Download Clase-I-DNA_PA2015

UNIVERSIDAD NACIONAL DE QUILMES
Gen
LICENCIATURA EN BIOTECNOLOGIA
AREA: BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR
ASIGNATURA:
GENETICA MOLECULAR
TURNO NOCHE:
PROFESOR TITULAR: DR. VICTOR ROMANOWSKI
PROFESOR ADJUNTO: DRA. PATRICIA AGOSTINO
Mol
BLOG: http://genmol.blog.unq.edu.ar/
Gen
Mol
TEMAS DE LAS CLASES TEORICAS
Gen
Mol
•Estructura del material genético.
•Replicación del DNA.
•Mutaciones y reparación del daño en el DNA.
1º PARCIAL
•Recombinación.
•Mecanismos de transposición.
•Transcripción.
•Regulación de la expresión génica.
•Traducción.
2º PARCIAL
•Direccionamiento de proteínas.
•Técnicas corrientes en genética molecular.
•DNA recombinante y estudios cromosómicos.
•Organismos transgénicos y terapia génica.
A LO LARGO DEL
CUATRIMESTRE
Bibliografía recomendada
Gen
Mol
•Biología Molecular de la célula. Alberts B., Johnson A., Lewis J.,
Raff M., Roberts K., Walter P. (2002). 4º edición, Garland Publishing,
Inc. Catálogo biblioteca UNQ: 571.6 BIO (ediciones 1996, 2002 y
2004).
•Biología Celular y Molecular. Lodish H, Baltimore D., Berk A.,
Zipursky S.L., Matsudaira P., Darnel, J. (2002). 4º edición, editorial
Médica Panamericana SA, España (5º edición en inglés). Catálogo
biblioteca UNQ: 571.6 BIO (ediciones 2001 y 2005).
•Gene VIII. Lewin, B. (2004). Ed. Prentice Hall. (y ediciones
anteriores). Catálogo biblioteca UNQ: 572.8 LEW (edición 1995,
Gene V).
•Lehninger. Principles of Biochemistry, Lehninger A.L., Nelson D.L.,
Cox M.M. (2008), 5º edición (en castellano: 3º edición, 2001, editorial
Omega, España). Catálogo biblioteca UNQ: 572.3 LEH.
•Molecular Biology. Weaver, R. (2004). 4º edición, Editorial
McGraw-Hill.
Información actualizada y sitios de interés
www. pubmed.com
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Books
Gen
Mol
Cronograma (primeras clases)
Gen
Mol
GENETICA MOLECULAR, LABORATORIOS
Gen
Mol
Extracción de ADN de tejidos humanos
Alumnos + algunos familiares por vía materna
Amplificación por PCR y análisis de polimorfismos
ADN nuclear
Gen Amelogenina
Identificación
sexual
Deleciones en
el cromosoma Y
Total: 5 trabajos prácticos
ADN mitocondrial
Herencia Materna
TP 1: Extracción de ADN a partir de
muestras de mucosa bucal
Gen
Mol
Se realizará una extracción de ADN humano para su posterior
amplificación utilizando la técnica de PCR (reacción en cadena de la
polimerasa). Los alumnos extraen su propio ADN a partir de muestras de
mucosa bucal. Se suman también muestras de familiares por vía materna.
Extracción con
cloroformo-isoamílico.
Semi-cuantificación
mediante electroforesis
en gel de agarosa.
2 clases
TP 2: Caracterización del sexo mediante la
amplificación por PCR del gen de amelogenina.
Gen
Mol
El gen de amelogenina (AMG) codifica para una proteína del esmalte
dental, y se encuentra en ambos cromosomas sexuales. La secuencia
de este gen en el cromosoma Y se diferencia de la del X por una
deleción de aproximadamente 200 pb, por lo que la visualización del
producto de PCR permitirá distinguir las muestras provenientes de
mujeres de aquéllas provenientes de varones.
Amplificación de AMG
por PCR. Resolución
en gel de agarosa 2%
2 clases
TPs 3 y 4: Detección de RFLPs (Restriction Fragment
Lenght Polymorphisms) mediante la amplificación por
PCR de un fragmento de ADN mitocondrial.
