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TECNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR IES JOAQUÍN TURINA SEVILLA ENDONUCLEASAS O ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Generan cortes internos en la molécula de ADN Pueden generar extremos romos o cohesivos Enzimas de Restricción Extremos cohesivos Extremos romos Clonación y uso de enzimas Separación de fragmentos Geles de Agarosa Geles de poliacrilamida CLONACIÓN PCR (reacción en cadena de polimerasa) Componentes de la reacción Polimerasa Primers dNTP’s Cloruro de magnesio Agua Buffer SOUTHERN BLOT 1) Blood sample. 2) DNA is extracted from blood cells. 3) DNA is cut into fragments by a restriction enzyme. 4) The DNA fragments are separated into bands during electrophoresis in an agarose gel. 5) The DNA band pattern in the gel is transferred to a nylon membrane. 6) Radioactive DNA probe, designed to recognise specific DNA sequences, is prepared. 7) Probe DNA binds to the specific DNA sequences on the membrane. 8) Excess DNA is washed off, but the DNA pattern is invisible at this stage. 9) X-ray film is placed next to the membrane & exposed to the radioactive DNA. 10) The developed X-ray shows the pattern of DNA bands SECUENCIACIÓN VNTR DNA fingerprinting CLONACIÓN EN ANIMALES COPY-CAT (EE.UU 2002) PAMPA (Argentina 2002) PROMETEA (Italia 2003) Ian Wilmut and Dolly. In 1996, British embryologist Professor Ian Wilmut created, the world's first sheep cloned from an adult sheep cell. The research was conducted at the Roslin Institute in Edinburgh, Scotland. Marcadores moleculares Y sus aplicaciones Tipos de Marcadores Directos o sea dentro del gen (intragénicos) Indirectos usando a otro gen o marcador cercano en el cromosoma para poder identificar sus diferencias entre individuos RFLP’s Pueden hacerse por Southern blot Pueden hacerse por PCR Utilidad Detección de individuos portadores de un gen recesivo. Test de paternidad o trazabilidad. Selección asistida por marcadores, Salud publica, Virología, etc Por Southern blot Por PCR y luego restricción VNTRs o microsatélites Pueden hacerse por Southern blot Por PCR y geles de poliacrilamida o agarosa Por SSCP Cepas diferentes de Salmonellas