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Transcriptómica
Vida – una receta para hacer proteínas
Transcripción
DNA
Traducción
RNA
proteína
El Dogma Central de la Biología Molecular
El Dogma Central de la Biología Molecular
¿Qué es la Información Biológica?
Genoma -> Transcriptoma ->Proteoma
¿Qué es la Información Biológica?
Tres niveles básicos de información biológica:
Genoma: la información genética común a todas las
células del organismo.
Transcriptoma: la parte del genoma que se expresa en
una célula en una etapa específica de su desarrollo.
Proteoma: las proteínas que interactuan para dar a la
célula su carácter individual.
Del GENOMA estático, único
al PROTEOMA dinámico, múltiple.
La era de la genómica
La genómica se ha desarrollado como consecuencia
de los avances en Biología Molecular e Informática.
La introducción y popularización de las tecnologías
de alta procesividad ha cambiado drásticamente la
manera en que se abordan los problemas biológicos
y se prueban las hipótesis.
Genómica funcional
• El objetivo de la genómica funcional es
generar un catálogo de todos los genes y de
su función.
• Para comprender el comportamiento de los
sistemas biológicos y de los algoritmos
genéticos que permiten el funcionamiento
celular y el desarrollo de los organismos.
Genómica funcional
• La genómica funcional engloba el estudio del:
• Transcriptoma: conjunto completo de
transcritos.
• Proteoma: conjunto de proteínas codificadas
por un genoma.
• Interactoma: interacción de estos productos.
Genómica funcional
• Planteamiento clásico:
• Dirigido por una hipótesis.
• Limitado el número de genes estudiados.
• Planteamiento genómico:
• No hay hipótesis de partida.
• Información sobre miles de genes.
El paradigma pre-genómico
Genes en el
DNA...
…codifican
proteínas...
>protein kunase
acctgttgatggcgacagggactgtatgctgatct
atgctgatgcatgcatgctgactactgatgtgggg
gctattgacttgatgtctatc....
…producen el
fenotipo final
Del genotipo al
fenotipo
…cuya estructura
influye en la función...
…además el
ambiente...
La visión post-genómica
¿Quién?
Secuenciación
genoma
Literatura,
bases de datos
Espectrometría de masas
para complejos proteícos
¿Qué
sabemos?
¿Y quién más?
SNPs
Microarrays
de DNA
¿Donde, cómo y cuanto?
¿En qué manera?
Transcriptoma
Estudio de los perfiles de expresión de todos
los genes presentes en el genoma.
El método más utilizado es el de microarrays de DNA,
que permite el análisis simultaneo de la expresión de
miles de genes.
Transcripción
DNA
GTAATCCTC
| | | | | | | | |
CATTAGGAG
RNA
polimerasa
mRNA
G
A
A
U
C
C
U
Regulación de la expresión génica
• Varios niveles de regulación: transcripción,
maduración, transporte al citoplasma,
degradación, traducción, post-traducción.
• Los genes no actúan de forma aislada.
• Existen redes de interacción:
• Física (directa o indirecta).
• Funcional.
Sistemas de detección de la expresión génica
• Pasado: técnicas tradicionales para medir la
expresión génica, como Northern y RT-PCR.
• Desarrollo tecnológico:
• Expressed Sequenced Tags (ESTs).
• Serial analysis gene expression (SAGE).
• Suppression substractive hybridization (SSH).
• Microarrays de DNA.
Cambio de escala: del gen al genoma
Cambio de escala: del gen al genoma
Tecnicas genómicas de alta procesividad
• Independientes de conocimiento previo:
• ESTs
• SAGE
• SSH
• Dependientes de conocimiento previo:
• Microarrays de DNA
ESTs
(Expressed Sequenced Tags)
• Generación de colecciones de ESTs
(etiquetas de secuencia expresadas).
• La complejidad de los genomas eucariotas
hace aconsejable no abordar inicialmente el
estudio del genoma completo.
• Es preferible estudiar aquellos genes que se
están expresando en un momento
determinado de la vida del organismo.