Gen
Mol
A diferencia del DNA nuclear, la herencia del
DNA mitocondrial es exclusivamente materna.
Esta unidad incluye la amplificación por PCR de
una región del DNA mitocondrial de 312 pb
(conocida como secuencia de Anderson) y su
posterior digestión enzimática para poder
visualizar el patrón de RFLPs característico de
cada muestra. La visualización de RFLPs se
realiza mediante la técnica de electroforesis en
geles de arcrilamida.
Amplificación por PCR fragmento ADNmit
Digestión con enzima MnlI
Visualización patrones RFLP
3 clases
TP 5: Detección de deleciones en el cromosoma
Y asociadas con infertilidad masculina.
Gen
Existen grandes regiones en el cromosoma Y asociadas con la producción de
células espermáticas, conocidas como AZF (azoospermia factor). Deleciones
en algunas de estas regiones se asocian a infertilidad masculina.
Se utilizarán los conceptos aprendidos (como PCR multiplex) para el estudio
de microdeleciones correspondientes a la región de los genes AZF y su
correlación con infertilidad y cáncer testicular.
2 clases
Mol
FORMA DE EVALUACION
Gen
Teoría:
•Dos exámenes parciales y un integrador.
•Se promociona con 7 (siete) o más puntos en los parciales.
Trabajos prácticos:
•80% de asistencia
•Informe de TPs
•Exposición de trabajos
•Examen de TPs
REGIMEN DE ESTUDIOS DE LA UNQ
http://www.unq.edu.ar/advf/documentos/5006e6bcefbf8.pdf
ARTICULO 11°: Se considerará ausente a aquel alumno que no se haya presentado a
las instancias de evaluación pautadas en el Programa de la asignatura.
Mol
Clase de hoy:
Gen
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
RESUMEN DE LA CLASE
Introducción sobre los siguientes temas:
Primeras evidencias sobre los ácidos nucleicos.
Bases, nucleósidos y nucleótidos.
Estructura química y estabilidad. DNA A, B y Z.
Estructura del RNA.
Hidrólisis y densidad de los ácidos nucleicos.
Efecto hipercrómico.
Desnaturalización (térmica, por solventes y agentes caotrópicos)
Avances científicos en base a la desnaturalización y renaturalización.
Mol
El dogma central de la biología molecular
replicación de DNA
DNA
procesamiento de RNA
splicing, edición, modificación de
nucleótidos y de extremos 5´y 3´
reparación
recombinación
transcripción
inversa
transcripción
virus a DNA
retrovirus y
retroelementos
RNA
transcripción y
replicación de RNA
virus a RNA
traducción
proteína
plegamiento (folding),
procesamiento,
direccionamiento (targeting)
Expandiendo aun más el dogma: non-coding RNAs (microRNA, etc.)
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Las primeras evidencias
Un poco de historia…
1928: Frederick Griffith
Infección con dos cepas de
Streptococcus pneumoniae
Lisas (S): virulentas
(S)
(R)
Rugosas (R): inofensivas
(S) inactivada
Griffith showed that adding heat-killed
virulent bacteria (harmless to mice) to
a live nonvirulent strain permanently
transformed the latter into lethal,
virulent, encapsulated bacteria.
(R) + (S) inactivada
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
¿Como se demostró que el DNA es el responsable
de la herencia?
El experimento de Avery O., McLeod C. y McCarty M.
(1944) fue la primer evidencia directa de que el DNA
es la base de la información genética
Extract from heated smooth (S) bacteria
Extract from heated smooth (S) bacteria
treatment with DNAase (digests DNA)
treatment with protease (digests proteins)
mix with rough (R) bacteria and injected into mice
mix with rough (R) bacteria and injected into mice
mice lived
mice died
DNA carries genetic information
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Alfred Hershey y Martha Chase (1952)
Determinaron que el DNA
es el material genético
en el bacteriófago T2
32P
experiment
35S
experiment
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
La naturaleza química de los ácidos nucleicos
Cuando se realiza la hidrólisis
completa de los ácidos nucleicos,
se obtienen tres tipos de
componentes principales:
•Azúcar: una pentosa.
