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Modificación de los genomas para su
aplicación en biotecnología
alimentaria
R. Osta
Animal transgénico para la
Esclerosis Lateral Amiotrófica
Introducción
1/68
¿ Qué son los organismos
modificados genéticamente?
(Directiva 90/220/CEE)
Cualquier organismo cuyo material
genético ha sido modificado de una
manera que no se produce de
forma natural en el apareamiento
o en la recombinación natural.
Definición
4/68
¿Qué vamos a tratar?.
- Modificación genética en
organismos unicelulares
-Modificación genética en organismos
pluricelulares.
- Aplicaciones de esta metodología
y clonación.
Indice
6/68
s
m
e
d
i
a
n
t
e
e
l
u
s
o
d
e
t
é
c
n
i
c
a
s
d
e
D
N
A
r
e
c
o
m
b
i
n
a
n
t
e
Modificación de organismos
¿Si vemos
un video?
unicelulares:
bacterias
y
levaduras.
Modificación genética en organimso unicelulares
6/68
Pero ,¿qué
necesitaremos
recordar?
Introducción
Definición
2/68
Estructura de un gen
Exones
Intrones
PROMOTOR
PROTEÍNA
Introducción
RNA (cDNA)
3/68
Al azar
TRANSGÉNESIS
Recombinación
homóloga
Tipos de transgénesis
5/68
TRANSGÉN
GEN
GENOMA
Tipos de transgénesis
6/68
Al azar
TRANSGÉN
Concatémeros
Gen crucial
GEN
Zonas metiladas
Tipos de transgénesis
6/68
Recombinación
homóloga
TRANSGÉN
TRANSGÉN
GEN
Tipos de transgénesis
¿De qué constará el ADN
que queremos insertar?
•Expresión
•Localización de la
expresión
•Regulación de la
expresión.
Transgénesis al azar
•cDNA, DNA
genómico.
•Promotor.
•Enhancer, elementos
cis y trans.
6/68
Transgén simple
Promotor
as1-antitripsina
b-lactoglobulina
humana
bovina
Transgénesis al azar
6/68
¿Por qué no lo pones
en la pizarra que
nos enteraremos
más?
Transgénesis al azar
Términos utilizados
Knock-out: (fuera de combate)
Animal creado mediante recombinación
homóloga para evitar la expresión de
un gen.
Knock-in:
Animal creado mediante recombinación
homóloga para que un gen se exprese
bajo el promotor que deseemos.
Transgénesis por recombinación homóloga
¿De qué consta una construcción para la
recombinación homológa?
-Resistencia a antibióticos/mismo gen:
- Kanamicina (procariotas)
- Neomicina (eucariotas)
-Opcional:
- Gen marcador
- Gen de expresión.
Transgénesis por recombinación homóloga
Knock-in
Knock-out
-Zona homólogas al gen de interés.
Recombinación homóloga
GENOMA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO
p
DNA
Promotor
M
R
Gen
CONSTRUCCIÓN marcador
GENÉTICA
Resistencia
Transgénesis por recombinación homóloga
Recombinación homóloga
GENOMA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO
p
Promotor
M
R
Gen
marcador
Resistencia
DNA
CONSTRUCCIÓN
GENÉTICA
Transgénesis por recombinación homóloga
Recombinación homóloga
GENOMA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO
p
Promotor
M
R
Gen
marcador
Resistencia
DNA
CONSTRUCCIÓN
GENÉTICA
Transgénesis por recombinación homóloga
MODOS DE
INTRODUCCIÓN
DEL TRANSGEN
Modos de introducción del transgen
IN VIVO
DIRECTAMENTE EN EMBRIÓN.