ESTs
ESTs
• Genoteca de cDNA: colección de fragmentos
de DNA clonados que representan el conjunto
de genes que se están expresando en un
órgano o tejido determinado, o bajo una
situación particular o momento de desarrollo.
• Las genotecas de cDNA se secuencian de
forma masiva para generar miles de
secuencias parciales o ESTs de 200-500 bp.
ESTs
ESTs
• Las diferencias en la expresión de genes
pueden ser identificadas considerando el
número de veces en que aparece
representada una EST particular.
• Las ESTs por su propia naturaleza, son
incompletas y, hasta cierto punto, imprecisas.
• Las ESTs también suelen ser suficientes
para la identificación de los genes mediante
comparación con las bases de datos.
Tecnología SAGE
(Serial Analysis Gene Expression)
• Versión acelerada de la secuenciación de
ESTs.
• Un segmento corto procedente de un mRNA
(etiqueta SAGE) es suficiente para identificar
inequívocamente a un gen completo.
• La etiqueta corta tiene que estar ubicada en
una posición definida dentro de la secuencia
del mRNA.
Tecnología SAGE
• Generación de etiquetas SAGE (Tags) de
secuencias (10-14 bases).
• Ligación de las etiquetas SAGE para obtener
concatémeros que pueden ser clonados y
secuenciados.
• Comparación de los datos de secuencia para
determinar diferencias en la expresión de los
genes.
Tecnología SAGE
Tecnología SAGE
Tecnología SAGE
Tecnología SAGE: Ventajas
• Principalmente los ESTs brindan información
de secuencia, mientras que el SAGE provee
datos cuantitativos describiendo la
abundancia de transcritos.
• Determina el nivel de expresión para cada
gen, y contribuye al descubrimiento de
nuevos genes.
• Muy buena correlación con la abundancia de
RNA mensajero en la célula.
Tecnología SAGE: Problemas
• Muy laborioso, laboratorios especializados y
complejidad análisis de datos.
• Problemas técnicos:
• Digestión incompleta con la enzima
que genera extremos cohesivos.
• Problemas con la secuenciación
masiva.
Tecnología SSH
Tecnología SSH
Microarrays de DNA
Microarrays de DNA
• Los microarrays de DNA surgen de la
necesidad de analizar la cantidad de
información procedente de los grandes
proyectos de secuenciación de genomas.
• Permiten elaborar mapas finos de
transcripción y proporcionan información
indirecta de los niveles de proteínas.
Microarrays de DNA
• El análisis de microarrays de DNA es una nueva
tecnología que permite estudiar simultáneamente la
expresión de miles de genes y analizar su expresión
bajo distintas condiciones experimentales.
• Los microarrays de DNA constan de miles de
conjuntos ordenados de moléculas de DNA de
secuencia conocida depositados en un soporte sólido
(~ 2 cm2) como cristal, nylon o silicio.
• Cada combinación (gen/muestra) se localiza de forma
inequívoca en un punto del microarray.
Microarrays de DNA
• Los microarrays de DNA permiten la medida
simultánea de los niveles de expresión de miles de
genes (sondas) en un solo experimento de
hibridación con una mezcla compleja de DNA o RNA
(dianas).
• Sondas: secuencias de DNA conocidas
(oligonucleótidos o productos de PCR) inmovilizadas
ordenadamente sobre una superficie sólida.
• Dianas: muestra problema de DNA o RNA marcada
cuya abundancia será determinada por hibridación.
Microarrays de DNA - El concepto
Medir el nivel de transcritos (mRNA) de un gran número
de genes simultáneamente para determinar que genes
se están expresando en la célula.
CELL
RNA
Microarrays de DNA – El objetivo
• El objetivo de los experimentos con microarrays de
DNA es comparar la expresión de múltiples genes
(transcripción) en distintas condiciones:
• Momentos distintos del tiempo
• Tejidos distintos
• Tejidos sanos o enfermos (p.e. Tumores)
• Se basan en tecnologías conocidas como la
hibridación y la fluorescencia.