•Ácido fosfórico
•Bases nitrogenadas:
purinas y pirimidinas
A, G, T, C están presentes en el ADN
A, G, U, C están presentes en el ARN
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Nomenclatura
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Bases inusuales
Además de las bases nitrogenadas anteriormente descritas, se han encontrado
otras bases nitrogenadas en algunos virus o formando parte de algunos tipos
especiales de RNAs.
Ejemplos de algunas de estas bases púricas poco corrientes son:
•Hipoxantina,
•Xantina,
•2-metiladenina,
•7-metilguanina
•6-metil-aminopurina.
Ejemplos de bases pirimidínicas:
•5-metilcitosina (propia del DNA)
•5-hidroximetil citosina (HMC): sustituye a la citosina en los fagos T-pares.
En los RNA de transferencia (tRNA) se encuentran
•Ribotimidina,
•Dihidrouridina,
•Seudouridina
•Inosina (I).
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
La estructura del DNA
REGLAS DE CHARGAFF (fines de la década del ‘40)
Para el DNA doble cadena (dsDNA)
•La composición de bases varía de una especie a otra.
•La composición de bases es la misma en distintos tejidos de una misma
especie.
•La proporción de Adenina (A) es igual a la de Timina (T). %A = %T.
•La proporción de Guanina (G) es igual a la de Citosina (C). %G= %C.
•La proporción de bases púricas (A+G) es igual a la de las bases
pirimidínicas (T+C). (A+G) = (T + C).
•La proporción entre (A+T) y (G+C) es característica de cada organismo,
pudiendo tomar por tanto, diferentes valores según la especie estudiada.
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
% de bases en
distintos
organismos
HMC = hidroximetil-citocina
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
La estructura del DNA
PATRON DE DIFRACCION DE RAYOS X
Principios de la década del ‘50
•Patrón helicoidal del DNA.
•Dos periodicidades a los largo del eje, una
primaria de 3,4 A y una secundaria de 34 A.
"The instant I saw the picture my mouth fell open and my
pulse began to race." -- James D. Watson (1968), The
Double Helix, page 167. New York: Atheneum, Library of
Congress card number 68-16217.
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Estructura del DNA: la doble hélice
(1953)
• El esqueleto hidrofìlico de grupos fosfato y deoxiribosa
alternantes está expuesto al agua del ambiente
• El anillo de furanosa está en la
conformación C-2´endo
• Las bases están apiladas en el interior de la doble hélice,
con sus planos perpendiculares al eje de la doble hélice
• El apareamiento de las dos cadenas genera un surco mayor y un surco menor en la
superficie de la doble hélice
G
C
A
T
James Watson & Francis Crick,
1953, Nature, vol 171, 737-738
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
• Cadenas antiparalelas
La estructura del DNA
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Fuerzas que estabilizan la doble hélice
• Enlaces de hidrógeno (pequeña contribuión)
• Apilamiento de bases e interacción hidrofóbica
• Interacciones iónicas:
- Repulsión entre las cargas negativas de los fosfatos
- Los cationes actúan como contraiones estabilizando el DNA (divalentes
más eficientes que monovalentes; el Mg+2 estabiliza la estructura del RNA)
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Comparación de las formas A, B y Z del DNA
La forma B es la más estable en condiciones fisiológicas
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
DNA A: 75% agua
(esporos), Na+
DNA B: 92% agua
Watson & Crick
DNA Z:
poli-pur-pyr, -GCGC…
alta [Na+]
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Horquillas (hairpins)
Estructuras inusuales
Palíndromos (palindromes)
Repeticiones en espejo (mirror repeats)
Cruciformes (cruciforms)
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Estructuras inusuales: triplex DNAs
Apareamiento tipo Hoogsteen: Bajo ciertas condiciones, los nucleótidos pueden formar
puentes de hidrógeno adicionales dando lugar a tramos de DNA de triple hélice.
H-DNA: "In vitro" es posible obtener tramos de triple hélice intercalando oligonucleótidos
cortos constituidos solamente por pirimidinas (timinas y citosinas) en el surco mayor de una
doble hélice. No se sabe la función biológica del ADN-H aunque se ha detectado en
cromosomas eucarióticos.
