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Aplicaciones de la ingeniería
genética a la cría y salud
animal.
Introducción.
Bases fundamentales para la creación de
organismos modificados genéticamente (OMG).
OMG aplicados a la cría y salud animal.
Bases fundamentales de la terapia génica.
Aplicaciones en salud animal.
BIBLIOGRAFÍA
LIBROS GENERALES
- Griffiths, A.J., Gelbart, W.M., Miller, J.H. y Lewontin, R.C.
Genética Moderna, 2000.
- Strachan, T., Read, A.P. Genética Molecular Humana, 1999.
- Klug, W.S. y Cummings, M.R. Conceptos de Genética, 1998.
INTERNET
-Transgénesis en mamíferos
http://www.cnb.uam.es/~transimp/
-The Jackson Laboratory
http://www.jax.org/
-Buscador general
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
-Terapia génica.
http://www.esgt.org and http://www.asgt.org.
Animal transgénico para la
Esclerosis Lateral Amiotrófica
DE MENDEL
A LA
CLONACIÓN...
•1865-1940 Genética de la transmisión.
•1960-1975 Mecanismos de acción génica
•1975-1985 DNA recombinante
•1985-1990 Genética inversa
•1990-1995 Transgénesis y Terapia Génica
•1995-1998 Chips de ADN
•1997-1998 Clonación de un mamífero.
•2002.- Genoma Humano/Células madres
humanas.
Pero ,¿qué
necesitaremos
recordar?
Estructura de un gen
Exones
Intrones
PROMOTOR
PROTEÍNA
RNA (cDNA)
¿ Qué son los organismos
modificados genéticamente?
(Directiva 90/220/CEE)
Cualquier organismo cuyo material
genético ha sido modificado de una
manera que no se produce de
forma natural en el apareamiento
o en la recombinación natural.
La transgénesis, es decir, el
diseño de un genotipo específico
mediante la adición de DNA
exógeno a un genoma, supone una
ampliación de la mejora génética
clásica,tanto para la investigación
básica como con fines comerciales.
(Griffiths y cols, 2002)
Aplicaciones de la ingeniería
genética a la cría y salud
animal.
Bases fundamentales para la creación de
organismos modificados genéticamente (OMG).
- Qué vamos a insertar: Azar o
recombinación homóloga.
- Cómo lo vamos a insertar
OMG aplicados a la cría y salud animal.
- ¿Dónde? Y ¿Para qué?
Al azar
TRANSGÉNESIS
Recombinación
homóloga
TRANSGÉN
GEN
GENOMA
Al azar
TRANSGÉN
Concatémeros
Gen crucial
GEN
Zonas metiladas
Muerte
celular
¿TRANSGÉN?
CONSTRUCCIÓN GENÉTICA
(Normalmente plásmidos, ahora otros vectores también)
Gen de resistencia a antibióticos
(normalmente Ampicilina)
con promotores procariotas
El ADN que queremos insertar
¿De qué constará el ADN
que queremos insertar?
•Expresión
•Localización de la
expresión
•Regulación de la
expresión.
•cDNA, DNA
genómico.
•Promotor.
•Enhancer, elementos
cis y trans.
Transgén simple
Promotor
as1-antitripsina
b-lactoglobulina
humana
bovina
¿Por qué no lo pones
en la pizarra que
nos enteraremos
más?
Recombinación
homóloga
TRANSGÉN
TRANSGÉN
GEN
Para poder realizar
la recombinación
homóloga son
necesarias células
en cultivo
Términos utilizados
Knock-out: (fuera de combate)
Animal creado mediante recombinación
homóloga para evitar la expresión de
un gen.
Knock-in:
Animal creado mediante recombinación
homóloga para que un gen se exprese
bajo el promotor que deseemos.
¿De qué consta una construcción
para la recombinación homológa?
-Resistencia a antibióticos/mismo gen:
- Kanamicina (procariotas)
- Neomicina (eucariotas)
-Opcional:
- Gen marcador
- Gen de expresión.
Knock-in
Knock-out
-Zona homólogas al gen de interés.
