Download Diapositiva 1

TOXICOLOGIA
En el momento actual se reconoce que la Toxicología es una ciencia
multidisciplinaria.
Esta característica es una de las razones del rápido desarrollo de la
Toxicología en los últimos años, gracias a las contribuciones de
profesores, investigadores y profesionales de muy diferente
formación inicial ( Repetto, 1.995).
Existen muchas definiciones de la misma; una de las más completa es la
siguiente:
Toxicología - es la ciencia que estudia las sustancias químicas en cuanto que
son capaces de producir alteraciones patológicas en los seres vivos, con
sobrevida- con o sin secuelas - o muerte , estudia los mecanismos de
producción de dichas alteraciones y los medios para contrarrestarlas –
antídotos o antagonistas - , así como los procedimientos para detectar,
identificar y cuantificar tales agentes y evaluar su grado de toxicidad , como
también su dispersión en el medio ambiente ( Repetto, 1.981 y 1.997).
Productos Químicos
Exposición
Efectos
Toxicidad : Capacidad para producir daño a un organismo vivo en relación
a la cantidad de sustancia administrada o absorbida, la vía de
administración, y su distribución en el tiempo
Dosis: Cantidad de sustancia por kilogramo de peso que es capaz de
producir un efecto en 24 horas
Intoxicaciones y sus clases
A-Intoxicación Aguda
salud
a
c
d
B- Intoxicación Crónica
a
c
e
d
f
tiempo
b
enfermedad
b
a- estado de salud
b- posibilidad de muerte
c- recuperación total
d- recuperación con secuelas
e/f - progresivos déficit salud
Intoxicación aguda : Única dosis con
aparición de sintomatología antes de
las 24 horas
Toxicidad Aguda
Toxicidad Crónica
Intoxicación crónica : Absorción
repetida de un toxico en largos
periodos de tiempo
Distintos Tiempos en un proceso tóxico
Máximo
-Muerte-
Absorción
Aparición
Latencia
Desaparición
Duración del efecto
Agente Xenobiótico
Etimología: “Ajeno a la vida”, todo cambio significativo en la
composición o condiciones naturales de un medio constituye una
forma de contaminación que afectan al recurso en sí o a su uso para
un fin determinado
Los agentes que lo provocan pueden ser: químicos, físicos, biológicos
El medio afectado puede ser aire, agua, suelo o cualquier sustrato
orgánico
Los agentes pueden producirse en forma espontánea o provocada
por la actividad del hombre
En cuanto a la composición puede ser una variación anómala en su
proporción o la incorporación de sustancias que no se encuentran en
el ambiente en forma normal e introducidas por la actividad del
hombre
Características tóxicas del agente xenobiótico
Dosis Letal 50 (DL50) : Es la dosis que produce la muerte del 50% de
los animales de un lote de experimentación.
[DL50] = miligramos de compuesto por kilogramo de peso del animal
A menor valor de la DL50 , más peligrosa es la
sustancia respecto de otra de mayor magnitud.
Sustancia Química
DL50 mg/kg
Etanol
10.000
Cloruro de sodio
4.000
Estricnina
2
Nicotina
1
Toxina Botulínica
0,00001
Denominación
DL50 oral rata
Dosis oral letal hombre
adulto
Extremadamente
tóxico
Menor a 1 mg/Kg
1 gota
Altamente tóxico
1 – 50 mg/Kg
1 cucharada ( 4 ml)
Moderadamente
tóxico
50 – 500 mg/Kg
30 g
Ligeramente
tóxico
0,5 – 5 g/Kg
250 g
Prácticamente
no tóxico
5 –15 g/Kg
1 litro
Relativamente
inocuo
Mayor a 15 g/Kg
Mayor a 1 litro
Pueden emplearse como indicadores , otros efectos diferentes
a los de la muerte
Por ejemplo, Indicadores Biológicos de Exposición , los cuales pueden
ser :
A- Químicos : Concentración del toxico o sus metabolitos en
fluidos biológicos
B- Bioquímicos : modificación de parámetros bioquímicos
fisiológicos ( Me Hb; actividad enzimática ,etc)
C- Funcionales : Capacidad respiratoria, vol.min circulatorio
D- Histológicos: Lesiones tisulares
Los marcadores biológicos, también denominados
determinantes o indicadores biológicos de exposición a un
compuesto químico pueden ser, según su naturaleza, el
propio compuesto, sus metabolitos característicos,
productos procedentes de reacciones de conjugación del
compuesto o de sus metabolitos que se puedan producir en
los ciclos bioquímicos endógenos, formados por
reacción del compuesto o por sus metabolitos con
macromoléculas, interferencias bioquímicas o enzimáticas
medibles, etc .
Los medios biológicos en los que se
puede determinar la
presencia de los marcadores biológicos
de exposición laboral
están muy relacionados con las vías de
entrada, distribución
y eliminación de cada compuesto, así
como con su
naturaleza química
La mayoría de las determinaciones
biológicas
se realizan en sangre, orina o aire
exhalado
La sangre constituye el principal vehículo de transporte y
distribución de los compuestos químicos en el cuerpo,
por tanto la mayoría de las sustancias biológicamente
activas o sus metabolitos se pueden encontrar en este
medio.
La orina es fácil de recoger, se pueden utilizar grandes
volúmenes de muestra y es también una técnica no
invasiva.
Las determinaciones en aire exhalado están limitadas a la
exposición a compuestos orgánicos volátiles; es un
método no invasivo y el mejor aceptado por la población
por la sencillez de la toma de muestra .
Vías o rutas de absorción
Barrera Biológica
Cutánea
Xenobiótico
Gastrointestinal
Distribución
Alveolar
Placentaria
Otras
Órgano blanco
Efectos
Incorporación de los Tóxicos al organismo
Contaminante
Vía Respiratoria
Vía Dérmica
Vía Digestiva
ECOTOXICOLOGIA # TOXICOLOGIA