Apareamiento tipo Hoogsteen
Estables a pH bajos (citocina protonada, C+)
H-DNA
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Estructuras inusuales: cuadruplex DNA
DNA cuadruplexo: "In vitro" se han obtenido cuartetos de guanina (DNA cuadruplexo) unidas
mediante enlaces tipo Hoogsteen, empleando polinucleótidos que solamente contienen
Guanina (G). Los extremos de los cromosomas eucariotas (telómeros) tienen una estructura
especial con un extremo 3' OH de cadena sencilla (monocatenario) en el que se repite muchas
veces en tandem una secuencia rica en guaninas. Se piensa que el DNA cuadruplexo telomérico
serviría para proteger los extremos cromosómicos de la degradación enzimática.
Ejemplo de secuencia telomérica rica en guaninas (G):
5´P TTGGGTTGGGGTTGGGG...............TTGGGG 3'OH
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Estructura del RNA
El RNA es químicamente más reactivo que el DNA
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
La estructura del RNA
Typical right-handed stacking pattern of single
stranded RNA. The bases are shown in gray, the
phosphate atoms in yellow, and the riboses and
phosphate oxygens in green.
Secondary structure of RNAs. (a) Bulge, internal
loop, and hairpin loop. (b) The paired regions
generally have an A-form right-handed helix, as
shown for a hairpin.
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Las moléculas de ssRNA pueden exhibir
conformaciones variadas
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Estructuras secundarias en RNA
tRNA
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Tipos principales de RNA que fabrican las células
Las células
producen
varios tipos de
RNA
Tipo de RNA
Función
mRNA
RNA mensajeros, codifican proteínas
 1-5 %
rRNA
RNA
ribosómicos,
forman
la
estructura básica de los ribosomas y
catalizan la síntesis de proteínas
 80 %
tRNA
RNA de transferencia, cruciales en la
síntesis
de
proteínas
como  10-15
adaptadores entre el mRNA y los
%
aminoácidos
snRNA
RNA pequeños nucleares, participan
en
varios
procesos
nucleares,
incluyendo la maduración del premRNA
snoRNA
RNA pequeños nucleolares participan
en el procesamiento y modificación
química de los rRNA
Otros RNA
Participan
en
diversos
tipos
celulares, como la síntesis de los
telómeros,
la inactivación
del
cromosoma X y el transporte de
proteínas
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Los RNAs no-codificantes
Perkins et al., 2015. Expanding the ‘central dogma’: the regulatory role of nonprotein coding genes and
implications for the genetic liability to schizophrenia. Molecular Psychiatry (2005) 10, 69–78
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Propiedades fisicoquímicas
de los ácidos nucleicos
• Medio ácido y alcalino
• Densidad de flotación
(ultracentrifugación en gradientes de densidad)
• Espectro UV
• Temperatura de
desnaturalización
(estabilidad de la doble hélice a medida que se incrementa la temperatura)
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Hidrólisis química en medio ácido
Ácidos fuertes: escinden tanto los enlaces fosfodiéster
como los enlaces N-glicosídicos.
Ácidos débiles: escinden los enlaces N-glicosídicos. Los
enlaces de las purinas son más lábiles que los de las
pirimidinas. Se obtiene ácido nucleico sin bases púricas
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Hidrólisis química en medio alcalino
RNA
Clivaje del
enlace
fosfodiester
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Densidad de los ácidos nucleicos
Existe una relación lineal entre el contenido en G+C y la densidad del DNA determinada en un
gradiente de densidad. A mayor contenido en G+C, mayor densidad.