Microarrays de DNA - Hibridación
A
T
A T
G
C
G C
C
G
C G
A
T
A T
C
G
C G
T
A
T A
G
C
G C
T
A
T A
A
T
A T
Microarrays de DNA - Hibridación
Mediante hibridación, pueden detectar DNA o RNA:
Si el DNA o RNA hibridado
está marcado
fluorescentemente puede ser
cuantificado mediante
escaneado del chip de DNA.
Microarrays de DNA – Sondas
• Cada sonda del microarray de DNA está diseñada
para unirse a un gen de forma específica.
• Diseño de sondas específicas:
• Especificidad de secuencia.
• Tms homogéneas.
• Sin estructuras secundarias.
• Cada sonda está dispuesta de forma ordenada sobre
el microarray de DNA.
Microarrays de DNA – El proceso
gen
mRNA
Sondas de DNA
específicas de gen
cDNA marcado
Microarrays de DNA – El resultado
• Los microarrays de DNA están formados por 100 - 1
millón de sondas de DNA sobre una superficie de
1 cm por 1 cm (chip de DNA).
• Los resultados de microarrays de DNA se basan en el
concepto de “culpable por asociación”.
• Genes que son co-regulados (patrón similar de
comportamiento) es probable que estén
funcionalmente relacionados formando parte del
mismo proceso biológico.
Microarrays de DNA – El reto
• Los microarrays de DNA son una revolución por su
capacidad de realizar experimentos inconcebibles
hasta hace poco tiempo.
• Los nuevos chips de DNA podrán contener (y por
tanto estudiar) el genoma humano en 2 cm2.
• Esto genera cantidades ingentes de datos que deben
ser almacenadas, procesadas y analizadas:
- Al tratarse de una nueva técnica la mayor parte
de métodos, protocólos o estándares se están
aún definiendo.
El primer Microarray de DNA
• 45 Genes de Arabidopsis y 3 genes control:
total 48 señales.
•
Schena et al., (1995). Quantitative monitoring of gene expression
patterns with a complementary DNA microarray. Science 270, 467-470.
Microarrays de DNA – Experimento básico
• Un experimento básico de microarrays de DNA
consiste en:
1- Diseño y fabricación del microarray.
2- Preparación de la muestra e hibridación.
3- Escaneo del microarray.
4- Análisis de imagen.
5- Análisis de los resultados.
Microarrays de DNA
PREGUNTA
Diseño Experimental
Diseño Array
Diseño Sonda
Preparación Muestra
Hibridación
Análisis de Imagen
Preprocesamiento de datos
Normalización
Análisis Estadístico
Análisis Avanzado de Datos
Extracción de Genes Relevantes
RESPUESTA
Compra Chip/Array
Microarrays de DNA – Experimento básico
Diseño y fabricación
Diseño y fabricación
• La primera fase del diseño del microarray de DNA
consiste en la selección de los genes que se desean
incorporar al experimento.
• Las secuencias necesarias pueden obtenerse, por
ejemplo, de una base de datos de ESTs.
• Puede haber problemas en la identificación de las
secuencias :
• Errores de secuenciación
• Splicing alternativo
• Contaminación
Diseño y fabricación - Sondas
• Una vez seleccionados los genes se realizan
múltiples copias de cada uno mediante PCR, y los
productos (sondas) se depositan en el sustrato.
• Tipos de sondas:
• Genotecas de cDNA (Stanford microarrays)
• Oligonucleótidos (Affymetrix)
• El soporte sólido (sustrato) del microarray suele ser
cristal, y también membranas de nylon o plástico.
Diseño y fabricación – Adhesión sondas
• La adhesión de las sondas sobre el sustrato puede
hacerse mediante diversas técnicas:
• Impresión mecánica (capilaridad) o
microinyección (Ink-jet) → Stanford microarrays
• Fotolitografía
→ Affymetrix
• Existen dos tipos de tecnologías de microarrays de DNA:
• Arrays de cDNAs: Stanford Microarrays.
• Arrays de oligonucleótidos: Affymetrix.
Preparación de la muestra
Preparación de la muestra
• Paralelamente al diseño y fabricación del microarray
que contiene los genes (sondas) cuya expresión se
desea estudiar...
• ...deben prepararse las muestras problema (dianas)
en las que se desea estudiar la expresión de estos
genes.
