÓTICOS QUE CAUSAN LA
EXPRESIÓN DEL BSV.
OBJETIVO GENERAL
- Establecer los síntomas típicos ocasionados por el Virus del
Rayado del Banano (BSV) y su efecto sobre el vigor en plantas
de banano en distintas etapas de desarrollo sometidas a estrés
abiótico.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Establecer el diagnóstico diferencial visual en plantas adultas
de banano.
- Estudiar los efecto del estrés térmico, hídrico y la influencia
hormonal en la expresión de los síntomas del BSV y vigor en
plantas juveniles cultivadas in vitro.
- Detectar precozmente los síntomas del BSV en plantas
procedentes de cultivo de tejido.
- Confirmar la sintomatología mediante la comprobación de la
presencia del BSV en las hojas de Banano por Microscopía
electrónica.
DESCRIPCIÓN DEL VIRUS DEL RAYADO DEL
BANANO (BSV)
Reichel, H., Belalcazar, S.
Bell Lockhart ESPOL 2000
INFECCION VIRAL DEL BSV EN UNA
CELULA VEGETAL
SINTOMAS POR DIFICIENCIAS DE FOSFORO
Y ZINC
Fig. a) Deficiencia de fósforo
Fig. b) Deficiencia de Zinc
INPOFOS 1995
INPOFOS 1995
SINTOMAS POR TOXICIDAD Y CMV
Fig. c) Toxicidad por herbicida
INPOFOS 1995
Fig. d) sintomas del Virus del Mosaico del
Pepino (CMV)
(Dr H.J. Su, National Taiwan University, Taipei)
MATERIALES
Etapa1. Identificación de los síntomas y
Purificación del BSV.
• Muestras foliares del clon Valery
• Tubos de ensayo, pipetas, papel filtro,
licuadora, balanza, peachimetro(Modelo 15)
• Centrifuga (Hitachi SCR 208,Rotor RPR9-260,RPM
=8500).
• Ultracentrifuga (Hitachi SSP-72,Rotor,RP65T627,RPM=65000)
• Triton x-100,Mercaptoetanol,Tris, Polivinilpirrolidona
Etapa 2.Propagación in vitro
•
•
•
•
•
30 hijuelos (Valery)
Herramientas de limpieza
Equipos de laboratorio
Medio normal de Murashige y Skoog
Reactivos: polietilen glicol(PEG),6bencilaminopurina(BAP) y temperatura
• Equipo de computación
• Literatura consultada
MÉTODO
Etapa 1
• Identificación de los síntomas de BSV en plantas
adultas de banano, en la Agrícola Martinica provincia
de Los Ríos.
• El diagnóstico visual fue confirmado por
inmunoensayo (Lockhart B.) y se comprobó por
microscopía electrónica la presencia de la partícula
viral.
• Se utilizó el protocolo del Dr. Lockhart 1986, se realizó
ciertas modificaciones (Instituto Higiene Izquieta Pérez
Guayaquil).
MÉTODO
Etapa 2
• Se recolectó hijuelos de plantas madres enfermas y
sanas que estaban diagnosticadas.
• Estos hijuelos fueron micropropagados en el
laboratorio de SEBIOCA-ESPOL.
• Las plántulas asintomáticas, obtenidas por
micropropagación, cultivadas in vitro en condiciones
de estrés por frío, estrés hídrico y hormonal.
Etapa 1: Recolección del material en el
campo.
•Identificación de las plantas adultas de banano del
clon Valery con los síntomas foliares causados por
el BSV.
Plantas adultas de banano
Rayado amarillo en hojas inferiores
OBTENCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL
VIRUS PARA EL DIAGNÓSTICO.
Tomar
hojas
inferiores
con síntoma
de BSV
Incubar a 4º C
1 (*)
2
Homogeniz
ar
1minuto/3
veces
4
Agitar por 1
minuto
7
Ultracentrifu
gar
concentrado
1h/136.000
g
10
Filtrar con
gaza doble
5
Centrifugar
10' /10.000g
8
Conservar
precipitado a
(-20º C)
11
Extraer 125g / tejido
4 volúmenes de Tampón de
extracción
3
Mezclar extracto con 1/3 v
/cloroformo (-4º C)
6
Dializar y concentrar con
Polietilen glicol/
hasta 100ml (-4º C)
9 (*)
Observar por Microscopíaelectrónica de transmisión.
12
Etapa 2. Propagación in vitro de plantas
sanas e infectadas
Explantación
Introducción
Propagación
Plántulas en invernadero
ESQUEMA DEL PRECESO DE LOS
TRATAMIENTOS IN VITRO
1) Plantas adultas diagnosticada
por Inmunoensayo (ELISA) y
confirmada
por
Microscopia
electrónica.
2) Se cogió los hijuelos sano y
enfermo de la unidad de
producción
3) Se sembraron los hijuelos en
funda y se dejo por un mes. No
se observaron síntomas locales.
