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HIBRIDACIÓN DE
ACIDOS NUCLEICOS
Hibridación de Ácidos Nucleicos
Aplicación Practica :
Áreas :Biología Molecular
Ingeniería Genética
Patología Molecular
Esta basada en el proceso de renaturalización
de dos cadenas sencillas de ADN
previamente desnaturalizado.
Estructura primaria
Estructura secundaria
Secuencia de nucleótidos
• Puentes de hidrógeno
• Apilamiento de bases
(stacking)
• Interacción
Fuerzas no covalentes
Agua
Reversible
Cationes
 Pérdida de la estructura secundaria (doble hélice)
Ruptura de fuerzas no covalentes
Separación de las dos hebras
Fenómeno fisiológico
 ARN
Funcionalidad DNA
Apareamientos intracatenarios
ARNt, ARNr
• Replicación
• Transcripción
1. Acidos
alteración estructura primaria
2. Bases
DNA estable en medio alcalino
3. Agentes químicos
Urea
4. Agentes físicos
Moléculas
Polares
Pequeñas
Grupos amino y carbonilo
Formamida
Temperatura
Formaldehido
Efecto de la Temperatura:
Desnaturalización / Renaturalización
Desnaturalización: cambios en las
propiedades físicas del ADN
Influencia sobre la Viscosidad
Desnaturalización: cambios en
las propiedades físicas del ADN
Influencia sobre la absorción ultravioleta
Bases nitrogenadas, nucleósidos y nucleótidos , Ac. Nucleicos
de cadena sencilla
Sistema de dobles
Max. Absorc. (260nm)
enlaces conjugados
Efecto hipercrómico
Doble hélice (apilamiento y puentes de H)
Efecto hipocrómico
Representación grafica de la variación de la viscosidad o de A260 frente a la Temp.
Sigmoidal
cambio brusco
Fuerzas cooperativas
Mecanismo cremallera
Temperatura de fusión (Tm)
Temperatura intermedia de la
transición (50% de desnaturalización)
• Composición de bases
Contenido G+C
Mayor estabilidad
• pH
• Concentración de formamida
• Longitud de las cadenas
• Bases desapareadas
1% “mismatching” reduce 1º C
• Fuerza iónica (concentración salina)
Efecto de apantallamiento
A mayor fuerza iónica del medio, mayor es la Tm
Curvas de desnaturalización:
significado practico
 Relación entre la Tm y el contenido G/C
o A/T
Curvas de desnaturalización
 Reversión de las condiciones de desnaturalización
1. Lenta: depende del encuentro aleatorio de dos secuencias
complementarias
 Etapas
Velocidad
Pequeñas zonas de dúplex
Dependencia de la concentración (Cot)
2. Rápida: apareamiento del resto de las bases
Velocidad
Independencia de la concentración
Hibridacion de Ac.
Nucleicos
La renaturalización depende solo de la complementariedad de las secuencias
de las hebras.
Mezclas de molec.desnat. de ADN
DNAs híbridos doble hebra.
La formación de Moléculas dúplex de ADN de distinto origen recibe el nombre
de hibridación.
Si cadenas diferentes de Ac. Nucleicos hibridan entre si, indica que los
organismos de donde proceden comparten un cierto grado de herencia
evolutiva común.
Mayor grado de hibridación, mayor conexión evolutiva entre especies.
Ensayo de Hibridación
 Principio básico : gran especificidad de la interacción entre bases
complementarias
Elementos básicos:
* Secuencia diana
* Sonda marcada
Ensayo de Hibridación
 Objetivo básico: Identificación de una secuencia en una matriz compleja
Secuencia diana (target)
Exceso
 Requerimientos
Cortes con enzimas de restricción
No necesario para ARN
• Oligonucleótido
Sonda (probe)
• Secuencia conocida y
complementaria al target
• Marcada (isótopos radiactivos,
flurocromos, color)
• Búsqueda de genes relacionados pero no idénticos
 Utilidades
• Detectar secuencias en poca cantidad (sensibilidad)
• Encontrar un gen en un organismo con genoma no
secuenciado
Rigor de la Hibridación:
stringency
o Grado de especificidad en el apareamiento conseguido en los híbridos
Apareamiento total. Mejora la especificidad
Rigor alto
Apareamientos incompletos (mismatching)
Desventaja: Puede impedir la unión estable
sonda-diana
Reconocimiento de secuencias homólogas
Rigor bajo
Desventaja: apareamientos inespecificos
e intramoleculares. Falsos positivos
Rigor de la Hibridación:
stringency
 Temperatura
 Concentración salina
 Concentración de
formamida, urea, etc.
Rigor alto
Aumentar temperatura
Aumentar concentración formamida
Disminuir concentración salina
Rigor bajo
Disminuir temperatura
Disminuir concentración formamida
Aumentar concentración salina
Métodos de Ensayos de
Hibridación
Clasificación:
Hibridación en Fase Liquida
. Dot-blot y Slot-blot
Hibridación en soporte sólido . Hibridación Southern
o Southern blot
. Hibridación Northern
o Northern blot.
Hibridación in situ
Hibridación en Fase Liquida
Hibridación en Fase Sólida
 Esquema general:
Hibridación en Fase Sólida
Dot-Blot y Slot- Blot
Hibridación en Fase Sólida
Southern Blot
Hibridación en Fase Sólida
Experimento Southern
Hibridación in Situ
 Hibridación in Situ Tisular
Cortes de tejido
Células intactas
Núcleos aislados
Hibridación in Situ
Cromosómica
Hibridación in situ
por fluorescencia o
FISH
Técnicas Relacionadas