• Extracción de todo el mRNA de las células en las
condiciones que se desea estudiar, y posterior
marcaje del mRNA.
Preparación de la muestra
1. Diseño experimental
¿Pregunta?
¿Réplicas?
mutante
silvestre
2. Realizar experimento
3. Precipitar RNA
4. Marcaje RNA
¿Eucariota/procariota?
¿Pared celular?
¿Amplificación?
¿Directo o indirecto?
¿Tipo de marcaje?
Hibridación
Hibridación
• Una vez preparadas y marcadas las muestras
problema (dianas) se depositan sobre las sondas en
el microarray de DNA.
• Esto hará que los cDNAs o cRNAs de las muestras
problema se puedan hibridar con los de cada gen
contenido en las sondas del microarray de DNA.
• La hibridación tendrá lugar en un grado proporcional
a la expresión del gen de cada sonda en cada
muestra problema.
Hibridación
• En arrays de cDNA las muestras problema se juntan
y se hibridan en un único microarray.
• En arrays de oligonucleótidos las muestras se
hibridan por separado en dos microarrays idénticos.
• Tras la hibridación, el microarray se lava para
eliminar el material que no se ha hibridado.
• La intensidad de la señal de hibridación resultante es
proporcional a la cantidad de mRNA que corresponde
a esa secuencia en la muestra original.
Hibridación
• La detección de la hibridación es un paso clave para
determinar qué sondas se han unido a sus dianas
complementarias procedentes de la muestra.
• Las principales técnicas de detección de la hibridación
requieren del marcaje previo de las dianas:
• cDNA: Stanford Microarrays.
• cRNA: Affymetrix.
Microarrays de DNA:
el paradigma de una técnica post-genómica
Cy5
Cy3
Arrays de cDNA
Arrays de oligonucleótidos
Microarrays de DNA - La tecnología
Stanford Microarrays
Affymetrix
(GENECHIP)
Stanford Microarrays
Stanford Microarrays – Arrays de cDNA
Portas de cristal
Impresión de las sondas
Post-procesamiento
Hibridación
Stanford microarrays – Impresión robótica
Arrays de cDNA
Stanford microarrays – Impresión robótica
Mecánica (capilaridad)
Ink-jet (microinyección)
Stanford microarrays – Impresión robótica
100-300 µm (Ø)
• Espaciado:
150-300 µm
• Número lunares I. mecánica: 250-1000 lunares/cm2
• Número lunares Ink-jet: >2500 lunares/cm2
• Tamaño del lunar:
• Cantidad DNA:
<10 pg DNA
• Tipo de substrato:
• Portas recubiertos (polylisina, silano,
superaldehido, estreptavidina)
• Membrana de nylon
Stanford microarrays – Perfiles de expresión génica
Preparar Microarray
Clones DNA
Purificar
productos
PCR
Impresión
robótica
Aislar RNA y marcar
Muestra A
Aislar
RNA
Muestra B
Aislar
RNA
Marcaje con Cy5
Marcaje con Cy3
Mezclar, hibridar sondas y analizar datos
Hibridar al
microarray
Lavar
Analizar datos
Stanford microarrays – Marcaje dianas (cDNA)
Fluorescencia (Cyanine 3 vs. Cyanine 5)
Radioactividad (3H vs. 35S o 33P vs. 14C)
Los dos marcajes más comunes son los fluorocromos
de cianina:
Cy3, absorción 554 nm, emisión 568 nm
Cy5, absorción 650 nm, emisión 672 nm
Pero también se utilizan fluorocromos Alexa:
Alexa Fluor 546
Alexa Fluor 647
Stanford microarrays – Marcaje dianas (cDNA)
Excitation
Emission
Excitation
Emission
Stanford microarrays – Marcaje dianas (cDNA)
Stanford microarrays: marcaje dianas (cDNA)
mRNA
GUAAUCCUC
Transcriptasa
Reversa
TT
cDNA
AG
GA
G
CA
TTA AG
GGAGGA
G
CCACATATTTTAT
G
G
AAAGGG A GG
T
AT
TA
TG
AA
GG
CA
ATC
T
GG
AG
GA
C
A
T
T
G
G
A
C
A
T
T
A
G
G
A
G
C
Retrotranscripción: Obtener cadenas de cDNA
complementarias al mRNA
Stanford microarrays: marcaje dianas (cDNA)
Cy5
Cy3
Stanford microarrays: el proceso
Cy5
Cy3
Stanford microarrays
Muestra B
Muestra A
mRNA
mRNA
IMPRESIÓN
SONDAS
cDNA
cDNA
Cy5-cDNA
Cy3-cDNA
Stanford microarrays – Detección marcaje
• Las muestras hibridadas sobre el microarray se
iluminan sucesivamente con luz láser de dos colores
distintos para estimular la fluorescencia de uno u otro
fluorocromo.