4) Introducción in vitro, cortes del
cormo
5) Propagación de los meristemos
tanto sano y enfermo hasta el
subcultivo P5
6) Los tratamientos en los medios
de cultivo: Polietilen glicol al 3 %,
6%, 9%, testigo, BAP 5 veces >,
BAP 5 veces < y sin BAP
7) 20 plantas sanas y enferma
en cada tratamiento y sometida a
18°C, 26°C 18°C - 34°C por un
mes, total 840 plántulas
8) Después del período de
ESTRES se puso en un medio de
enraizamiento común a todos y a
una sola temperatura 26 C.
9) Se observaron un rayado
amarillo, café oscuro en la hoja de
las plántulas (20%) que tuvo un
frasco, con PEG al 3% a 18ºC y el
testigo no presentó síntomas.
10)
Los tratamientos de las
plántulas de 18ºC, 26ºC se
transplantan a bandeja, con el
mismo substrato para todos en la
etapa de invernadero (Fase I)
11) Se observaron un rayado
amarillo (50%), en hojas de
plantas
provenientes
del
tratamiento Peg 3 % a 18°C en
invernadero y el testigo no
presentó síntomas.
Tratamientos correspondientes a la
investigación
Medios de cultivos
T
7
E
M
P
E
18º C
Enfermas
R
A
T
U
Enfermas
A
18° C a 34º C
26º C
Sanas
R
Sanas
Enfermas
Sanas
1. m1=PEG 1 (3%)
20
20
20
20
20
20
2. m2=PEG 2 (6%)
20
20
20
20
20
20
3. m3=PEG 3 (9%)
20
20
20
20
20
20
4. m4=Sin BAP en el medio
20
20
20
20
20
20
5. m5=5 veces menor /dosis
20
20
20
20
20
20
6. m6=Testigo /dosis normal
20
20
20
20
20
20
7. m7=5 veces mayor /dosis
20
20
20
20
20
20
T
O
T
A
L
P
L
A
N
T
A
S
840
Variable evaluadas
Los parámetros de crecimiento que se evaluaron en los
periodos de estrés, enraizamiento y adaptación fueron:
• Área foliar (ancho por largo cm2)
• Altura desde la base del pseudo tallo hasta la ¨ V ¨ foliar
en cm.
• Peso de todas las plantas de cada tratamiento en gramos
• Se valora en cruces (X hasta 4X) el crecimiento radical de
cada tratamiento. Los valores son los siguientes:
X
0-1 raíz
2X
2-3 raíces
3X
4-5 raíces
4X
6-7 raíces
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
• Se utilizó un diseño completamente al azar con un arreglo
factorial, 7 (medios de cultivos) x 2 (presencia – ausencia
del virus) x 3 (tipo de temperaturas de 18º C, 26º C y 18º C
a 32º C)
Factores en estudio:
• Medio de crecimiento
• Tipo de planta
• Temperatura de crecimiento
Interacciones presentes:
• Medios de cultivo por tipo de planta
• Medios de cultivos por temperatura de crecimiento
• Tipo de planta por temperatura de crecimiento
• Medio de cultivo por tipo de planta por temperatura de
crecimiento
RESULTADOS
Descripción de las plantas adultas con síntomas.
Los síntomas diferenciales de plantas adultas enfermas en el
campo fueron el rayado amarillo que se torna en café oscuro y
la presencia de lesiones necróticas en las nervaduras de las
hojas inferiores y moteado clorótico.
Estos síntomas fueron confirmados por inmunoensayo y
microscopia electrónica
Fig. a) Un rayado amarillo
.
Fig. b) Un rayado café oscuro
Fig. c)Lesiones necróticas
Síntomas atípicos del Virus del Rayado del Banano (BSV)
Fig. a) Los síntomas
empiezan desde el
borde de la hoja
Fig. b) Síntomas locales
en las hojas inferiores
Fig. c) Síntomas del
moteado clorótico
Evaluación de síntomas en hijuelos
Los hijuelos no presentaron ningún rayado amarillo en
las hojas antes de la introducción in vitro (Fig. a)
Fig. a) hijuelos asintomáticos
ÁREA FOLIAR EN LOS DIFERENTES
TRATAMIENTOS IN VITRO
30,00
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
Stress
Enraizamiento
Adaptación
**: ALTAMENTE SIGNIFICATIVA
** m4i2t2 , m4i1t1 , m6i1t1 (interacción) ; ns periodo de enraizamiento y adaptación
** 18° C , 26° C
m7i2t2
m7i1t3
m7i1t1
m6i2t2
m6i1t3
m6i1t1
m5i2t2
m5i1t3
m5i1t1
m4i2t2
m4i1t3
m4i1t1
m3i2t2
m3i1t3
m3i1t1
m2i2t2
m2i1t3
m2i1t1
m1i2t2
m1i1t3
m1i1t1
0,00
ALTURA DE LAS PLANTULAS
** m4i1t1 ; m4i1t2 ; m6i1t1 ; m4i2t1 (interacción) -ns en el periodo de enraizamiento y
adaptación
ns 18° C a 34° C valores bajo de crecimiento.
