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Productos proteolíticos circulantes
de carboxipeptidasa N para la
detección temprana del cáncer de
mama
Y. Li, Y. Li, T. Chen, A.S. Kuklina, P. Bernard,
F.J. Esteva, H. Shen, M. Ferrari y Y. Hu
Enero de 2004
www.clinchem.org/content/60/1/233.full
© Copyright 2014 by the American Association for Clinical Chemistry
Antecedentes
 Los biomarcadores circulantes actuales del cáncer de mama presentan
una sensibilidad diagnóstica deficiente
 Sensibilidad de CA15-3 y CA27.29: 30 % en cada etapa; 60-70 % en
casos avanzados; también mayor en enfermedades benignas
 El cribado mamográfico del cáncer de mama no se recomienda en las
mujeres jóvenes (< 40 años) y no está adoptado comúnmente en las
mujeres mayores
 La radiación es perjudicial para los pacientes positivos falsos en
procedimientos de seguimiento
 Se necesitan con urgencia métodos nuevos y no invasivos para el
diagnóstico temprano del cáncer de mama
Consulte Editorial por Diamandis EP. Tumor Microenvironment–Released
Peptides: Could They Form the Basis for an Early-Diagnosis Breast Cancer Test?
(Péptidos tumorales liberados en el microentorno: ¿podrían servir de base para
una prueba de diagnóstico temprano del cáncer de mama?) Clinical Chemistry
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2014; 60: 4-6.
Antecedentes
 La actividad proteolítica en el microentorno del tumor (no
necesariamente proveniente de células tumorales) puede
liberar péptidos a la circulación que constituyen posibles
biomarcadores para la supervisión de la evolución del tumor
Proteasa/peptidasa
Microentorno del tumor
Complemento/cininógeno
Péptido circulante
Célula tumoral
Célula inflamatoria
Célula endotelial
Fibroblasto
Consulte Editorial por Diamandis EP. Tumor Microenvironment–Released Peptides: Could They Form the
Basis for an Early-Diagnosis Breast Cancer Test? (Péptidos tumorales liberados en el microentorno:
¿podrían servir de base para una prueba de diagnóstico temprano del cáncer de mama?) Clinical
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Antecedentes
 La carboxipeptidasa N (CPN), también conocida como
arginina/lisina carboxipeptidasa, forma parte de una familia
más grande de metalopeptidasas de zinc
 La CPN realiza la escisión del extremo carboxílico (C) de la
arginina o lisina de péptidos endógenos
 Sustratos: bradicinina (BK9), anafilotoxinas (C3a, C4a y C5a) y
fibrinopéptidos A y B
 AEDT es un inhibidor de la CPN
 La relación entre el cáncer de mama, la CPN y las
concentraciones circulantes de los productos proteolíticos de
la CPN no se ha establecido
Consulte Editorial por Diamandis EP. Tumor Microenvironment–Released Peptides: Could They Form the
Basis for an Early-Diagnosis Breast Cancer Test? (Péptidos tumorales liberados en el microentorno:
¿podrían servir de base para una prueba de diagnóstico temprano del cáncer de mama?) Clinical
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Materiales y métodos
Modelo murino con cáncer de mama:
(Ratones atímicos, n=8; estirpe celular de cáncer de mama: MDA-MD-231)
Inyección
2 semanas
4 semanas
6 semanas
8 semana
Obtención de suero
Obtención de tejidos
Pacientes con cáncer de mama (BC):
Control
BC-I
BC-II
BC-III BC-IV
Total
Plasma
sanguíneo
10
11
11
14
12
58
Porciones
de tejidos
10
17
77
16
-
110
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Materiales y métodos
Fraccionamiento de nanoporos
EM MALDI-TOF
Análisis de datos
Secuenciación de
cuantificación
Incubación
Enjuage
Elución
proteínas grandes
péptidos pequeños
péptidos estándar
Los péptidos circulantes se aislaron mediante micromatriz
genética de sílice nanoporoso y se analizaron mediante
espectrometría de masas
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A
Resultados
Intensidad
Factor I
AEDT
Quimotripsina AEDT
Carboxipeptidasa N AEDT
B
C
Figura 1. Análisis de escisión de péptidos ex vivo en el péptido C3f sintético. A. Análisis de escisión de péptidos C3f en NIF
(líquido intersticial normal), CM (medio de cultivo celular acondicionado) y TIF (líquido intersticial tumoral). B. Los sitios específicos
de escisión se indican en el péptido C3f, un sustrato del factor I de las enzimas, quimotripsina y CPN. C. Detección de expresión
de CPN en diferentes condiciones de análisis. C3f, péptido sintético His6-C3f_S1304-R1320-His6 solamente; NIF o TIF, líquido
intersticial normal o tumoral solamente; AEDT, un inhibidor de la CPN; NIF (CPN−) y TIF (CPN−), líquido intersticial de tejido
normal y tumoral con reducción de CPN; CM (CPN−), medio acondicionado con reducción de CPN.