• La cantidad de mRNA unido a una muestra se puede
medir por la intensidad de la fluorescencia emitida al
ser iluminada por el láser del color correspondiente.
Stanford microarrays – Detección marcaje
Stanford microarrays – Detección marcaje
• Si la muestra 1 se marca con rojo y la muestra 2 con
verde se obtendra en cada punto del microarray que:
• Si el RNA de la muestra 1 abunda más que el de
la otra muestra se detecta como un punto rojo.
• Si el RNA de la muestra 2 abunda más que el de
la otra muestra se detecta como un punto verde.
• Si ambos se expresan por igual se detecta como
un punto amarillo.
• Si en ninguna de las dos muestras hay mRNA se
detecta como un punto negro.
Stanford microarrays – Detección marcaje
• Las intensidades de las
fluorescencias emitidas
permiten determinar los
niveles relativos de expresión
de los genes en ambas
muestras problema.
Stanford microarrays: problemas
Stanford microarrays: problemas
La tecnología Affymetrix
La tecnología Affymetrix - Genechip®
La tecnología Affymetrix - Sondas
• Arrays de oligonucleótidos: síntesis in situ de
oligonucleótidos de 25 bases sobre una superficie
cuadrada de cristal (1.3 cm x 1.3 cm) mediante
fotolitografía.
• 11-20 parejas de sondas específicas para cada gen.
• Sobrerepresentación extremos 3´de los mRNA.
• Seleccionadas para maximizar las temperaturas de
hibridación y la especificidad.
La tecnología Affymetrix - Sondas
• Tamaño del lunar: ~150 µm (Ø).
• Densidad: 10.000-250.000 oligonucleótidos/cm2.
• Millones de copias de cada oligonucleótido
específico (107-108 copias).
• Un array de oligonucleótidos puede contener
400.000 sondas (aproximadamente 20.000 genes).
• El array de S. cerevisae contiene 6.000 oligos, que
representan todos sus genes conocidos.
La tecnología Affymetrix - Sondas
• Para cada gen existen dos sondas: una de homología
perfecta (PM, Perfect Match) de 25 bases y otra con
una error deliberado/mutación (MM, MisMatch) en la
zona central.
• Buena calidad de datos/ baja varianza.
• La presencia de numerosos genes de control permite
una casi perfecta normalización entre diferentes
experimentos.
