Download Aplicabilidad de los micro-arrays en el laboratorio clínico

MICROARRAYS
GENOMA:
CONJUNTO DE TODOS LOS GENES DE UN
ORGANISMO
GEN:
UNIDAD DE ALMACENAMIENTO DE INFORMACIÓN
GENÉTICA
CUALQUIER ELEMENTO DEL CROMOSOMA MEDIANTE
EL CUAL SE TRANSMITEN LOS CARACTERES DE UN
ORGANISMO
SECUENCIA DE ADN (O ARN), ESENCIAL PARA UNA
DETERMINADA FUNCIÓN FISIÓLÓGICA
PROTEÍNA:
SECUENCIAS DE AMINOÁCIDOS QUE ACTUAN COMO
ENZIMAS, ELEMENTOS ESTRUCTURALES,
HORMONAS, ETC.
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DEL GENOMA
•ESTÁTICO, ÚNICO
AL PROTEOMA
•DINÁMICO, MÚLTIPLE
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LOS GENES NO ACTÚAN DE FORMA AISLADA, EXISTEN REDES DE INTERACCIÓN
•FÍSICA (DIRECTA O INDIRECTA)
•FUNCIONAL
CIERTA CO-REGULACIÓN ES NECESARIA
VARIOS NIVELES:
•TRANSCRIPCIÓN
•MADURACIÓN
•TRANSPORTE AL CITOPLASMA
•DEGRADACIÓN
•TRADUCCIÓN
•POST-TRADUCCIÓN
MICROARRAYS
Avance en las técnicas moleculares y desarrollo de la bioinformática.
Las disciplinas denominadas “omicas” :genómica, proteómica,
transcriptómica…
Importantes consecuencias:
Diagnóstico
Pronóstico
Seguimiento
Tratamiento
La disponibilidad y el buen
uso de estas tecnologías es
cada vez más necesaria en
el medio asistencial
Requiriéndose personal de
laboratorio especializado en
estas metodologías
MICROARRAYS
La técnica de los microarrays surge a mediados de los años 90 como método
para estudiar la expresión de miles de genes de manera simultánea, en
diferentes condiciones fisiológicas.
Posteriormente, se ha ido modificando para el abordaje de otros estudios
como el cribado masivo de mutaciones en un genoma.
Los estudios con microarrays han permitido un avance en el conocimiento de
la biología de muchas patologías:
•Clasificar genómicamente diversas entidades clínicas como el cáncer de
mama y varias neoplasias hematológicas.
Además, su inclusión en la práctica clínica ha supuesto una mejora muy
importante en el diagnóstico citogenético y molecular.
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PREGUNTA
Diseño experimental
Hibridación de las muestras
Análisis de imagen
Preprocesamiento de datos
Análisis estadístico
Extracción de genes relevantes
RESPUESTA
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¿QUÉ ES UN MICROARRAY?
Los microarrays o micromatrices son:
•Un formato experimental
•Basado en la síntesis o fijación de sondas,
que representan los genes (o proteinas, o
metabolitos)
•Sobre soportes sólidos (cristal, plástico,
silice,...), en los que se disponen, de manera
ordenada, las sondas específicas de ADN
•Expuestos
muestra).
a
las
moléculas
diana
(la
•Basada en la propiedad física de los ácidos
nucleicos para hibridar con secuencias
complementarias, a temperaturas y pH
adecuados.
MICROARRAYS
¿QUÉ ES UN MICROARRAY?
Pasos:
1.-La muestra biológica se marca con un trazador fluorescente.
2.-Hibridación entre la muestra y las sondas del microarray.
3.-Tras una serie de lavados, las sondas hibridadas emiten luz fluorescente.
4.-El microarray se escanea y se visualiza una imagen.
5.-Se cuantifica la señal de las imágenes mediante software especializado.
6.-Se realiza un tratamiento informático de los datos, para:
•Minimizar las variaciones inherentes a la técnica
•Optimizar la extracción fiable de los datos
•Correlacionar dichos datos con el proceso biológico.
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Microarrays:
Condiciones de trabajo controladas, que minimicen la variabilidad de la técnica
Estudiar simultáneamente, varios miles de genes
Análisis robusto y cuidadoso que garantice la fiabilidad y reproductibilidad de los
resultados
Aplicaciones más frecuentes son:
Estudio de expresión de genes en diferentes tejidos
Identificación de SNP que se asocian a una condición (ej: sanos/enfermos)
Clasificación molecular de enfermedades
Predicción de respuesta al tratamiento
Detección de mutaciones
Polimorfismos y alteración en el número de copias características de una
determinada condición o población.
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TIPOS DE MICROARRAYS
Existen varios tipos de microarrays, específicos para el tipo de estudio:
Microarrays de expresión
•Fabricados con sondas de cDNA o de oligonucleótidos de zonas
codificantes, están diseñados para el estudio de la expresión del RNA.