** m4, m5, m6 (medios)
ns m2, m3, (Peg 6% y 9%)
Stress
Enraizamiento
m7i2t2
m7i1t3
m7i1t1
m6i2t2
m6i1t3
m6i1t1
m5i2t2
m5i1t3
m5i1t1
m4i2t2
m4i1t3
m4i1t1
m3i2t2
m3i1t3
m3i1t1
m2i2t2
m2i1t3
m2i1t1
m1i2t2
m1i1t3
m1i1t1
PESO DE LAS PLANTULAS
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
CRECIMIENTO RADICULAR EN EL
PERIODO DE ESTRES
Crecimiento Radicular
100%
90%
80%
Porcentaje
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
1
X
2X
3
3X
5
4X
7
9
11
13
15
17
19
21
23
25
27
29
Tratamientos
m4,(19-24); m5,(25-30) mayor crecimiento radicular.
m7,(37-42) menor crecimiento radicular, m3,(13-18 Peg 9%)
31
33
35
37
39
41
Vitroplantas con síntomas
precoz causado por el virus
Plántulas con síntomas precoces de BSV en cultivo in
vitro en combinación con estrés de frío e hídrico
Fig. a) Plántulas con PEG
al 3% a 18º C
Fig. b) Testigo.
Plántulas con síntomas por BSV en el periodo de
invernadero
Fig. a) un rayado amarillo en
las hojas
Fig. b) testigo.
Plantas de variación somaclonal
Fig. a) tipo variegado
Aislamiento, purificación y caracterización del virus
mediante la tinción negativa al 1% de ácido
Fosfotúngstico, de fracciones virales purificadas por
CsCl, fueron observadas al microscopio electrónico
Partículas virales baciliformes del virus del rayado del banano (BSV).
CONCLUSIONES
• Los síntomas diferenciales de plantas adultas enfermas en
el campo fueron el rayado amarillo que se torna en café
oscuro y la presencia de lesiones necróticas en las
nervaduras de las hojas inferiores y un moteado clorótico
en el área foliar. Esto síntomas permiten diferenciar el BSV
de otras enfermedades.
• Existió un crecimiento vegetativo heterogéneo de las
plantas sanas y enfermas en el periodo de estrés de los
tratamientos in vitro de 18° C y 26° C. La presencia de
concentraciones mayores de PEG de 6% y 9% disminuye
el crecimiento vegetativo in vitro. En el periodo de
enraizamiento
y
adaptación
se
recuperaron
significativamente.
• Las plántulas enfermas en condiciones de cultivo in vitro
presentaron síntomas de la enfermedad en un 20 %,
cuando fueron sometidas al estrés combinado de frío y
estrés hídrico. Estos síntomas aumentaron a un 50 %,
cuando las plántulas fueron transplantadas y cultivadas en
el invernadero, se observó que los síntomas resultaron
semejantes a las que se presentan en plantas adultas
enfermas con el BSV presencia de un rayado amarillo en
las hojas.
• Por primera vez en el Ecuador se logró el aislamiento,
purificación
por
ultracentrifugación
en
CsCl
y
caracterización por microscopia electrónica de un virus de
planta realizado mediante modificaciones exitosas del
protocolo descrito por Lockhart, 1986.
RECOMENDACIONES
• Difundir en la práctica agrícola bananera los síntomas
descritos en este trabajo que permiten diferenciar el BSV
de otras enfermedades.
• Introducir en la práctica de la micropropagación comercial
de banano el diagnóstico precoz establecido para plántulas
en la fase de endurecimiento en invernadero.
• Descifrar los mecanismos moleculares que inducen la
aparición de los síntomas de la enfermedad del BSV
cuando las plántulas son sometidas al estrés combinado de
frío e hídrico.
• Basado en el diagnóstico diferencial visual establecido
para plantas adultas, monitorear la presencia de la
enfermedad y erradicar las plantas enfermas.
AGRADECIMIENTO A:
Dra. Sofia Korneva
Dr. Anselmo Otero
Dr. Amano Gasupi
Dr. Miguel Ramos
Dr. Sabino Hernández
Sr. Cyndrich Miljenko
Ing. Bernardo Manzano
Biol. José Flores
Biol. Miguel Gutiérrez
Sr. Jorge Villavicencio
MSc. Florence Malafose (INIBAP).
• Dejo constancia de mi profundo aprecio por creer en la
juventud que sí podemos hacer investigaciones aplicadas para
resolver problemas nacionales como es el Virus del Rayado del
Banano (BSV), al Dr. Rodolfo Maribona, Director de mí Tesis,
por su ayuda invaluable.