DNA
Densidad (g/cm3)
% (G+C)
Polímero A-T
1.675
0
Diplococcus pneumoniae
1.700
42
Escherichia coli
1.710
51
Serratia marcescens
1.716
55
Mycobacterium phlei
1.732
73
Basándose en múltiples estudios de la densidad de los DNAs de diferentes organismos y de su
composición en bases nitrogenadas, se ha establecido una fórmula empírica que relaciona la
densidad de flotación () con el contenido en G+C expresado en %:
 = 1,660 + 0,00098(G+C)
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Desnaturalización del DNA
Doble cadena (ds)
Simple cadena (ss)
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Desnaturalización del DNA
Condiciones que favorecen la desnaturalización
•Alta temperatura
•Baja fuerza iónica (repulsión de fosfatos)
•Alto pH (desprotonación de bases)
Monitoreo de la desnaturalización
•Los enlaces conjugados de las bases generan absorción en el UV a 260nm
Nucleótidos libres> ssADN> dsADN
•La temperatura a la cual la A260 alcanza la mitad de su valor máximo
es denominada Tm (temperatura de melting)
•La Tm depende de la concentración salina, pH, composición, longitud
•Oligonucleótidos cortos: Tm (oC) = (A+T)x2 + (C+G)x4
Cálculo de Tm
•Oligonucleótidos largos:
Tm = 81.5 +16.6Log [Na+] + 0.41 (%CG) – (625/N)
(N=longitud del oligo)
DESNATURALIZACION POR CALOR
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Parámetros que intervienenen en la desnaturalización del DNA
Parámetro
Composición de
bases
Efecto sobre Tm
Efecto sobre la velocidad de
renaturalización
Incremento de Tm con el
aumento del %G-C
No ejerce efecto
<150 bp; incremento de
Tm con el incremento de
longitud; >500 bp no hay
efecto
Incrementa la velocidad con la longitud
Fuerza iónica
Incremento de Tm con el
aumento de [Na+]
Optimo a 1.5 M Na+
% bp mismatch
Disminuye Tm con el
aumento de %mismatch
Disminuye la velocidad con el aumento de
%mismatch
Concentración
No ejerce efecto
Aumenta la velocidad con el aumento de [DNA]
disminuye Tm con el
aumento de
[formamide], [urea]
Optimo a 50% formamide
Longitud
Agentes
denaturalizantes
Temperatura
-
Optima a 20°C por debajo de Tm
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Efecto hipercrómico
The purine and pyrimidine bases in DNA absorb UV light maximally at a wavelength of approximately 260
nm. In double-stranded DNA, however, the absorption is decreased due to base-stacking interactions. When
DNA is denatured, these interactions are disrupted and an increase in absorbance is seen. This change is
called the hyperchromic effect. The extent of the effect can be monitored as a function of temperature
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Renaturalización
• La desnaturalización es un proceso reversible
• Reanealling: reasociación de las cadenas de DNA
Algunos usos experimentales
de la hibridación de ácidos
nucleicos:
•PCR
•Southern blot
•Northern blot
•in situ hybridization
•D-loop or R-loop mapping
•Cot curves
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Avances científicos
• Disociación y reasociación de las hebras
complementarias del DNA (hibridación de sondas)
• Replicación del DNA in vitro (síntesis de genes usando
cada una de las hebras de la doble hélice como molde
para la copia)
• PCR (amplificación de un segmento de DNA en un
tubo de ensayo)
• Síntesis de DNA a partir de RNA (transcriptasa reversa
de retrovirus)
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Avances científicos
• Enzimas de restricción (tijeras mágicas para cortar
DNA en forma precisa)
• Ligasa (pegamento especial para unir trozos de DNA:
permite la construcción de moléculas recombinantes)
• Enzimas de restricción + ligasa =
DNA recombinante (ingeniería genética)
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Hibridación
Reasociación de secuencias
complementarias
secuencia blanco + sonda
• DNA: Southern blot
• RNA: Northern blot
•
Marcación radioactiva, fluorescente,
quimioluminiscente, etc.
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
Southern blot
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
PCR (Polymerase chain reaction)
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I
En resumen…
Primeras evidencias sobre los ácidos nucleicos.
Naturaleza química de los ácidos nucleicos.
Bases, nucleósidos y nucleótidos.
Estructura química y estabilidad del DNA.
Tipos de estructura de DNA (A, B, Z).
Estructura y tipos de RNA.
Hidrólisis y densidad de los ácidos nucleicos.
Efecto hipercrómico.
Desnaturalización (térmica, por solventes y agentes
caotrópicos)
Avances científicos en base a la desnaturalización y
renaturalización de los ácidos nucleicos.
Gen
Mol
¿Preguntas?
[email protected]