REALIZABLES EN CULTIVOS CELULARES
IN VITRO
SÓLO EN CULTIVOS CELULARES
Modos de introducción del transgen
IN VIVO
•DIRECTOS
- Espermatozoides
- Biolística
- Microinyección
•INDIRECTOS
IN VITRO
SÓLO EN CULTIVOS CELULARES
Modos de introducción del transgen
IN VIVO
•DIRECTOS
- Espermatozoides
- Biolística
- Microinyección
•INDIRECTOS
IN VITRO
SÓLO EN CULTIVOS CELULARES
Modos de introducción del transgen
ESPERMATOZOIDES
Esponda, P.
C.B.I. y C.S.I.C
Modos de introducción del transgen
IN VIVO
•DIRECTOS
- Espermatozoides
- Biolística
- Microinyección
•INDIRECTOS
IN VITRO
SÓLO EN CULTIVOS CELULARES
Modos de introducción del transgen
Biolística o método de bombardeo.
Modos de introducción del transgen
Biolística o método de bombardeo.
• Partículas de tungsteno u oro
• Descarga con helio.
Características:
– Capacidad de introducción limitada.
HA SIDO MUY
UTILIZADA EN PLANTAS
Modos de introducción del transgen
IN VIVO
•DIRECTOS
- Espermatozoides
- Biolística
- Microinyección
•INDIRECTOS
IN VITRO
SÓLO EN CULTIVOS CELULARES
Modos de introducción del transgen
MICROINYECCIÓN
• Microinyección en el pronúcleo
masculino.
• Microinyección en el citoplasma
del huevo.
Añaden protección al DNA (polilisinas, etc.)
Modos de introducción del transgen
¿Qué necesitamos para
realizar la microinyección?
•Transgen
•Construcción al azar.
•Cigotos
•Animales donadores.
•Introducir el
transgén en el
cigoto
•Micromanipulador.
•Desarrollar el
embrión
• Madres receptoras
Modos de introducción del transgen
¿Como consigo los
cigotos?
•Ovulación cíclica y corta (ratón, rata).
– Machos y hembras donadoras
– Hembras receptoras y machos
vasectomizados
•Otras especies
– Tratamientos hormales en las hembras.
– Hembras donadoras y receptoras y machos.
Micromanipulador
Modos de introducción del transgen
Micromanipulador
Modos de introducción del transgen
Micromanipulador
Modos de introducción del transgen
Pronúcleo masculino
Modos de introducción del transgen
En animales
domésticos (sobre
todo en la
especie porcina)
es necesario
centrifugar el huevo
debido al vitelo.
Modos de introducción del transgen
IN VIVO
•DIRECTOS
•INDIRECTOS
- Espermatozoides
- Biolística
- Microinyección
- Bacterias/Virus
- Liposomas
IN VITRO
SÓLO EN CULTIVOS CELULARES
Modos de introducción del transgen
IN VIVO
•DIRECTOS
•INDIRECTOS
- Espermatozoides
- Biolística
- Microinyección
- Bacterias/Virus
- Liposomas
IN VITRO
SÓLO EN CULTIVOS CELULARES
Modos de introducción del transgen
Co-cultivo 48 horas
22ºC
DNA de
la planta
Agrobacterium
tumefaciens con
gen
de interes
Formación
de callos
Pruebas genéticas
que permitan
controlar la
inserción del gen
DNA insertado
en el genoma
Modos de introducción del transgen
Aislamiento de posibles
plantas transformadas
IN VIVO
•DIRECTOS
•INDIRECTOS
- Espermatozoides
- Biolística
- Microinyección
- Bacterias/Virus
- Liposomas
IN VITRO
SÓLO EN CULTIVOS CELULARES
Modos de introducción del transgen
LIPOSOMAS
• CATIÓNICOS
– Su carga positiva reacciona con la negativa
del DNA formando un complejo.
• pH SENSIBLE O ANIÓNICO
– Mediante una desestabilización por bajo pH el
DNA entra en “núcleo del liposoma”.