Recombinación homóloga
GENOMA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO
p
DNA
Promotor
M
R
Gen
CONSTRUCCIÓN marcador
GENÉTICA
Resistencia
Recombinación homóloga
GENOMA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO
p
Promotor
M
R
Gen
marcador
Resistencia
DNA
CONSTRUCCIÓN
GENÉTICA
Recombinación homóloga
GENOMA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO
p
Promotor
M
R
Gen
marcador
Resistencia
DNA
CONSTRUCCIÓN
GENÉTICA
Más pizarra
TRANSGÉNESIS
AL AZAR
TRANSGÉNESIS POR
RECOMBINACIÓN
HOMÓLOGA
Directamente en el embrión
En cultivos celulares
En cultivos celulares
CULTIVOS
CELULARES
Las células modificadas
genéticamente deberán ser
introducidas posteriormente en
el embrión u óvulo
MODOS DE
INTRODUCCIÓN
DEL TRANSGEN
IN VIVO
DIRECTAMENTE EN EMBRIÓN.
REALIZABLES EN CULTIVOS CELULARES
IN VITRO
SÓLO EN CULTIVOS CELULARES
IN VIVO
•DIRECTOS
- Espermatozoides
- Biolística
- Microinyección
•INDIRECTOS
IN VITRO
SÓLO EN CULTIVOS CELULARES
IN VIVO
•DIRECTOS
- Espermatozoides
- Biolística
- Microinyección
•INDIRECTOS
IN VITRO
SÓLO EN CULTIVOS CELULARES
ESPERMATOZOIDES
Esponda, P.
C.B.I. y C.S.I.C
IN VIVO
•DIRECTOS
- Espermatozoides
- Biolística
- Microinyección
•INDIRECTOS
IN VITRO
SÓLO EN CULTIVOS CELULARES
Biolística o método de bombardeo.
Biolística o método de bombardeo.
• Partículas de tungsteno u oro
• Descarga con helio.
Características:
– Capacidad de introducción limitada.
HA SIDO MUY
UTILIZADA EN PLANTAS
IN VIVO
•DIRECTOS
- Espermatozoides
- Biolística
- Microinyección
•INDIRECTOS
IN VITRO
SÓLO EN CULTIVOS CELULARES
MICROINYECCIÓN
• Microinyección en el pronúcleo
masculino.
• Microinyección en el citoplasma
del huevo.
Añaden protección al DNA (polilisinas, etc.)
¿Qué necesitamos para
realizar la microinyección?
•Transgen
•Construcción al azar.
•Cigotos
•Animales donadores.
•Introducir el
transgén en el
cigoto
•Micromanipulador.
•Desarrollar el
embrión
• Madres receptoras
¿Como consigo los
cigotos?
•Ovulación cíclica y corta (ratón, rata).
– Machos y hembras donadoras
– Hembras receptoras y machos
vasectomizados
•Otras especies
– Tratamientos hormales en las hembras.
– Hembras donadoras y receptoras y machos.
Micromanipulador
Micromanipulador
Micromanipulador
Pronúcleo masculino
En animales
domésticos (sobre
todo en la
especie porcina)
es necesario
centrifugar el huevo
debido al vitelo.
IN VIVO
•DIRECTOS
- Espermatozoides
- Biolística
- Microinyección
- Bacterias/Virus
•INDIRECTOS
- Liposomas
- Elementos P
IN VITRO
SÓLO EN CULTIVOS CELULARES
IN VIVO
•DIRECTOS
- Espermatozoides
- Biolística
- Microinyección
- Bacterias/Virus
•INDIRECTOS
- Liposomas
- Elementos P
IN VITRO
SÓLO EN CULTIVOS CELULARES
Co-cultivo 48 horas
22ºC
DNA de
la planta
Agrobacterium
tumefaciens con
gen
de interes
Formación
de callos
Pruebas genéticas
que permitan
controlar la
inserción del gen
DNA insertado
en el genoma
Aislamiento de posibles
plantas transformadas
IN VIVO
•DIRECTOS
- Espermatozoides
- Biolística
- Microinyección
- Bacterias/Virus
•INDIRECTOS
- Liposomas
- Elementos P
IN VITRO
SÓLO EN CULTIVOS CELULARES
LIPOSOMAS
• CATIÓNICOS
– Su carga positiva reacciona con la negativa
del DNA formando un complejo.
• pH SENSIBLE O ANIÓNICO
– Mediante una desestabilización por bajo pH el
DNA entra en “núcleo del liposoma”.