La tecnología Affymetrix - Sondas
Cada gen está representado por dos sondas:
PM
MM
- Perfect Match (PM)
- MisMatch (MM) – control hibridación
PM:
MM:
CGATCAATTGCACTATGTCATTTCT
CGATCAATTGCAGTATGTCATTTCT
La tecnología Affymetrix - Sondas
‹ Cada sonda tiene 25 bases
‹ 22-40 sondas por gen
‹ Parejas de sondas:
• Perfect Match (PM)
• MisMatch (MM)
La tecnología Affymetrix: síntesis sondas
Cy5
Cy3
Síntesis in situ mediante fotolitografía
La tecnología Affymetrix – Síntesis sondas
T
T
T
A
A
A
T
Mask #2
Mask #1
T
A
T
A
T T T
T
A
A
AA A
Espaciadores unidos a la superficie de
cristal con grupos protectores fotolábiles
La tecnología Affymetrix – Síntesis sondas
Luz
(desprotección)
Máscara
OOOOO
TTOOO
HO HO O O O
T–
Sustrato
Luz
(desprotección)
Máscara
C AT A T
AGCTG
T TCCG
TTCCO
TTOOO
Sustrato
C–
REPETIR
La tecnología Affymetrix: marcaje dianas (cRNA)
Cy5
Cy3
cRNA fragmentados y biotinilados aislados
después de amplificación lineal
La tecnología Affymetrix - Equipamiento
Fluidic Station
Scanner
La tecnología Affymetrix – El proceso
La tecnología Affymetrix: el proceso
Cy5
Cy3
La tecnología Affymetrix: detección marcaje
Cy5
Cy3
La tecnología Affymetrix – El experimento
La tecnología Affymetrix
Célula de hibridación
GeneChip
Diana cRNA de cadena
sencilla marcado
*
*
*
*
*
Sonda Oligonucleotido
24µm
1.28cm
Millones de copias de cada
oligonucleótido específico
(107-108 copias)
>200,000 differentes
sondas complementarias
Imágen de un Genechip hibridado
La tecnología Affymetrix
La tecnología Affymetrix – Arrays comerciales
Humano
Ratón
Rata
Arabidopsis
C. elegans
Perro
Drosophila
E. coli
P. aeruginosa
Plasmodium/Anopheles
Vitis vinifera (uva)
Xenopus laevis
S. cerevisiae
Pez cebra
Resumen
Microarrays de DNA
Microarrays de DNA - Comparativa
Stanford microarrays:
Flexible, también especies sin secuenciar
Requiere menor presupuesto
Calidad de datos: media-alta
Affymetrix:
No flexible, sólo especies secuenciadas
Equipamiento caro
Calidad de datos: alta
Análisis de imágen
Microarrays de DNA
PREGUNTA
Diseño Experimental
Diseño Array
Diseño Sonda
Preparación Muestra
Hibridación
Análisis de Imagen
Pre-procesamiento de datos
Normalización
Análisis Estadístico
Análisis Avanzado de Datos
Extracción de Genes Relevantes
RESPUESTA
Compra Chip/Array
Análisis de imágen
• Esta nueva forma de experimentar requiere de
nuevas herramientas de análisis y visualización de
resultados.
• Cada experimento de microarrays de DNA genera
una gran cantidad de datos y es preciso realizar un
procesamiento apropiado de los mismos.
• Transformación de las imágenes en números.
Análisis de imágen
Escaneado
-Escáner Confocal
-Escáner CCD
Formatos archivos imágen
Análisis de imágen
-Localización de los puntos
-Segmentación de los puntos
-Evaluación calidad de los datos
Análisis de imágen – Escaneado
Escaneado del porta
Análisis de imágen – Escáner confocal
Microscopía confocal
Análisis de imágen – Escáner CCD
Cámara CCD
Filtro emisión
Luz blanca
Beamsplitter
Filtro excitación
Análisis de imágen – Formato archivos imágen
Los escáners generan un archivo gráfico y el formato de archivo
de imágen más común es TIFF de 16 bits.
Un archivo TIFF de 16 bits describe cada pixel en una imagen
con una intensidad entre 0 y 65535.
Normalmente dos escáners en diferentes longitudes de onda
originan dos archivos monócromos que se superponen.
COMPOSICIÓN
Canal Cy3
Canal Cy5
Análisis de imágen – Formato archivos imágen
DOS COLORES
Muestra 1 marcada en rojo (Cy5)
Muestra 2 marcada en verde (Cy3)
Rojo: gen inducido en Muestra 1
Verde: gen inducido en Muestra 2
Amarillo:-niveles similares de
expresión
Rojo/Verde: ratio de expresión
UN COLOR
La intensidad de la expresión de un
gen utilizando las sondas (PM)
(en algunos casos MM- control)
PM/MM
Los archivos gráficos generados por
el escáner se analizan mediante
diferentes programas informáticos.
Análisis de imágen – Stanford microarrays
Hígado (Cy5) / Cerebro (Cy3)
Pérfiles de expresión génica en Hígado y Cerebro
Análisis de imágen – La tecnologia Affymetrix
Affymetrix Human Genome U95A Genechip
hibridado con cerebro fetal
Análisis de imágen – Localización de los puntos
La identificación y cuantificación de las señales de hibridación (puntos)
puede realizarse de forma manual, automática y semiautomática.