Modos de introducción del transgen
MÉTODOS “IN VITRO”
(Cultivos celulares)
Las células modificadas
genéticamente deberán ser
introducidas posteriormente
en el embrión u óvulo
Modos de introducción del transgen
IN VIVO
•DIRECTOS
•INDIRECTOS
- Espermatozoides
- Biolística
- Microinyección
- Bacterias/Virus
- Liposomas
IN VITRO
SÓLO EN CULTIVOS CELULARES
Modos de introducción del transgen
IN VIVO
•DIRECTOS
•INDIRECTOS
IN VITRO
•QUÍMICOS
•FÍSICOS
Modos de introducción del transgen
- Espermatozoides
- Biolística
- Microinyección
- Bacterias/Virus
- Liposomas
Precipitación con
fosfato de calcio
FOSFATO DE CALCIO
• Coprecipitación de DNA y calcio (presencia
de fosfato).
• Introducción por endocitosis.
• Eficiencia de transfección 1% (max. 10%)
Características:
- Pequeña expresión del transgén.
- Introducción de varias copias.
- No hay toxicidad para las células.
Modos de introducción del transgen
IN VIVO
•DIRECTOS
•INDIRECTOS
IN VITRO
- Espermatozoides
- Biolística
- Microinyección
- Bacterias/Virus
- Liposomas
•QUÍMICOS
Precipitación con
fosfato de calcio
•FÍSICOS
Electroporación
Modos de introducción del transgen
ELECTROPORACIÓN
• Introducción del transgén por poros
nucleares tras un choque eléctrico.
• Factores de eficacia: naturaleza, distancia
entre electrodos, buffer y CÉLULAS.
Características:
- Mucha muerte celular
- Tendencia a introducir una sola copia. Método
de elección para la recombinación homóloga.
Modos de introducción del transgen
¿Cómo consigo un
animal adulto a
partir de células
en cultivo?
Modos de introducción del transgen
1
Células indiferenciadas
que sean capaces de colonizar
un embrión y formar
parte de su organismo,
incluidos los gametos.
DOS OPCIONES
2
Células transformadas
en indiferenciadas:
CLONACIÓN
Modos de introducción del transgen
Células ES o indiferenciadas
SÓLO AISLADAS EN RATÓN
Modos de introducción del transgen
NUMEROSOS INTENTOS PERO......
Las células ES no se
han aislado en otras
especies animales
(Experiencias realizadas
en peces)
Modos de introducción del transgen
OTROS CULTIVOS CELULARES:
Fibroblastos, Glándula
mamaria, etc.
Clonación de células
somáticas
Modos de introducción del transgen
DOLLY
Modos de introducción del transgen
DOLLY
G0 :
- Baja la transcripción.
- Baja la traducción.
- Condensación de la cromatina
Modos de introducción del transgen
PRODUCCIÓN DE:
Millie,
Christa,
Alexis,
Carrel y
Dotcom
245
72
Modos de introducción del transgen
5
Polejaeva, I.A. y cols. (2000)
Nature, 407, 86-90
Aplicaciones
1. Cambio de características de organismos
utilizados en la producción de alimentos
2.-Producción de sustancias terapéuticas en
- Organismos unicelulares.
- Biotecnología de corral.
3.Nuevos alimentos
- Cambio cuantitativo
- Cambio cualitativo
Aplicaciones
Aplicaciones
1. Cambio de características de organismos
utilizados en la producción de alimentos
2.-Producción de sustancias terapéuticas en
- Organismos unicelulares.
- Biotecnología de corral.
3.Nuevos alimentos
- Cambio cuantitativo
- Cambio cualitativo
Aplicaciones
Introducción del Gen LIS en levadura
viníca
Gen LIS
linalol linasa
Sintesis de linalol
Asociado a los componente de aroma afrutado y floral
Aplicaciones
Aplicaciones
1. Cambio de características de organismos
utilizados en la producción de alimentos
2.-Producción de sustancias terapéuticas en
- Organismos unicelulares.
- Biotecnología de corral.