IN VIVO
•DIRECTOS
- Espermatozoides
- Biolística
- Microinyección
- Retrovirus
•INDIRECTOS
- Liposomas
- Elementos P
IN VITRO
SÓLO EN CULTIVOS CELULARES
TRANSGÉNESIS DE
DROSOPHILA MEDIADO
POR ELEMENTOS P
•La microinyección clásica no funciona.
•Dos plásmidos:
• Contiene el transgén.
• Contiene el trasposón con las secuencias
repetidas que ayuda a la inserción (Elementos P)
IN VIVO
•DIRECTOS
- Espermatozoides
- Biolística
- Microinyección
- Retrovirus
•INDIRECTOS
- Liposomas
- Elementos P
IN VITRO
SÓLO EN CULTIVOS CELULARES
MÉTODOS “IN VITRO”
(Cultivos celulares)
Las células modificadas
genéticamente deberán ser
introducidas posteriormente
en el embrión u óvulo
IN VIVO
•DIRECTOS
- Espermatozoides
- Biolística
- Microinyección
- Retrovirus
•INDIRECTOS
IN VITRO
•QUÍMICOS
•FÍSICOS
- Liposomas
- Elementos P
Precipitación con
fosfato de calcio
FOSFATO DE CALCIO
• Coprecipitación de DNA y calcio (presencia
de fosfato).
• Introducción por endocitosis.
• Eficiencia de transfección 1% (max. 10%)
Características:
- Pequeña expresión del transgén.
- Introducción de varias copias.
- No hay toxicidad para las células.
IN VIVO
•DIRECTOS
- Espermatozoides
- Biolística
- Microinyección
- Bacterias/Virus
•INDIRECTOS
IN VITRO
- Liposomas
- Elementos P
•QUÍMICOS
Precipitación con
fosfato de calcio
•FÍSICOS
Electroporación
ELECTROPORACIÓN
• Introducción del transgén por poros
nucleares tras un choque eléctrico.
• Factores de eficacia: naturaleza, distancia
entre electrodos, buffer y CÉLULAS.
Características:
- Mucha muerte celular
- TENDENCIA A INTRODUCCIÓN DE UNA
SOLA COPIA. ELECCIÓN.
¿Cómo consigo un
animal adulto a
partir de células
en cultivo?
1
Células indiferenciadas
que sean capaces de colonizar
un embrión y formar
parte de su organismo,
incluidos los gametos.
DOS OPCIONES
2
Células transformadas
en indiferenciadas:
CLONACIÓN
Células ES o indiferenciadas
SÓLO AISLADAS EN RATÓN
Color negro
Color marrón
Método de agregación de mórulas-células
Color negro
Color marrón
Knock-out
Knock-in
NUMEROSOS INTENTOS PERO......
Las células ES no se
han aislado en otras
especies animales
(Experiencias realizadas
en peces)
OTROS CULTIVOS CELULARES:
Fibroblastos, Glándula
mamaria, etc.
Clonación de células
somáticas
DOLLY
DOLLY
G0 :
- Baja la transcripción.
- Baja la traducción.
- Condensación de la cromatina
PRODUCCIÓN DE:
Millie,
Christa,
Alexis,
Carrel y
Dotcom
245
72
5
Polejaeva, I.A. y cols. (2000)
Nature, 407, 86-90
Recombinación
homóloga
Células
“in vitro”
Clonación
IN VIVO
Al azar
Microinyección
Biolística (plantas)
IN VITRO
MICROINYECCIÓN
Ratón
Conejo Porcino Ovino
Bovino
Eficacia
60%
50%
40%
40%
20%
Animales
10
15
20
40
80
Tiempo
(meses)
5
8
22
29
51
(Montoliu, 1999)
IN VIVO
Al azar
Microinyección
Biolística (plantas)
IN VITRO
Recombinación
homóloga
Electroporación
Células ES y clonación
Sabemos qué es...
Sabemos cómo se hace...
APLICACIONES
PRIMER RATÓN
TRANSGÉNICO
Nature, 16, 611-615
PALMITER y cols. (1982)
Promotor
Metalotionina I
Gen de la Hormona
del Crecimiento
Medline: “transgenic animals”
3.982 publicaciones (26-9-2000)
1. Estudios en investigación básica
- Funcionamiento de genes
- Funcionamiento promotores
2. Producción Animal/Nuevos alimentos
- Alimentos transgénicos
Cambio cuantitativo
Cambio cualitativo
- “Biotecnología de corral”
3. Sanidad
- Animales modelos de enfermedades
- Xenotrasplantes
- Terapia Génica Germinal.