Toxicología: estudia las interacciones nocivas entre sustancias
químicas y organismo vivos

Objeto de estudio: individuos

Ecotoxicología: estudia los efectos de los contaminantes sobre los
ecosistemas

Objeto de estudio: poblaciones, comunidades, ecosistemas
ECOTOXICOLOGÍA







Ecotoxicología: estudia el destino y los efectos de los contaminantes
en los ecosistemas intentando explicar las causas y prever los riesgos
probables
Destino de los contaminantes: emisión, distribución, transporte,
transformación (química/biológica), bioacumulación
Efectos biológicos de los contaminantes: sobre las poblaciones,
comunidades y ecosistemas
Modificaciones en la estructura y funcionamiento del ecosistema:
declinación de aves, diversidad de especies de algas,
disminución/aumento de la productividad primaria
Contaminante: toda forma de materia capaz de alterar, modificar o
interferir en forma negativa con los elementos del ambiente siendo
factor de riesgo para el hombre y otros seres vivos
Efectos directos contaminantes: actúan sobre los individuos (y a
través de ellos sobre las poblaciones, comunidades, ecosistemas)
ejemplos: metales pesados, pesticidas
Efectos indirectos contaminantes: actúan sobre el medio físico,
ejemplos: sólidos suspendidos, materia orgánica
ECOTOXICOLOGÍA










Efecto tóxico: es el producido por uno o varios agentes tóxicos sobre
un organismo, población o comunidad que se manifiesta por cambios
biológicos y su grado se evalúa por una escala de intensidad
relacionada con la dosis (cantidad administrada/unidad de peso
corporal) o la cc (sustancia aplicada al medio) del agente tóxico
El efecto puede ser:
Cuantal: presencia o ausencia de una característica
Letal: muerte por acción directa consecuencia de la exposición
Subletal: por debajo del nivel que causa la muerte
Agudo: efecto que se manifiesta rápida y severamente después de un
corto período de exposición: 0-96hs
Crónico: efecto luego de un largo período de exposición (días o años)
según la especie
Combinado: dos o más sustancias aplicadas al mismo tiempo
producen distintos efectos o modos de acción
Potenciación o sinergismo: cuando la toxicidad de una mezcla es
mayor a la esperada debido a la suma de toxicidades de los agentes
individuales
Inhibición o antagonismo: cuando la toxicidad es menor a la esperada
debido a la suma de toxicidades de los agentes individuales
ECOTOXICOLOGÍA

