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El procesamiento o maduración del pre ARNm (capping,
splicing, cola poly-A) es un evento co-transcripcional.
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Dos mecanismos por los cuales la transcripción afecta al
splicing:
• Modelo de reclutamiento: facotres se asocian al
complejo de transcripción y regulan la elección de
empalme.
• Modelo cinético: la velocidad de elongación de la ARN
Pol II influye sobre el sitio de elección de empalme.
La estructura cromatínica posiblemente juegue un rol
importante en los efectos de la transcripción sobre el splicing.
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Modificaciones de histonas pueden influir sobre el
reclutamiento de factores de splicing hacia los loci de
transcripción.
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Marcas epigenéticas (modificación de histonas) regulan las
propiedades del templado y la transcripción, que a su vez
podrían influir sobre el splicing.
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Conformación restrictiva de la cromatina intragénica
disminuye la elongación de la pol II, sin afectar la iniciación.
El SN constituye un contexto fisiológico apropiado para la
búsqueda de splicing regulado por estructura cromatínica.
Un estímulo que regula el splicing alternativo es la
despolarización neuronal provocada por altas concentraciones
de potasio extracelular.
NCAM:
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glicoproteína inegral de membrana. Promueve adhesión cell-cell,
está implicado en formación de neuritas, plasticidad sináptica,
aprendizaje y memoria.
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cromosoma 8 de ratón,19 exones.
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Splicing alternativo de E18:
 NCAM140 (no incluye E18): abundante en precursores
neuronales.
 NCAM180 (incluye E18): aumenta durante diferenciación
neuronal.
¿Podría el splicing de E18 NCAM estar modulado por la
actividad neuronal?
¿Podría dicha modulación estar relacionada con la calidad
transcripcional y la estructura cromatínica de ncam?
Desarrollo
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Células N2a tratadas con concentraciones crecientes de KCl
extracelular (0, 40, 60 mM) durante 16 hs.
Extracción de ARN.
Evaluación del splicing mediante PCR en tiempo real.
Despol con KCl 40 o 60 mM
induce E18 skipping.
Reversión con 20 hs de
medio normal .
En fibronectina, el splicing
del exón EDI no es afectado
por tratamiento con KCl.
(Efecto gen específico)
•Neuronas de hipocampo de embrión de rata tratadas con
concentraciones crecientes de KCl extracelular.
Incubación con40 mM KCl durante 20 hs
produce resultados similares a células N2a
Actinomicina D (inhibidor de la transcripción)
suprime el efecto de la despolarización sobre el
skipping de E18.
Cicloeximida (inhibidor de síntesis proteica) no
suprime el efecto de la despolarización sobre el
skipping de E18.
Para descartar cambios en la actividad de factores reguladores de
splicing mediados por fosforilación, se trataron células con KN93
(inhibidor de CaMKIV)
Suprime comletamente la regulación del
splicing de E21 NMDA R.
En ausencia de CHX suprime paricalmente el
efecto de la despolarización en E18 NCAM.
En presencia de CHX no supreime.
En la regulación del splicing en NCAM
existe un mecanismo alternativo a
CaMKIV.
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Transfección de células N2a con:
◦ Minigen reportero para el splicing alternativo.
◦ Plasmido que expresa Pol II mutante slow y resistente a aamanitina (inhibidor de pol II).
Transcripción por pol II slow
aunmenta la inclusión de E18
NCAM.
Modelo cinético
Para evaluar si el splicing de E18 está modulado por cambios en
patrones de acetilación de H:
•Western Blot: acetilación global de H3 y H4.
Aumento en acetilación de
H3 y H4.
Reversión mediante
incubación con medio normal.
 ChIP: Ac anti-histonas acetiladas y primers distribuidos a lo
largo del gen.
En células no despolarizadas hay bajo nivel
de acetilación en H3K9 entre exones 17
y19.
C
En células despolarizadas aumenta la
acetilación en H3K9 entre exones 17 y19.
No se encontro aunemtno en acetilación de H4
Ensayo de accesibilidad con endonucleasa de restricción MspI.
En céls. despolarizadas aumenta la accesibilidad a
la digestión por Msp I en E18.
Previo tratamiento con TSA (inhib de H
desacetilazas) aumenta accesibilidad en E18 pero
el promotor no muestra cambios.
Modo indirecto de medir la procesividad de pol II es medir la
abundancia de pre-RNAm distal vs proximal en una región dada.
Aumento en la proporción D/P para
intrones 17 y 18.
Con TSA (inhib de H
desacetilazas) aumenta la
proporción D/P para intrón 16.
La no inclusión de E18 estaría causado por una apertura local de la
cromatina.
La inducción de la acetilación
y apertura cromatínica con
TSA imita el efecto de la
despolarización.
Conclusión
Modelo de regulación del splicing alternativo de E18 NCAM
inducido por excitación neuronal