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A
Resultado
Proteínas totales
Densidad integrada
Gel con coloración
B
Normal (segunda semana)
Normal (octava semana)
Tumor (segunda semana)
Tumor (octava semana)
C
Semana
Segunda semana
Cuarta semana
Sexta semana
Octava semana
Figura 2. Expresión de CPN en suero y tejidos de ratones. A. Expresión de inmunotransferencia de CPN en líquido
intersticial mamario normal (NIF) y líquido intersticial tumoral (TIF). Se utilizó el gel con coloración azul brillante de Coomassie
(CBB) para la evaluación de carga uniforme. Tanto la inmunotransferencia como el gel con coloración CBB estuvieron sujetos
al análisis cuantitativo de la imagen mediante el software ImageJ (NIH) y el resultado se presentó por histograma. B. Análisis
de inmunohistoquímica de CPN en tejido mamario normal y tejido tumoral obtenido en la 2 da y la 8va semanas. C.
Inmunotransferencia de CPN en suero de ratones. La seroalbúmina (SA) con coloración Ponceau S sirve como control interno
de carga. (Grupos: 0, 2da, 4ta, 6ta, 8va semana; n = 4/grupo).
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Resultado (3)
RPPGFSPF (bradicinina)
Intensidad relativa
Período
Figura 3. El diagrama de dispersión vertical de las intensidades de valores máximos normalizados en
la EM MALDI TOF para las posibles características distintivas de péptidos en muestras de suero
obtenidas de animales portadores de tumores (modelo murino con cáncer de mama).
La relación de masa-carga y la identificación de secuencias se enumeran en cada panel. Número de
ratones, n = 8; prueba de la t de Student, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
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A
Resultado (4)
B
C
Control
Sano
Porcentaje
Figura 4. Expresión de CPN en plasma y tejidos humanos. A. Tinciones de IHC para CPN en la cohorte de
control humana (tejido próximo al cáncer o adenosis) y tejidos tumorales.. B. El histograma muestra el porcentaje de
resultados de la puntuación de tinciones de IHC para CPN (n = 10, 7, 77 y 16 para control, preparaciones BC-I, BC-II y
BC-III, respectivamente). El método de puntuación del patrón de tinción de IHC hace referencia al protocolo informado
por Zhang y cols. (30). C. Expresión de CPN mediante inmunotransferencia en plasma humano de controles sanos y
pacientes con cáncer de mama en diferentes etapas de la enfermedad (I, II, III y IV). La seroalbúmina (SA) con
coloración Ponceau S sirvió como control interno. n = 4/grupo.
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Resultado (5)
m/z 904.48
RPPGFSPF (bradicinina)
Intensidad relativa
Controles
Figura 5. Perfiles de posibles características distintivas de péptidos en plasma de mujeres
sanas y mujeres con cáncer de mama en diferentes etapas patológicas. Número de muestra: n =
10, controles sanos; n = 11, etapa I del cáncer de mama (BC-I); n = 12, etapa II del cáncer de mama
(BC-II); n = 15, etapa III del cáncer de mama (BC-III); n = 10, etapa IV del cáncer de mama (BC-IV);
prueba de la t de Student, * P < 0.05, *** P < 0.001.
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Análisis
 La expresión de CPN aumentó en el tejido mamario
tumoral en comparación con el tejido mamario
normal; sin embargo, no se observaron cambios en
la concentración sanguínea
 Seis péptidos circulantes catalizados mediante CPN
reflejan la mayor actividad de la CPN en tumores ya
en la primera etapa patológica del cáncer de mama
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Preguntas
 ¿Es posible usar un único biomarcador para el
diagnóstico o pronóstico del cáncer?
 ¿Cuáles son las ventajas y desventajas del uso de
múltiples péptidos circulantes como biomarcadores
del cáncer?
 ¿Por qué las concentraciones de péptidos
catalizados mediante CPN seleccionadas no se
correlacionaron de manera adecuada con la masa
tumoral?
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