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DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y
DE LA AGRICULTURA
INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
EVALUACIÓN DEL EFECTO DE ÁCIDO GIBERÉLICO CON
AGUA DE COCO Y CASEÍNA HIDROLIZADA COMO
FUENTES DE NITRÓGENO EN LA MADURACIÓN DE
EMBRIONES DE PALMA COCO CUMBÉ (Parajubaea cocoides
Burret) OBTENIDOS A PARTIR DE CALLOS, MEDIANTE
ESTABLECIMIENTO DE SUSPENSIONES CELULARES.
BLANCA ESTHELA ENCALADA ALDAZ
Ing. Cristian Javier Peña Pontón
Director
M.Sc. Grace Tatiana Páez Barrera
Codirectora
Dr. Marcelo Mejía
Secretario Académico
Arecaceae
Palma alto
andina
Parajubaea cocoides
Burret
INTRODUCCIÓN
Valles y
alturas ecuatoriales
Suramérica
Colombia
hasta Ecuador
15-20 m. de altura
Endocarpio
Espermatofita
Angiosperma
Dicotiledóna
Tallo liso
Hojas pinadas
Palma solitaria
monoica
Frutos
elipsoides
Infrutescencias
Inflorescencia
Especie
amenazada
Distrito
Metropolitano de
Quito emprende
proyectos para la
reforestación de
esta especie.
Seis y ocho meses
Endospermo sensible
Raíces sensibles
Embriogénesis
somática
Tipos de
embriogénesis
Fusión de
gametos
v
Embriogénesis
Somática Directa
Embriogénesis
Somática
Indirecta
Eje apical
Eje
radicular
Fases de los embriones
Globular
ETAPAS
-Inducción
-Proliferación
-Diferenciación
-Maduración
-Germinación
Corazón
Torpedo
Cotiledonar
OBJETIVOS
GENERAL
Evaluar el efecto de ácido giberélico, agua de coco y caseína hidrolizada en
la maduración de embriones somáticos de palma coco cumbé (Parajubaea
cocoides Burret) obtenidos a partir de callos, mediante establecimiento de
suspensiones celulares.
ESPECÍFICOS
 Validar el método de desinfección, establecimiento e inducción de callo
embriogénico de palma coco cumbé.
 Evaluar el efecto y la concentración adecuada de ácido giberélico en la
maduración de los embriones somáticos.
 Evaluar el efecto del agua de coco y caseína hidrolizada como fuente de
nitrógeno orgánico.
METODOLOGÍA
• M&S (1962)
• 1 mg L-1 Tiamina ,60
mg L-1 2,4 D, 1 g L-1
carbón activado, 30 g
L-1 de azúcar y 7 g L-1
de agar
• Solución de detergente
por 10 minutos.
• (NaClO) al 2.5 % por 10
minutos
• M &S(1962)
• 0.1 mg L-1 AIA, 0.8 mg
L-1 BAP, 2.5 mg L-1
sulfato de adenina, 40 g
L-1 sacarosa, 200 mgL-1
CH, agua de coco y
ácido giberelico
Fase de
desinfección
Fase de
inducción de
callo
embriogénico
Fase de
establecimiento
de las
suspensiones
celulares
Fase de conteo
celular
• Concentración
(cell/ml) = Número
de células * 10000 /
Número de cuadros
• M& S(1962) a la mitad de su
concentración
• 0.1 mg L-1 ácido indol acético
• 0.8 mg L-1 de benzilaminupurina
• 2.5 mg L-1 sulfato de adenina
Fase de maduración
• 40 g L-1 de sacarosa
de embriones
somáticos
Fase de identificación
embrionaria
Tratamientos
GA3 (mg L-1)
Fuente de nitrógeno
M1
M2
M3
1.5
3
1.5
Agua de coco (35 ml)
Agua de coco (35 ml)
Caseína hidrolizada (200 mg L-1)
M4
Control
3
-
Caseína hidrolizada (200 mg L-1)
-
Tratamientos de la maduración
Fuente: (Muñoz, 2003; Jha et al., 2007; Sujatha et al., 2008).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Fase de desinfección
90 embriones
sembrados
Contaminación
del 1,11%
Sobrevivencia
del 98,89%
(A) Embriones sembrados después de la desinfección,
(B) Explante sin contaminación, (C) Explante
contaminado
Fase de inducción de callo
embriogénico
(A) Callos sembrados, (B) Porción de callo friable
Cinética celular
Conteo celular en Parajubaea cocoides Burret (A) fase de retraso, (B)
fase exponencial, (C) fase logarítmica, (D) fase estacionaria.