1. Estudios en investigación básica
- Funcionamiento de genes
- Funcionamiento promotores
2. Producción Animal/Nuevos alimentos
- Alimentos transgénicos
Cambio cuantitativo
Cambio cualitativo
- “Biotecnología de corral”
3. Sanidad
- Animales modelos de enfermedades
- Xenotrasplantes
- Terapia Génica Germinal.
1. Estudios en investigación básica.
REINO ANIMAL
1. Estudios en investigación básica.
Funcionamiento de genes
- Muchos estudios realizados.
- Más interesante la recombinación homóloga
- Animal de elección es el ratón (menor coste
en tiempo y en dinero)
Ejemplo:
Un animal Knock-out para una determinada enzima,
que nos permita conocer la función de la misma.
Un animal knock-in con marcadores para conocer
la expresión durante la gestación.
1. Estudios en investigación básica.
Estudio de promotores, enhancer o
cualquier elemento regulador.
- Muchos estudios realizados.
- Transgénicos clásicos fusionados a un marcador
- Animal de elección es el ratón (menor coste
en tiempo y en dinero)
Ejemplo:
Un transgénico con una zona del promotor de
una enzima fusionado a la enzima b-galactosidasa
1. Estudios en investigación básica
- Funcionamiento de genes
- Funcionamiento promotores
2. Producción Animal/Nuevos alimentos
- Alimentos transgénicos
Cambio cuantitativo
Cambio cualitativo
- “Biotecnología de corral”
3. Sanidad
- Animales modelos de enfermedades
- Xenotrasplantes
- Terapia Génica Germinal.
2. Producción Animal/Nuevos alimentos
Modificaciones cuantitativas
- Muchos intentos realizados.
- Transgénicos clásicos.
- Animales y plantas usados en alimentación.
2. Producción Animal/Nuevos
alimentos
REINO VEGETAL
LA REVOLUCIÓN AZUL!!!!
Ejemplo (ya creado):
Un Salmón (Aqua Bounty Farms):
- Promotor: AFP (proteína anticongelación)
- cDNA: Hormona del crecimiento.
2. Producción Animal/Nuevos alimentos
Modificaciones cualitativas
- Transgénicos clásicos.
- Animales y plantas usados en alimentación.
Reino vegetal: la mayoría de los alimentos.
Reino animal: Proyectos de creación.
2. Producción Animal/Nuevos alimentos
Reino vegetal
- Tolerancia a los herbicidas
54%
- Resistencia a insectos (Bt)
37%
- Transgénicos
clásicos.
- Resistencia
vírica
14%
- Animales
y plantas
usados en alimentación.
- Rasgos
cualitativos
>1%
- Tomate Flavr-Savr.
- Maíz Bt.
2. Producción Animal/Nuevos alimentos
Reino vegetal
- Tomate Flavr-Savr: Primer producto
transgénico comercializado en el mundo (Mayo de
1994). Maduración retardada.
- Promotor: 35 S virus mosaico de
coliflor.
- RNA antisentido de la enzima
poligalacturonasa (actuá sobre la pectina)
2. Producción Animal/Nuevos alimentos
Reino vegetal
- Maíz Bt:Muchisima presion social.
Maíz que expresa la toxina del Bacillus
thuringiensis se une a los receptores del
tubo digestivo del insecto (taladro).
¿Qué es un alimento transgénico?
-Productos vegetales: tomate "Flavr Svr”, Maiz Bt...
- Productos de animales transgénicos:salmones, leche sin
determinadas proteínas, etc.
- Alimentos que en su preparación se utilizan sustancias
modificadas genéticamente (cuajo recombinante)
- Animales tratados con proteínas recombinantes...
- Animales alimentados con alimentos transgénicos
2. Producción Animal
Biotecnología de corral
- Transgénicos clásicos hasta ahora ya que no
existían células indiferenciadas en los animales
que nos interesan.
- Producción de proteínas de interés en sanidad.