Se dibuja una parrilla sobre la imagen para ayudar al programa en la
identificación de puntos individuales.
Análisis de imágen – Segmentación de los puntos
Clasificación de cada pixel en cada imagen como señal
o ruido de fondo.
Para cada punto individual obtener las medidas de:
Señal, Fondo y Calidad.
Método
Programa
Fixed circle
ScanAlyze, GenePix, QuantArray
Adaptive circle
GenePix, Dapple
Adaptive shape
Spot
Histogram method
ImaGene, QuantArray
Análisis de imágen – Segmentación de los puntos
Intensidad de los puntos: calculo de la media
de los pixel en cada punto.
Corrección del ruido de fondo: local o global.
Análisis de imágen – Evaluación calidad de los datos
La mayor parte de las irregularidades se pueden
detectar por las siguientes medidas:
Variabilidad de la intensidad
Desviación del tamaño de punto
Desviación de la circularidad
Intensidad de señal relativa al fondo
Desviación de la posición en la parrilla
En base a estas medidas, se pueden descartar puntos
irregulares.
Análisis de imágen – Evaluación calidad de los datos
Análisis de imágen – Evaluación calidad de los datos
Field Meta Row Meta Column Row Column Gene_ID
Flag Signal Mean
A
1
1
1
2
ZY030076
0
4655
463
A
1
1
1
3
ZY030066
0
15938
405
A
1
1
1
4
ZY029209
0
7441
390
A
1
1
1
5
ZY030089
0
1842
399
A
1
1
1
6
ZY030084
0
6864
401
A
1
1
1
7
ZY007003
2
471
481
A
1
1
1
8
ZY006869
0
8576
447
A
1
1
1
9
ZY007954
0
4965
405
A
1
1
1
10
ZY006866
0
2236
374
A
1
1
1
11
ZY006782
0
2088
355
A
1
1
1
12
ZY006907
0
4726
342
A
1
1
1
13
ZY006593
0
4437
338
A
1
1
1
14
ZY006850
0
917
321
Matriz de datos de expresión génica
Background Mean
Normalización
Microarrays de DNA
PREGUNTA
Diseño Experimental
Diseño Array
Diseño Sonda
Preparación Muestra
Hibridación
Análisis de Imagen
Pre-procesamiento de datos
Normalización
Análisis Estadístico
Análisis Avanzado de Datos
Extracción de Genes Relevantes
RESPUESTA
Compra Chip/Array
Normalización
• En general, los niveles de expresión de genes
individuales se miden por:
• log (R/G)
• log (PM/MM)
• En cualquier experimento biológico es esencial conocer
el grado de reproducibilidad de las medidas.
• La repetición de experimentos de microarrays es costosa.
• El factor limitante puede ser la cantidad de muestra
biológica.
Normalización
• Pre-procesamiento de datos iniciales previo al análisis
estadístico y análisis avanzado de los datos.
• Cada valor de intensidad proviene de una imagen
independiente y es necesario hacer que estos valores
sean comparables. Ajuste básico: igualar la intensidad
media de las imágenes.
• Las intensidades no son únicamente concentraciones de
mRNA, hay múltiples fuentes de variación que pueden
afectar y desviar seriamente la interpretación de los
resultados.
Normalización – Fuentes de variación
‹ Contaminación de tejidos
‹Spotting
‹ Degradación
‹Otros temas relacionados
‹ Purificación RNA
con la preparación del array
‹Corrección del fondo
‹Segmentación de la imagen
‹Eficiencia y especificidad de
hibridación
‹Efectos espaciales
‹ Transcripción reversa
‹ Eficiencia de amplificación
‹ Eficiencia de marcaje
(Cy3/Cy5)
‹ Soporte unión DNA
Normalización
A
B
(a) Después de normalización por intensidad media
(b) Después de normalización por Lowess
(c) Después de normalización teniendo en cuenta
efectos espaciales
C
Antes (izda.) y después normalización (dcha.).