Ensayos de toxicidad: tienen como propósito determinar si los
compuestos químicos tóxicos se encuentran en cantidades tóxicas

No están pensados para predecir efectos sobre los ecosistemas en forma
cuantitativa, aunque muchos estudios han demostrado la existencia de
una asociación significativa entre los resultados de los ensayos y el
impacto en los ecosistemas

El bioensayo es un método utilizado para detectar y evaluar la
capacidad inherente de un agente tóxico de producir efectos adversos
sobre los organismos vivos

Realizado en condiciones definidas y sobre organismos individuales o un
grupo de organismos determinado se estudian las relaciones dosis o cc
vs efecto o respuesta
Ninguna especie aislada podría representar un ecosistema entero se
recomiendan ensayos secuenciales incluyendo: algas, dàfnidos y peces

MEDICIONES EN BIOENSAYOS

Los efectos tóxicos a evaluar pueden ser: mortalidad, inmovilidad,
inhibición del crecimiento, alteración del comportamiento, etc

IC 50: concentración de la muestra que provoca una disminución o
inhibición del 50% de la luminiscencia (Vibrio fisheri u otra bacteria) en
un tiempo determinado

CE 50: concentración efectiva de la muestra que provoca un efecto en
el 50% de la población (Daphnia magna u otro invertebrado) en un
tiempo determinado
COMO EMPLEAR LOS RESULTADOS DE LOS
ENSAYOS DE TOXICIDAD

Clasificar efluentes en UTA (unidades tóxicas agudas)
UTA = 1 / CE 50 x 100
CE 50 - 24hs
(% v/v de efluente)
UTA
Caraterización del
efluente
< 25 %
>4
Muy tóxico
26 – 50 %
2–4
Tóxico
51 – 75 %
1.33 – 1.99
Moderadamente
tóxico
> 75 %
< 1.33
Levemente tóxico
CONTROL DE DESCARGAS A CUERPOS
RECEPTORES

Objetivo: asegurar que las descargas no contengan contaminantes
tóxicos en cantidades tóxicas

Monitoreo químico: control de sustancias específicas

Biomonitoreo:
Ensayos de toxicidad (WET o toxicidad total del efluente): no da
información sobre tóxicos específicos, ni sobre el tratamiento o la
persistencia ni los efectos sobre la salud humana pero, permite evaluar la
toxicidad conjunta de todos los constituyentes de un efluente complejo o
la reducción de los efectos tóxicos limitándose a medir un único
parámetro su toxicidad
Bioensayo: evaluación de la condición de un cuerpo de agua mediante
el estudio de organismos residentes
Factores de incertidumbre: condiciones de mezcla del efluente en el
cuerpo receptor , variabilidad en la sensibilidad entre especies,
variabilidad de toxicidad del efluente



COMO SE REALIZA UN ENSAYO DE
TOXICIDAD CON EFLUENTES

Toma de muestra

Conservación de la muestra

Pretratamiento de la muestra

Realización del ensayo
BIOENSAYOS

Microtox (Vibrio fischeri)

Método rápido de toxicidad empleando Daphnia
magna y KIT-TOX.

Ensayo de toxicidad aguda con Daphnia magna

Ensayo de toxicidad aguda con semillas de
lechuga (Lactuca sativa L)
BIOENSAYO DE TOXICIDAD MICROTOX
 Organismo
de ensayo: Vibrio fischeri
 Una especie de bacteria marina Gram
negativa
 Anaerobia facultativa
 Del género VIBRIÓN, familia Vibrionaceae
 Exhibe BIOLUMINESCENCIA
Vibrio fischeri

Se encuentra en una
relación simbiótica con el
calamar sepiólide
Euprymna scolopes
 El Euprymna scolopes
posee una serie de
apéndices recubiertos de
mucosidad alrededor de
su órgano luminoso con
los que recoge bacterias
Vibrio fischeri del entorno
marino
Vibrio fischeri
Principales características:
 La
Bioluminiscencia (emisión de luz por
parte de organismos vivos como resultado
de sus actividades bioquímicas)