Fase de establecimiento de las
suspensiones celulares
16 días
C1: 1.5 mg L-1 de GA3 y 35 ml de AC
C2: 3 mg L-1 de GA3 y 35 ml de AC
22 días
C3: 1.5 mg L-1 de GA3 y 200 mg L-1 de
caseína hidrolizada
(a) Eliminación del medio de cultivo, (b)
Reposición del medio en la suspensión,
(c) suspensión de color translucida
C4: 3 mg L-1 de GA3 y 200 mg L-1 de
caseína hidrolizada
Suspensión uno
Día
16
Densidad celular (cel/ml)
350000
300000
250000
200000
150000
100000
50000
0
0
5
10
15
20
Tiempo (días)
25
Curva de la cinética celular
30
Ajuste del crecimiento celular
Suspensión dos
Día
16
Densidad celular (cel/mnl)
350000
300000
250000
200000
150000
100000
50000
0
0
5
10
15
20
Tiempo (días)
Curva de la cinética celular
25
30
Ajuste del crecimiento celular
Suspensión tres
Día
22
Densidad celular (cel/ml)
400000
350000
300000
250000
200000
150000
100000
50000
0
0
5
10
15
20
Tiempo (días)
Curva de la cinética celular
25
30
Ajuste del crecimiento celular
Suspensión cuatro
Día
22
Densidad celular (cel/ml)
400000
350000
300000
250000
200000
150000
100000
50000
0
0
5
10
15
20
Tiempo (días)
25
Curva de la cinética celular
30
Ajuste del crecimiento celular
Mejor suspension
Formación de células
Análisis de varianza paramétrica y prueba de LSD Fisher
Fase de maduración de
embriones somáticos
Sin fuentes
Nitrógeno
Necrosan
(A) embriones necrosados en el tratamiento
testigo, (B) embriones en desarrollo
Mueren
GA3
Embrión globular
Prueba de Kruskal-Wallis
80.00%
73.43%
Porcentaje de embriones
70.00%
60.00%
53.43%
50.00%
40.00%
Embrion en fase globular
30.00%
20.00%
10.00%
0.00%
M1
M2
M3
M4
Tratamientos
Porcentaje de formación de embriones
Embrión corazón
Prueba de Kruskal-Wallis
30.00%
25.64%
Porcentaje de embriones
25.00%
23.30%
20.00%
15.00%
Embrion en fase corazón
10.00%
5.00%
0.00%
M1
M2
M3
M4
Tratamientos
Porcentaje de formación de embriones
Embrión torpedo
Prueba de Kruskal-Wallis
35.00%
30.82%
Porcentaje de embriones
30.00%
26.34%
25.00%
20.00%
Embrion en fase torpedo
15.00%
10.00%
5.00%
0.00%
M1
M2
M3
M4
Tratamientos
Porcentaje de formación de embriones
Embrión cotiledonar
Prueba de Kruskal-Wallis
50.00%
45.36%
45.00%
40.79%
Porcentaje de embriones
40.00%
35.00%
30.00%
25.00%
Embrion en fase cotiledonar
20.00%
15.00%
10.00%
5.00%
0.00%
M1
M2
M3
M4
Tratamientos
Porcentaje de formación de embriones
Porcentajes de embriones en sus distintas fases
Prueba de Kruskal-Wallis
486
500
Número de embriones
450
400
350
429
386
335
300
250
Número total de embriones
200
150
100
50
0
M1
M2
M3
Tratamientos
M4
Número total de embriones formados en los cuatro
tratamientos
CONCLUSIONES
 El mejor protocolo de desinfección para la inducción de callo, fue utilizando una
concentración de NaClO al 2.5%, con un tiempo de inmersión de diez minutos.
 Se obtuvo un porcentaje de contaminación en la inducción del callo del 1,11%, por
lo tanto la sobrevivencia de los embriones fue de 98,89%.
 El mejor tratamiento para la inducción de callo, fue el tratamiento con (60 mg L-1
2,4 D y 1 g L-1 carbón activado), ya que presentó viabilidad y formación de callos
friables.
 El mejor tratamiento para el establecimiento de las suspensiones celulares, fue el
tratamiento con (1.5 y 3 mg L-1 de ácido giberélico con 200 mg L-1 de caseína
hidrolizada), ya que presentan la media más alta con respecto a la formación de
células en relación al tiempo.
 El mejor tratamiento para la maduración de embriones, fue el tratamiento con (3 mg
L-1 de ácido giberélico con 200 mg L-1 de caseína hidrolizada), ya que se observó
embriones en todas las fases, y se obtuvo 45.36% de embriones en fase cotiledonar.
 El agua de coco como fuente de nitrógeno, no favoreció la obtención de embriones
en fase cotiledonar, sin embargo, se obtuvo un 73,43% de embriones en fase
globular.
RECOMENDACIONES
 Para el proceso de maduración, se debería probar con la adición de 150 mg L-1
glutamina, que según varios autores incrementa los niveles de aminoácidos libres, y
el porcentaje de proteínas; además de mejorar el tamaño de los embriones y su
frecuencia de conversión.
 Para alcanzar un alto grado de sincronización en el crecimiento de los embriones
somáticos en un mismo tejido o en suspensión celular, se debería utilizar ácido
abcísico (ABA).
 Realizar un estudio histológico en cada etapa de la embriogénesis somática, para así,
determinar los cambios estructurales y morfológicos de los embriones.
 Es necesario continuar con el proceso de germinación de los embriones y
aclimatación de las plántulas, para de esta forma determinar la efectividad del
protocolo.
AGRADECIMIENTOS
Ingeniero Cristian Javier Peña Pontón
M.Sc. Grace Tatiana Páez Barrera
Ingeniero Pedro Romero
Ingeniera Maria Jose Basantes
Ingeniero Segundo Aguilar
GRACIAS