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El procesamiento o maduración del pre ARNm (capping, splicing, cola poly-A) es un evento co-transcripcional. Dos mecanismos por los cuales la transcripción afecta al splicing: • Modelo de reclutamiento: facotres se asocian al complejo de transcripción y regulan la elección de empalme. • Modelo cinético: la velocidad de elongación de la ARN Pol II influye sobre el sitio de elección de empalme. La estructura cromatínica posiblemente juegue un rol importante en los efectos de la transcripción sobre el splicing. Modificaciones de histonas pueden influir sobre el reclutamiento de factores de splicing hacia los loci de transcripción. Marcas epigenéticas (modificación de histonas) regulan las propiedades del templado y la transcripción, que a su vez podrían influir sobre el splicing. Conformación restrictiva de la cromatina intragénica disminuye la elongación de la pol II, sin afectar la iniciación. El SN constituye un contexto fisiológico apropiado para la búsqueda de splicing regulado por estructura cromatínica. Un estímulo que regula el splicing alternativo es la despolarización neuronal provocada por altas concentraciones de potasio extracelular. NCAM: glicoproteína inegral de membrana. Promueve adhesión cell-cell, está implicado en formación de neuritas, plasticidad sináptica, aprendizaje y memoria. cromosoma 8 de ratón,19 exones. Splicing alternativo de E18: NCAM140 (no incluye E18): abundante en precursores neuronales. NCAM180 (incluye E18): aumenta durante diferenciación neuronal. ¿Podría el splicing de E18 NCAM estar modulado por la actividad neuronal? ¿Podría dicha modulación estar relacionada con la calidad transcripcional y la estructura cromatínica de ncam? Desarrollo Células N2a tratadas con concentraciones crecientes de KCl extracelular (0, 40, 60 mM) durante 16 hs. Extracción de ARN. Evaluación del splicing mediante PCR en tiempo real. Despol con KCl 40 o 60 mM induce E18 skipping. Reversión con 20 hs de medio normal . En fibronectina, el splicing del exón EDI no es afectado por tratamiento con KCl. (Efecto gen específico) •Neuronas de hipocampo de embrión de rata tratadas con concentraciones crecientes de KCl extracelular. Incubación con40 mM KCl durante 20 hs produce resultados similares a células N2a Actinomicina D (inhibidor de la transcripción) suprime el efecto de la despolarización sobre el skipping de E18. Cicloeximida (inhibidor de síntesis proteica) no suprime el efecto de la despolarización sobre el skipping de E18. Para descartar cambios en la actividad de factores reguladores de splicing mediados por fosforilación, se trataron células con KN93 (inhibidor de CaMKIV) Suprime comletamente la regulación del splicing de E21 NMDA R. En ausencia de CHX suprime paricalmente el efecto de la despolarización en E18 NCAM. En presencia de CHX no supreime. En la regulación del splicing en NCAM existe un mecanismo alternativo a CaMKIV. Transfección de células N2a con: ◦ Minigen reportero para el splicing alternativo. ◦ Plasmido que expresa Pol II mutante slow y resistente a aamanitina (inhibidor de pol II). Transcripción por pol II slow aunmenta la inclusión de E18 NCAM. Modelo cinético Para evaluar si el splicing de E18 está modulado por cambios en patrones de acetilación de H: •Western Blot: acetilación global de H3 y H4. Aumento en acetilación de H3 y H4. Reversión mediante incubación con medio normal. ChIP: Ac anti-histonas acetiladas y primers distribuidos a lo largo del gen. En células no despolarizadas hay bajo nivel de acetilación en H3K9 entre exones 17 y19. C En células despolarizadas aumenta la acetilación en H3K9 entre exones 17 y19. No se encontro aunemtno en acetilación de H4 Ensayo de accesibilidad con endonucleasa de restricción MspI. En céls. despolarizadas aumenta la accesibilidad a la digestión por Msp I en E18. Previo tratamiento con TSA (inhib de H desacetilazas) aumenta accesibilidad en E18 pero el promotor no muestra cambios. Modo indirecto de medir la procesividad de pol II es medir la abundancia de pre-RNAm distal vs proximal en una región dada. Aumento en la proporción D/P para intrones 17 y 18. Con TSA (inhib de H desacetilazas) aumenta la proporción D/P para intrón 16. La no inclusión de E18 estaría causado por una apertura local de la cromatina. La inducción de la acetilación y apertura cromatínica con TSA imita el efecto de la despolarización. Conclusión Modelo de regulación del splicing alternativo de E18 NCAM inducido por excitación neuronal