Su gran sensibilidad que presenta a una
amplia variedad de sustancias tóxicas
BIOENSAYO DE TOXICIDAD MICROTOX
Principio de la técnica:

Se determina la inhibición de la luminiscencia de
una suspensión de células de Vibrio fischeri
como resultado de la exposición de dicha
suspensión a diluciones de la muestra.
 Se somete a distintas diluciones (1,10, 45 y 90
%) durante distintos tiempos (5, 15, 30 min).
 También se hacen los controles, donde no se le
suministra la muestra o toxina y se analiza la
baja de la luminiscencia
BIOENSAYO DE TOXICIDAD MICROTOX

Expresión de los resultados: IC 50 (concentración de la
muestra que provoca una disminución de la luminiscencia en
un tiempo determinado )
 Alcance: aguas residuales, lixiviados, aguas dulces
superficiales o subterráneas o aguas saladas
 Tóxicos de referencia: permiten evaluar bajo condiciones
estandarizadas la sensibilidad relativa de la bacteria luego
de la reconstitución y la confiabilidad de los ensayos
 Fenol: IC50 5 min 13-26mg/l
 Cinc: IC50 15min 0.6-2.2 mg/l Zn/l
IC50 15min 3-10mg/l (Zn SO4.7H2O)
BIOENSAYO DE TOXICIDAD MICROTOX
 Analizador
de toxicidad aguda
BIOENSAYO DE TOXICIDAD MICROTOX
BIOENSAYO DE TOXICIDAD MICROTOX

El software del equipo calcula la relación concentración/efecto para
cada tiempo de exposición usando análisis por regresión lineal

El resultado puede expresarse como IC50 (concentración inhibitoria
50) que es la concentración de la muestra a la cual se observa una
disminución de la luminiscencia del 50%; este valor se calcula a partir
de la curva concentración-respuesta (variable métrica) y representa la
concentración a la cual la variable (en este caso la luminiscencia) es un
50% menor que el control

El resultado también puede expresarse como porcentaje de
inhibición: como resultado de la exposición de la suspensión de
bacterias a una concentración de la muestra con respecto al control y se
expresa en porcentaje, por ejemplo la muestra a una concentración del
20% causa un 65% de inhibición de la luminiscencia a los 15 minutos de
exposición
BIOENSAYO DE TOXICIDAD MICROTOX





Interferencias: las pérdidas de luminiscencias por absorción de la luz o
dispersión pueden suceder en caso de muestras turbias o fuertemente
coloreadas y se compensa usando una cubeta de corrección de color
(cubeta con cámara doble)
Se requiere una concentración de oxígeno mayor a 0.5mg/l para que se
produzca la luminiscencia las muestras con altas DBO pueden causar
deficiencias o ser inhibitorias
Limitaciones: sustancias insolubles, poco solubles, volátiles o cuyo
estado se altere durante el período de ensayo puede afectar el resultado
o su reproducibilidad
Las concentraciones salinas en la muestra inicial que excedan los
30mg/l de ClNa pueden conducir a efector hiperosmóticos
Conservación de las muestras: refrigeradas hasta 24hs y congeladas
a -20°C durante 2 meses sin conservantes de carácter biocida
Métodos de detección de toxicidad
empleando Daphnia magna

Organismo de ensayo: Daphnia magna

Del orden de los Cladóceros de la clase
Crustácea (pariente de los cangrejos)
las especies del género Daphnia

Se trata de una pequeña “pulga de
agua” que mide de 1 a 3 mm

Vive en lagos y lagunas, alimentándose
de algas microscópicas y sirviendo, a
su vez, de alimento a los peces

Tiene un ciclo de vida corto (3 o 4
semanas)

Reproducción partenogenética (
asegura una uniformidad de respuesta
de los individuos )
Métodos de detección de toxicidad
empleando Daphnia magna

Alta sensibilidad a los tóxicos;
es capaz de acusar 0.005mg de
mercurio en agua y menores
concentraciones de pesticidas
y residuos industriales