(A)
BoxPlots
(B)
BoxPlots de subarrays
(C)
MA plots (ratio versus intensidad)
Análisis Estadístico
Microarrays de DNA
PREGUNTA
Diseño Experimental
Diseño Array
Diseño Sonda
Preparación Muestra
Hibridación
Análisis de Imagen
Pre-procesamiento de datos
Normalización
Análisis Estadístico
Análisis Avanzado de Datos
Extracción de Genes Relevantes
RESPUESTA
Compra Chip/Array
Análisis estadístico
• Prácticamente cualquier técnica estadística tiene
cabida en los estudios de microarrays de DNA.
• La técnica de agrupamiento de datos más popular es
el análisis de conglomerados:
• A partir de la matriz de datos de expresión
génica.
• Busca formar “grupos naturales”
(conglomerados o clusters) de genes o de
condiciones experimentales que permitan
responder las preguntas del estudio.
Análisis estadístico
• El análisis de conglomerados
permite visualizar aquellos
genes cuyos perfiles de
expresión son más similares.
• Para facilitar la visualización los
números vuelven a convertirse
en colores.
Análisis estadístico
• Otra forma usual de
representar los datos es a
través de un gráfico que
muestre como varia la
expresión del gen entre los
distintos experimentos.
Análisis de resultados
Microarrays de DNA
PREGUNTA
Diseño Experimental
Diseño Array
Diseño Sonda
Preparación Muestra
Hibridación
Análisis de Imagen
Pre-procesamiento de datos
Normalización
Análisis Estadístico
Análisis Avanzado de Datos
Extracción de Genes Relevantes
RESPUESTA
Compra Chip/Array
Análisis de resultados
• Una vez extraída la información de las imágenes hay que
analizar e interpretar los resultados.
• ¿Cómo es posible organizar, visualizar y explorar el
significado de millones de datos de expresión de miles de
genes bajo cientos de condiciones distintas?.
• La forma de analizar los datos dependerá de lo que se
desee averiguar.
Análisis de resultados
• Los patrones o perfiles de expresión génica se pueden
estudiar desde dos puntos de vista:
• A) Comparaciones enfocadas en los genes: análisis de la
expresión específica de los genes en experimentos
comparativos (p.e . Tejidos diferentes).
• B) Comparaciones enfocadas en las muestras: estudio
de las alteraciones del nivel de expresión en una
determinada situación fisiológica o patológica con el
objetivo de identificar los genes implicados.
Análisis de resultados
• A) Comparaciones enfocadas en los genes: Análisis de
los valores de inducción/represión en una serie de
experimentos comparativos.
• Esto permite la identificación de grupos de expresión,
genes con patrones de expresión correlacionados.
• Si un número de genes se inducen/reprimen de la misma
manera en varias situaciones, es probable que:
• Los genes estén regulados conjuntamente o,
• Los genes estén relacionados funcionalmente
(participan en el mismo proceso biológico).
Análisis de resultados
• B) Comparaciones enfocadas en las muestras:
Diferencias a nivel fenotípico son la causa de diferencias
a nivel molecular que, en muchos casos, pueden
detectarse midiendo los niveles de expresión génica.
• Identificación de genes implicados en procesos
biológicos o condiciones experimentales de interés
(p.e. Tratamiento hormonal, tumores, etc.).
• También se pueden identificar perfiles de expresión de
genes con capacidad de diagnóstico.
Análisis de resultados
Análisis de resultados - Aplicaciones
• Estudios de expresión diferencial de genes
• Análisis de patógenos
• Identificación de enfermedades genéticas complejas
• Detección de mutaciones y de Polimorfismos simples
de nucleótido (SNPs)
• Farmacogenómica
• Diseño y descubrimiento de fármacos
• Estudios toxicológicos
Análisis de resultados - Aplicaciones
Estudio de expresión diferencial de genes
Identificación de genes implicados en procesos biológicos de interés
Análisis de resultados - Aplicaciones
Estudio de distintos genotipos / Farmacogenómica
Respuesta a fármacos, toxicidad, predisposición desarrollo enfermedades, etc.