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Trabajo Práctico Nº 2
Estudio Cinético
de la Enzima Sacarasa
Objetivo:
Determinar los
parámetros cinéticos
de la enzima sacarasa
Sacarasa
Enzima que desdobla a la sacarosa en glucosa y fructosa
CH2OH
CH2OH
H
O
H
H
HOCH
2
O
H
H HO
OH H
O
CH2OH
OH
OH H
H OH
Sacarosa
Sacarasa
H
O
H
+
OH H
OH
OH
H
HOCH2
H
OH
Glucosa
O
H
H H HO CH OH
2
OH
H
Fructosa
Valoración Colorimétrica
El ácido pícrico (amarillo) se reduce en medio
alcalino ante la presencia de glúcidos reductores
y se convierte en ácido picrámico (naranja)
H
NO2
O2N
OH
H
+ HO
H
NO2
H
C
C
C
C
C
O
HO
NO2
OH
H
+
OH
OH
+
H2O
O2N
OH
NH2
CH2OH
Ác. Pícrico
Glucosa
H
HO
H
H
C
C
C
C
C
O
OH
H
OH
OH
CH2OH
Agua
Ác. Picrámico
Ác. Glucónico
Curva de Calibración
Absorbancia
Y= 0,0141X
. .Y
µmol Glucosa =
.
. .
.
. .
0,0141
µmol glucosa
Materiales
Extracto Enzimático
Provee la enzima sacarasa
Solución de Sacarosa 2 % p/v
Provee el sustrato de la enzima
Hidróxido de Sodio
•Detiene la reacción enzimática
•Alcaliniza el medio, por lo cual
los glúcidos reductores pueden
actuar sobre el ácido pícrico
Al ser reducido se transforma
en ácido picrámico
(anaranjado), lo que permite
determinar la cantidad de
glucosa presente en la
solución
Solución de Ácido Pícrico
Sc.
Sacarosa
2%p/v
H2O destilada
Extracto Enzimático
NaOH
Ácido
Pícrico
Incubar 37 ºC por 10 minutos
Hervir durante 5’
µmol glucosa.min-1
.
.
.
.
.
.
Después de 5’
Conc. Sacarosa
Resultados
Concentración de Sacarosa
Absorbancia
Concentración de Glucosa
Velocidad de Reacción
Km
Velocidad Máxima