Son las más usadas como
organismos de prueba o de
referencia en ensayos de
toxicidad
Métodos de detección de toxicidad
empleando Daphnia magna

Con Daphnia magna se hacen tres tipos de
ensayos:



Método rápido de toxicidad empleando Daphnia
magna y KIT-TOX.( fluorescencia de sustrato bajo luz
UV)
Ensayo de toxicidad aguda (CL50 o CE50): la
concentración del tóxico capaz de matar o inmovilizar
el 50% de la población en 48hs
Ensayo de toxicidad crónica: la evaluación se basa
en la capacidad reproductiva o el crecimiento de los
individuos.
Método rápido de toxicidad empleando
Daphnia magna y KIT-TOX
 Objetivo:


Detección temprana de agentes
contaminantes que hayan ingresado al agua
Permite detectar la presencia de un alto rango
de sustancias en un tiempo máximo de dos
horas desde el inicio del ensayo
Método rápido de toxicidad empleando
Daphnia magna y KIT-TOX.

Principio de la técnica:



Los organismos que hayan estado expuestos a
sustancias tóxicas, tendrán reducida su capacidad de
ingerir y consecuentemente de clivar
enzimáticamente un sustrato azucarado con marcado
fluorescente
La respuesta enzimática permite al usuario
caracterizar la toxicidad de una muestra liquida,
cuantificando la supresión de la actividad enzimática.
La visualización ocular de los organismos incubados
en la muestra a evaluar, bajo luz ultravioleta de onda
larga, y contabilización de los fluorescentes y no
fluorescentes en cada cámara de exposición.
Método rápido de toxicidad empleando
Daphnia magna y KIT-TOX.

El azúcar es el sustrato marcado

Las Daphnias a usar son neonatos (menores de
24 horas) sin alimentar por aproximadamente 4
horas previas al ensayo

Se emplean 36 organismos: 6 celdas con 6
organismos cada celda
Método rápido de toxicidad empleando
Daphnia magna y KIT-TOX.





Llenar cada cámara con la dilución
de la muestra a analizar
Someter las Daphnias por un periodo
de 60 min al efecto de la muestra y
también a controles negativo y
positivo (dicromato 0,8 mg/L)
Luego de la hora, agregar 6 gotas
del sustrato IQ e incubar 15min.
Bajo luz UV, se cuentan los
organismos que florecen en cada
cámara
Si 4 o más de los 18 organismos
expuestos a la muestra no
florecen, el agua es tóxica para el
consumo humano
Ensayo de toxicidad aguda con
Daphnia magna
 Principio:


En la prueba de toxicidad aguda también se
emplean neonatos de D.magna expuestos a
diferentes concentraciones de una muestra o
de un tóxico durante un periodo de 48 hs
Como resultado de dicha exposición se
puede determinar la concentración en que la
muestra produce la muerte del 50% de la
población de neonatos expuestos (CL50) con
un nivel de confiabilidad del 95%.
Ensayo de toxicidad aguda con
Daphnia magna






En vasos de precipitado de vidrio. 25 ml.
10 neonatos por vaso, por triplicado ( 30 por
tratamiento)
Control (agua dura reconstituida).
Control positivo con una solución tóxico de
referencia. dicromato de potasio (K 2Cr 2O 7)
0,8mg/L. CL50
Diluciones de la muestra: 100; 50; 25; 12,5; 6,25%
Incubar 48 hs
Ensayo de toxicidad aguda con Daphnia
magna.
Cálculo de la CL50:

Para el cálculo de la CL50 y
sus respectivos límites de
confianza al 95% se utiliza el
método Probit, que permite
estimar la CL50 ajustando los
datos de mortalidad mediante
una técnica de probabilidad
para estimar los valores que
siguen una distribución
logarítmica de tolerancias
Ensayo de toxicidad aguda con
Daphnia magna

Aceptabilidad de los resultados:




