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Detección de biomarcador falso por
reactividad de un análisis comercial
ELISA para CUZD1 con antígeno
del cáncer CA125
I. Prassas, D. Brinc, S. Farkona, F. Leung,
A. Dimitromanolakis, C.C. Chrystoja, R. Brand,
V. Kulasingam, I.M. Blasutig y E.P. Diamandis
Febrero de 2014
www.clinchem.org/content/60/2/381.full
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Introducción: El problema del biomarcador
 A pesar de los recientes avances en el desempeño de
tecnologías genómicas y proteómicas, muy pocos
biomarcadores nuevos (< 15) se han introducido en la
clínica en las últimas 2 décadas
 La introducción de un biomarcador a la clínica es un
proceso de varios pasos: detección, verificación,
validación pre clínica, validación clínica extensa con
enmascaramiento
 Cada paso de este proceso está propenso a errores que
pueden poner en riesgo la fase de desarrollo completa
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Introducción: El problema con los análisis
ELISA comerciales
 El método más común de la validación de biomarcadores es el
desarrollo de análisis basados en anticuerpos (ELISA)
 El desarrollo del análisis ELISA interno es costoso y demandante
 Los kits comercialmente disponibles representan la opción más
sencilla
 Como lo demuestra nuestro caso, estos reactivos en ocasiones
se venden sin haber sido expuestos a una rigurosa validación, lo
que puede ocasionar una considerable pérdida de tiempo e
inversión.
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Pregunta
 ¿Cuáles son algunos errores comunes
(analíticos, estadísticos, metodológicos)
que pueden ocurrir durante los diferentes
pasos de la detección de un biomarcador y
el proceso de validación?
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Introducción: Nuestro caso
 Se utilizaron kits ELISA comerciales para evaluar el desempeño
de nuestros principales posibles biomarcadores del cáncer de
páncreas (PDAC) (recientemente descubiertos)
 De estos, CUZD1 parece el biomarcador candidato más
promisorio para el diagnóstico del cáncer de páncreas
 En nuestros estudios de verificación pre clínicos iniciales de
CUZD1 (medidos por un kit comercial ELISA para CUZD1), este
biomarcador demostró un sólido desempeño diagnóstico
 Antes de continuar con los estudios de validación clínica
posteriores, realizamos la caracterización rigurosa de la
especificidad de este kit comercial
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Materiales y métodos
 Realizamos experimentos detallados para investigar la
especificidad del análisis comercial ELISA para CUZD1:
1.La clonación y expresión de la proteína CUZD1 se realizó en
forma interna en sistemas vectoriales de expresión en
levaduras y bacterias.
2.El antígeno puro recombinante de CUZD1 y varias muestras
biológicas con CUZD1, así como modelos ELISA para CUZD1
comerciales, se analizaron mediante:
 Inmunoelectrotransferencia
 HPLC de exclusión por tamaño
 Espectrometría de© masas
(LC-MS Orbitrap)
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Resultados
Spanish Translation:
Inmunoreactividad de CUZD1 (USCN
ELISA) (mAU)
N.º de fracción de HPLC
Inmunoelectrotransferencia: anti
CUZD1
Peso molecular
Calibrador de CUZD1
Líquido amniótico (vacío)
Ascitis (vacío)
Figura 1. (A), La evaluación de la inmunoreactividad de CUZD1 (USCN ELISA) en fracciones eluidas de una columna
de SEC demostró que la señal de valor máximo se observó siempre en el volumen vacío (peso molecular, 500 kD). Se
obtuvo el mismo perfil de elución independientemente del tipo de muestra usado, que incluyó calibradores CUZD1 del
kit ELISA, muestras diferentes de ascitis pancreática, suero de cáncer de ovario almacenado. (B), La
inmunoelectrotransferencia de varias fuentes inmunoreactivas de CUZD1, como se muestra, confirman el alto peso
molecular (MW) (250 kDa) del antígeno objetivo (no se detectaron bandas en el peso molecular previsto de CUZD1 a
aproximadamente 70 kDa).
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Resultados
Ver traducción al
español de la
tabla 1 en la
diapositiva 9
Figura 2. Comparaciones de la señal de CUZD1 verificada mediante EM y la inmunoreactividad de
“CUZD1” comercial. Utilizamos la espectrometría de masas (LC-MS Orbitrap) para comparar la expresión de
CUZD1 (verificación mediante EM) y la inmunoreactividad del kit “CUZD1” frente a varios líquidos biológicos.
Como se muestra en la figura, los resultados de todas las muestras con CUZD1 fueron negativos en el kit
CUZD1 y todas las muestras sin CUZD1 presentaron inmunoreactividad con el kit comercial ELISA para
"CUZD1".
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Traducción al español de la Tabla 1. de la diapositiva 8
Tabla 1. Identificación mediante EM e inmunoreactividad mediante
ELISA para CUZD1 de varias preparaciones y líquidos biológicos.