3.Nuevos alimentos
- Cambio cuantitativo
- Cambio cualitativo
Aplicaciones
Producción de proteínas
recombinantes en organismos
unicelulares
Aplicaciones
Transformación
Crecimiento secundario
Purificación proteína
Crecimiento a gran
escala
Salida al mercado
Biotecnología de corral
- Transgénicos clásicos hasta ahora ya que no
existían células indiferenciadas en los animales
que nos interesan.
- Producción de proteínas de interés en sanidad.
Ejemplo (ya creado):
Tracy
Aplicaciones
(Roslin Institute - PPL Therapeutics)
TRACY
Promotor
as1-antitripsina
b-lactoglobulina
humana
ovina
Aplicaciones
Primeros ensayos en ratón:
4.3 Kb Promotor
WAP de ratón
12.5 gr./litro
Volumen/año
Coneja
Oveja
Vaca
Aplicaciones
8 litros
400 litros
10.000 l.
6.6 Kb de AAT-humano
cDNA
Obtienen microlitros
de leche
gr./año Producción vital
0.04 Kg.
2 kg.
50 kg
1 Kg.
100 kg.
toneladas
Roslin Institute-PPL Therapeutics
(lo que sabemos......)
as1-antitripsina
Fibrinógeno
Factor VII y Proteína C
Factor XI
BSSL (lipasa)
Anticuerpos humanizados
Aplicaciones
POLLY: Primer clon transgénico
Aplicaciones
Aplicaciones
1. Cambio de características de organismos
utilizados en la producción de alimentos
2.-Producción de sustancias terapéuticas en
- Organismos unicelulares.
- Biotecnología de corral.
3.Nuevos alimentos
- Cambio cuantitativo
- Cambio cualitativo
Aplicaciones
Producción Animal/Nuevos alimentos
Modificaciones cuantitativas
- Muchos intentos realizados.
- Transgénicos clásicos.
- Animales y plantas usados en alimentación.
Aplicaciones
Producción Animal/Nuevos
alimentos
REINO VEGETAL
Aplicaciones
LA REVOLUCIÓN AZUL!!!!
Ejemplo (ya creado):
Un Salmón (Aqua Bounty Farms):
- Promotor: AFP (proteína anticongelación)
- cDNA: Hormona del crecimiento.
Aplicaciones
Producción Animal/Nuevos alimentos
Modificaciones cualitativas
- Transgénicos clásicos.
- Animales y plantas usados en alimentación.
Reino vegetal: la mayoría de los alimentos.
Reino animal: Proyectos de creación.
Aplicaciones
Producción Animal/Nuevos alimentos
Reino vegetal
- Tolerancia a los herbicidas
54%
- Resistencia a insectos (Bt)
37%
- Transgénicos
clásicos.
- Resistencia
vírica
14%
- Animales
y plantas
usados en alimentación.
- Rasgos
cualitativos
>1%
- Tomate Flavr-Savr.
- Maíz Bt.
Aplicaciones
Producción Animal/Nuevos alimentos
Reino vegetal
- Tomate Flavr-Savr: Primer producto
transgénico comercializado en el mundo (Mayo de
1994). Maduración retardada.
- Promotor: 35 S virus mosaico de
coliflor.
- RNA antisentido de la enzima
poligalacturonasa (actuá sobre la pectina)
Aplicaciones
Producción Animal/Nuevos alimentos
Reino vegetal
- Maíz Bt:Muchisima presion social.
Maíz que expresa la toxina del Bacillus
thuringiensis se une a los receptores del
tubo digestivo del insecto (taladro).
Aplicaciones
¿Qué es un alimento transgénico?
-Productos vegetales: tomate "Flavr Svr”, Maiz Bt...
- Productos de animales transgénicos:salmones, leche sin
determinadas proteínas, etc.
- Alimentos que en su preparación se utilizan sustancias
modificadas genéticamente (cuajo recombinante)
- Animales tratados con proteínas recombinantes...
- Animales alimentados con alimentos transgénicos
Aplicaciones