Ejemplo (ya creado):
Tracy
(Roslin Institute - PPL Therapeutics)
TRACY
Promotor
as1-antitripsina
b-lactoglobulina
humana
ovina
Primeros ensayos en ratón:
4.3 Kb Promotor
WAP de ratón
12.5 gr./litro
Volumen/año
Coneja
Oveja
Vaca
8 litros
400 litros
10.000 l.
6.6 Kb de AAT-humano
cDNA
Obtienen microlitros
de leche
gr./año Producción vital
0.04 Kg.
2 kg.
50 kg
1 Kg.
100 kg.
toneladas
Roslin Institute-PPL Therapeutics
(lo que sabemos......)
as1-antitripsina
Fibrinógeno
Factor VII y Proteína C
Factor XI
BSSL (lipasa)
Anticuerpos humanizados
POLLY: Primer clon transgénico
Se obtuvieron 4 clones de
fibroblastos embrionarios
transfectados con:
b-lactoglobulina + Factor XI de coagulación
POLLY
MOLLY
2 no producían
la proteína
1. Estudios en investigación básica
- Funcionamiento de genes
- Funcionamiento promotores
2. Producción Animal
- Incremento de productividad
Cuantitativo
Cualitativo
- “Biotecnología de corral”
3. Sanidad
- Animales modelos de enfermedades
- Xenotrasplantes
- Terapia Génica Germinal.
Organismos modelos
C.elegans
Organismo modelo para
investigación de los mecanismos
moleculares de las enfermedades
Transgénico para el péptido b amiloide
o prenisilina, genes relacionados con Alzheimer.
Yatin y cols. Neurobiol Aging. 1999 May-Jun;20(3):325-30;
Witerburg y cols.Nature. 2000 Jul 20;406(6793):306-9.
D. Melanogaster
GENES HOX
DESARROLLO
D. Melanogaster
Expresión del gen a-sinucleína
(normal y mutantes)
Modelo de Parkinson.
Feany y Bender. Nature 2000 Mar 23;404(6776):394-8
Sobreexpresión de Sim2 (homólogo al humano)
Modelo de Sindrome de Down.
Ema y cols. Hum Mol Genet 1999 Aug;8(8):1409-15
Primates
16/01/2001
lº Primate transgénico
ANDI
Inyección en oocitos con retrovirus.
Expresión de la GFP (Green Fluorescent protein).
Producción de RNA mensajero.
Conejos
Transgénico para lipoproteina a (Lpa).
Modelo para arterioesclerosis.
Rouy y cols, J Biol Chem 1998 Jan 9;273(2):1247-5
Ratón
Especie de elección
Metodología de creación puesta a punto.
Corto intervalo generacional
Numerosos descendientes.
Ratón
- Enfermedades genéticas: Knock-out o Knock-in.
- Otras enfermedades: transgénicos clásicos
¿Cómo hago un
modelo para una
enfermedad cuya
causa sea que una
proteína no se
exprese?
Knock-out
HEMOFILIA TIPO B
WANG y cols. PNAS 94: 11563-11566, 1997.
¿Cómo hago un
modelo para una
enfermedad cuya
causa sea la
sobreexpresión de
una proteína?
Transgénico clásico
DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE
Galbiati y cols. PNAS, Vol. 97, 9689-9694, 2000.
DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE
Knock-out
HEMOFILIA TIPO B
WANG y cols. PNAS 94: 11563-11566, 1997.
¿Cómo hago un
modelo para una
enfermedad cuya
causa sea un
número de copias
de una region
repetida superior a
lo normal?
Knock-in
ENFERMEDAD DE HUNTINGTON
Lin y cols. Hum Mol Genet 2001 Jan 15;10(2):137-44
Knock-in
ENFERMEDAD DE HUNTINGTON
Lin y cols. Hum Mol Genet 2001 Jan 15;10(2):137-44
Mouse Models for Human Disease
Mouse Models for Human Disease
3. Sanidad
Xenotransplantes
Candidata la especie porcina por...
- Similitudes fisiógicas con humanos
- Alta disponibilidad
- Fácil cruzamiento.
Problema:
Combinación discordante que produce rechazo
3. Sanidad
Xenotransplantes
Transgénicos porcinos con expresión de
D.A.F (expresión en corazón):
- Proteína que inhibe la cascada del complemento
Pruebas esperanzadoras transplantando el
corazón a primates.
TERAPIA GÉNICA GERMINAL
EN ANIMALES
Transgénesis
?
Enfermedades monogénicas candidatas.