La mortalidad en el control negativo no debe exceder
el 10%.
La concentración final de oxígeno disuelto debe ser
mayor de 2 mg/l.
La CL50 para el tóxico de referencia deberá estar
dentro de los límites de confianza preestablecidos en
la carta control
En caso de emplear un control positivo de CL50, los
valores de mortalidad obtenidos deberán encontrarse
cercanos al 50%.( entre 33% y 57%)
Ensayo de toxicidad aguda con
Daphnia magna
Ensayo de toxicidad crónica con
Daphnia magna
 Si
un test de toxicidad aguda no detecta
efecto alguno de mortandad o
inmovilización, esto no siempre significa
que el agua analizada no contenga
sustancia alguna capaz de producir otro
tipo de daño
 Para estos casos se utilizan los tests de
toxicidad crónica en los que la evaluación
se basa en la capacidad reproductiva o el
crecimiento de los individuos
Ensayo de toxicidad aguda con semillas de
lechuga (Lactuca sativa L)

Principio:

El bioensayo de toxicidad con
semillas de lechuga (Lactuca
sativa L) es una prueba estática
de toxicidad aguda (120 hs de
exposición) en la que se pueden
evaluar los efectos fitotóxicos
de compuestos puros o de
mezclas complejas en el
proceso de germinación de las
semillas y en el desarrollo de
las plántulas durante los
primeros días de crecimiento
Ensayo de toxicidad aguda con semillas de
lechuga (Lactuca sativa L)
 La
evaluación del desarrollo de la radícula
y del hipocotilo constituyen indicadores
representativos para determinar la
capacidad de establecimiento y desarrollo
de la planta.
Ensayo de toxicidad aguda con semillas de
lechuga (Lactuca sativa L)

A diferencia de la prueba tradicional
de germinación de semillas, la
evaluación del efecto en la
elongación de la radícula y del
hipocotilo de las plántulas permite
ponderar el efecto tóxico de
compuestos solubles presentes en
niveles de concentración tan bajos
que no son suficientes para inhibir la
germinación, pero que sin embargo,
pueden retardar o inhibir
completamente los procesos de
elongación de la radícula o del
hipocotilo, dependiendo ello del
modo y sitio de acción del
compuesto.
Ensayo de toxicidad aguda con semillas de
lechuga (Lactuca sativa L)
En cada cápsula de Petri un disco de papel de filtro.
 • Saturar el papel de filtro con 4 mL de la dilución
evitando que se formen bolsas de aire.
 • Con la ayuda de una pinza, colocar cuidadosamente
veinte semillas, dejando espacio suficiente entre ellas
para permitir la elongación de las raíces.
 • Tapar las cápsulas y colocarlas en bolsas plásticas
para evitar la pérdida de humedad. Dado que algunas
variedades de semillas de lechuga requieren oscuridad
para que se produzca la germinación, las cajas de Petri
deben cubrirse de la luz durante el periodo de ensayo
 • Incubar durante 120 hs (cinco días) a una temperatura
de 22± 2 °C. Realizar repeticiones para cada dilución
ensayada

Ensayo de toxicidad aguda con semillas de
lechuga (Lactuca sativa L)





Terminado el periodo de exposición (120 h), se procede a
cuantificar el efecto en la germinación y en la elongación
de la radícula y del hipocotilo
Registrar el número de semillas que germinaron
normalmente, considerando como criterio de germinación
la aparición visible de la radícula
Utilizando una regla o papel milimetrado, medir
cuidadosamente la longitud de la radícula y del hipocotilo
de cada una de las plántulas correspondientes a cada
concentración de tóxico o dilución de muestra y a los
controles
La medida de elongación de la radícula se considera
desde el nudo (región más engrosada de transición entre
la radícula y el hipocotilo) hasta el ápice radicular
La medida de elongación del hipocotilo se considera
desde el nudo hasta el sitio de inserción de los dos
cotiledones
Ensayo de toxicidad aguda con semillas de
lechuga (Lactuca sativa L)


Expresión de los resultados:
• Promedio y desviación estándar de la
elongación de la radícula y del hipocotilo de las
plántulas de cada repetición.

• Porcentaje de inhibición del crecimiento de la
radícula y del hipocotilo, con el promedio de
elongación para cada dilución respecto del
promedio de elongación del control negativo.

• Porcentaje de inhibición en la germinación.