Preparación/líquido
Identificación
mediante EMa
Sí
Sí
Inmunoreactividad por
CUZD1b
No
No
Sí
No
Supernadante de la estirpe
celular del cáncer que expresa
la CUZD1 (MKN74)
Sí
No
Calibradores de CUZD1 del kit
(USCN)
Ascitis de cáncer de páncreas
almacenado
Suero de cáncer de páncreas
almacenado
No
Sí
No
Sí
No
Sí
Proteína CUZD1 purac
Lisado de E. coli que expresa
la CUZD1
Supernadante de levadura que
expresa la CUZD1
a
Identificación mediante EM de CUZD1 en LTQ-Orbitrap después de la digestión mediante tripsina.
Inmunoreactividad del kit ELISA para CUZD1 de USCN Life Sciences.
c Esta proteína fue proporcionada por USCN y se produjo en E. coli.
b
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Resultados
Spanish Translation:
Inmunoreactividad (USCN ELISA) (ng/ml)
Inmunoreactividad (USCN ELISA) (ng/ml)
Figura 3. Comparación de la inmunoreactividad de CUZD1 y la inmunoreactividad de otros marcadores
conocidos (CA125 y CA19-9). (A), Se midió la inmunoreactividad de CUZD1 (USCN) y la inmunoreactividad
de CA125 (R&D Systems) en 200 muestras de suero (100 muestras de suero normales y 100 muestras de
suero de PDAC). Se observó una sólida correlación (Pearson r = 0.931) entre estos dos análisis. (B), La
correlación de la inmunoreactividad de CUZD1 (USCN ELISA) con la inmunoreactividad de CA19-9 (análisis
automatizado Siemens) en el mismo conjunto de datos demostró correlaciones altamente inferiores (r = 0.451).
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Resultados
Figura 4A. (A), Inmunoelectrotransferencia (WB) con anticuerpo CUZD1 (del kit ELISA para CUZD1) y un
anticuerpo CA125 (de R&D Systems) en comparación con las proteínas CA125 puras (verificado mediante EM)
y CUZD1 recombinantes. Ambos anticuerpos reconocen la CA125 aproximadamente a 170 kDa pero no la
CUZD1. MW, normas de peso molecular.
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Resultados
Traducción al español:
A. Valores de absorbencia
B. Suero de cáncer de páncreas almacenado (1:2)
C. Suero de cáncer de páncreas almacenado (1:20)
D. Ascitis de cáncer de páncreas almacenado (1:20)
E. Antígeno CA125 puro (verificación mediante EM)
F. Antígeno CUZD1 puro (verificación mediante EM)
G. Fondo
Figura 4B. (B), Análisis intermedios híbridos con anticuerpos de detección/captura mostrados. La
inmunoreactividad
se midió en varias muestras (como se indica en la leyenda) y las diluciones se indican entre paréntesis. En
todos los casos, se obtuvieron señales similares, excepto por el análisis CA125/CUZD1, para el cual las
inmunoreactividades siguieron la misma tendencia pero las señales fueron considerablemente menores.
Ninguno de los análisis demostró inmunoreactividad con la proteína CUZD1 pura (columna F), mientras que
todos los análisis detectaron el antígeno CA125 puro
(columna
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Resultados
Traducción al español
Material de CC CA125 (BioRad)
Inmunoreactividad de CA125
(Analizador automatizado Immulite
Siemens) (u/ml)
Inmunoreactividad de CUZD1
(USCN ELISA) (ng/ml)
Figura 4C. (C), Comparación de inmunoreactividad con el análisis ELISA para CUZD1 y CA125 ELISA
(Siemens) usado clínicamente. Las muestras utilizadas fueron suero de CC comercial de Bio-Rad Laboratories.
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Pregunta 2:
 La espectrometría de masas puede proporcionar
respuestas altamente definitivas respecto de la
presencia (y la cantidad) de una proteína en una
muestra. Si este es el caso, ¿por qué los análisis
ELISA continúan siendo el método más común en
los estudios de validación de biomarcadores en
suero?
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Conclusiones
 El análisis comercial de CUZD1 reconoce un antígeno completamente
diferente (CA125) del CUZD1.
 Este fenómeno no es un problema de reacción cruzada, dado que el kit
“CUZD1” no puede reconocer ninguna forma de proteína CUZD1.
 Toda la "inmunoreactividad de CUZD1" observada corresponde a la
inmunoreactividad de CA125
 La validación rigurosa de los análisis comerciales puede prevenir el
desperdicio de una considerable cantidad de tiempo e inversiones
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Pregunta 3:
 La Administración de Medicamentos y Alimentos
de los EE. UU. (FDA) impone reglamentaciones
muy estrictas cuando se planea la utilización de
un análisis comercial con fines clínicos. Sin
embargo, las normas no son tan estrictas en el
caso de los reactivos designados "con fines de
investigación solamente". ¿Considera que
también se deberían imponer reglamentaciones
más estrictas para esta última categoría de
reactivos?
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