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GENETICA FUNCIONAL Estudio de la expresión de genomas completos GENETICA FUNCIONAL Bibliografía: Nature Genetics January 1999 Vol. 21, Supplement The Chipping Forecast GENETICA FUNCIONAL 1) El entendimiento de los sistemas biológicos constituidos por miles de genes requiere la organización de las partes según sus propiedades: + Similaridad de secuencia de DNA en las regiones codificantes y reguladoras + Variaciones polimórficas entre especies y subgrupos + Tiempo y lugar de expresión de los RNAs en el desarrollo, en respuesta a situaciones fisiológicas y/o patológicas. + Localización subcelular de los productos génicos. 2) Este entendimiento precisa el desarrollo de técnicas de "visión global" de los procesos biológicos: estimación simultanea de todos los componentes. + DNA chips (o DNA microarrays) + Serial Analysis of Gene Expresion (SAGE) + Differential Display (Expresión diferencial). 3) Estas técnicas permiten estudiar en paralelo los niveles de expresión de muchos genes y generan información estática (donde se expresa un gen) y dinámica (como se relaciona la expresión de unos genes con otros). DNA Chips o DNA Microarrays 1) Evolución histórica: + Técnica de Shouthern: "Las moléculas de ácido nucleico marcadas de forma apropiada puede usarse para extraer información de muestras de de ácidos nucleicos fijadas a un soporte sólido": Técnicas de Shouthern, Northern, dot-blot, Slot-blot, etc. + Fijación de clones individuales de forma ordenada en filtros para localizar los clones deseados e investigar patrones de expresión de genes. 2) Innovaciones clave: A) Utilización de soportes sólidos no-porosos, que permiten la miniaturización y la detección fluorescente. + Pueden inmovilizarse de forma automática hasta 10.000 cDNAs en un soporte microscópico e hibridarlo con sondas marcadas. B) Desarrollo de métodos de síntesis in situ y a alta densidad, de oligonucleótidos en dichas superficies. + Mediante técnicas fotolitográficas: matrices con 400.000 oligonucleótidos distintos cada uno confinado en una región de 20 µm2 + Mediante la colocación in situ de los reactivos de síntesis por dispositivos similares los utilizados en las impresoras de chorro de tinta. 3) Usos propuestos: A) Análisis de niveles de expresión de RNAs. + cDNA arrays: Producidas por fijación de productos de PCR (0.6 a 2.4 Kb) que representan genes específicos. +Oligonucleotide arrays: Idem pero por síntesis in situ de oligonucleótidos B) Análisis de variantes polimórficas en DNA y nuevas mutaciones (SNPs- Single Nucleotide Polymorfisms). + Oligonucleotide arrays: Para secuenciación en paralelo. Affymetrix Chip de vidrio cDNA microarray schema Impresión o “espoteo” • Oligos , cDNA o fragmentos de PCR depositados sobre una superficie de vidrio Pen microarray robot Pen microarray robot Estación automática de hibridación Modelo de DNA array Light directed oligonucleotide synthesis Light directed oligonucleotide synthesis Para ver es ta p elícula , de be d ispo ner d e QuickTime™ y de u n de sco mpres or An imation. Para ve r esta pe lícula, deb e dis pone r de Qu ickTim e™ y de un descomp resor Ci nepa k. 40,000 genes en una única matriz Usos propuestos para los DNA Chips o DNA Microarrays A) Análisis de niveles de expresión de RNAs. + cDNA o oligonucleotide arrays: Producidas por fijación de productos de PCR (0.6 a 2.4 Kb) que representan genes específicos. B) Secuenciación + Oligonucleotide arrays C) Genotipado + Oligonucleotide arrays cDNA microarray Bacteria grown in culture Label cDNA from bacteria with red Cy3 dye Bacteria from sit of infection. Label cDNA from bacteria with green Cy5 dye co-hybridization of cDNAs to DNA microarray RNA binds to corresponding gene Blank-not expressed Yellow- expressed in Both, culture and infection Green- expressed in infection only Red- expressed in culture only Simulación de detección Para ver esta película, debe disponer de QuickTime™ y de un descompresor Animation. An hybridized microarray cDNA Microarrays Quantitation cDNA Microarrays Detection Limits Estrategias de secuenciación con chips de DNA Oligonucleótidos utilizados en secuenciación por ganancia de señal Sequence analysis arrays Secuenciación y genotipado Secuenciación y genotipado Genotipado Matríz con 120.000 sondas diseñada para genotipar 3.000 loci bialélicos SAGE Serial Analysis of Gene Expression SAGE • Una secuencia de nucleótidos corta (tag) de 9 o 10 pares de bases contiene suficiente información para identificar un transcrito. AAAAA TTTTT AAAAA TTTTT GTAC GTAC Cleave with anchoring enzyme (AE) Bind to streptavidin beads AAAAA TTTTT AAAAA TTTTT AE is Nia III TE is Fok I Divide in half Ligate to linkers (A+B) CATG GTAC CATG GTAC AAAAA TTTTT AAAAA TTTTT CATG GTAC CATG GTAC AAAAA TTTTT AAAAA TTTTT Cleave with tagging enzyme (TE). Blunt Ends Primer A GGATGCATGXXXXXXXXX CCTACGTACXXXXXXXXX TE AE Tag Primer B GGATGCATGOOOOOOOOO CCTACGTACOOOOOOOOO TE AE Tag Ligate and amplify with primers A and B Primer A GGATGCATGXXXXXXXXX OOOOOOOOOCATGCATCC CCTACGTACXXXXXXXXX OOOOOOOOOGTACGTAGG TE AE AE TE Dit ag Primer B Cleave with anchoring enzyme Primer A GGATGCATG XXXXXXXXX OOOOOOOOOCATG CCTAC GTACXXXXXXXXX OOOOOOOOO CATCC GTACGTAGG Primer B Isolate Ditags. Concatenate and clone CATGXXXXXXXXX OOOOOOOOOCATG XXXXXXXXX OOOOOOOOOCATG GTACXXXXXXXXX OOOOOOOOOGTAC XXXXXXXXX OOOOOOOOOGTAC AE Tag 1 Tag 2 AE Tag 3 Tag 4 AE Dit ag Dit ag