– Arrays de 2 colores
Diseño y producción del chip
Preparación de la muestra
Hibridación
Escaneado del chip
Análisis de la imagen
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MICROARRAYS
Portaobjeto y cabezal de impresión
MICROARRAYS
– Microarrays de oligos sintetizados in situ
• Diseño más avanzado que los de 2 colores
• Utilizan tecnologías desarrolladas en el entorno de la microelectrónica
• Algunos rasgos distintivos
– No se basan en hibridación competitiva: cada chip contiene muestras
de un solo tipo (”1 color”)
– Las sondas se sintetizan directamente sobre el chip en vez de
sintetizarlas in vitro y adherirlas después
– Cada gen esta representado por un grupo de sondas cortas
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Los GeneChips de Affymetrix
• Affymetrix (www.affymetrix.com) es la compañía lider en este tipo de chips
• Se denominan genericamente GeneChips
• Cada gen esta representado por un conjunto de secuencias cortas que lo
caracterizan
• Algunos chips contienen genomas completos con más de 50.000 grupos
de sondas (Probesets)
Un grupo de sondas se utiliza para medir niveles de mRNA de un único gen
• Cada grupo (probeset) consta de múltiples pares de celdas (probe cells)
– Con millones de copias de un oligo de 25bp
– Organizadas en parejas (probe pairs) con un Perfect Match (PM) y un
Mismatch (MM)
• PM: coincide exactamente con una parte del gen
• MM: idéntico al PM excepto en el nucleótido central reemplazado por su
complementario
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Distintos “Pares de Sondas” representan partes distintas
del mismo gen (1 gen=1 grupo de sondas)
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Resultado de la sintesis de oligos en el chip
Cada celda
contiene
múltiples copias
de la misma
secuencia
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Un segmento de un spot de un microarreglo - las hebras son las
moléculas de ADN depositadas - figura tomada de (Duggan et al.,
Nature Genetics 21: 10-14, 1999)
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•Tras la síntesis
de los “oligos” se
realiza la
hibridación,
depositando el
mRNA marcado
del tejido a
estudiar sobre
cada chip
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Visión general del proceso (Affy)
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http://www.kbrin.louisville.edu/archives/fellows/dobbins.html
gslc.genetics.utah.edu
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COMPARACIÓN ENTRE LOS 2 TIPOS DE CHIPS
Microarrays de cdna
VENTAJAS
• Económicos
• Flexibilidad en el diseño
experimental
• Elevada intensidad de señal
(secuencias largas)
DESVENTAJAS
• Baja Reproducibilidad
• Hibridación cruzada (baja
especificidad)
• Elevada manipulación manual
(Posibilidad de contaminación)
Microarrays de Oligonucleótidos
VENTAJAS
• Fabricación Rápida y más robotizada
• Elevada Reproducibilidad
• Elevada especificidad
• Utiliza muchas sondas/gen
DESVENTAJAS
• Requiere equipamiento más especializado
• Caros
• Poca flexibilidad
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TIPOS DE MICROARRAYS
Los SNP-arrays
•Diseñados para detectar cambios en la secuencia del DNA.
•Permiten estudiar de forma rápida y simultánea múltiples cambios
conocidos, en distintos genes, asociados a distintas patologías,
respuesta a tratamiento o susceptibilidad a enfermedades.
•En investigación se emplean para escanear todo el genoma para
identificar variaciones genotípicas entre distintos individuos o
poblaciones que se asocien a una condición determinada.
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TIPOS DE MICROARRAYS
Los arrays- CGH (Comparative Genome Hibridization arrays):
•Determinan alteraciones en el número de copias de regiones de ADN y se
emplean frecuentemente en el diagnóstico de patologías asociadas a
ganancias o pérdidas de material genético.
Microarrays para el estudio de miRNAS (micro ARN (miARN o miRNA)).
Microarrays de metilación
•Estudio masivo de la metilación, en las regiones promotoras de los genes
 Microarrays de proteínas
•Las sondas son sustituidas por Ac. fijados a portaobjetos de vidrio.
•Una variante de esta técnica es la vertiente aplicada al diagnóstico de la
alergia, donde las proteínas alergénicas están ancladas a la superficie del
microarray para detectar anticuerpos específicos.
MICROARRAYS
MICROARRAYS
BASES DE LA TECNOLOGÍA DE DNA MICROARRAYS
TIPOS DE DNA MICROARRAYS
MICROARRAYS
MACROARRAYS
GENECHIP (AFFYMETRIX)
MICROARRAYS
Esta técnica de microarrays que surgió en el campo de la investigación
Gran potencial en el campo sanitario
Su inclusión en la práctica clínica mejora el estudio de enfermedades:
•Diagnóstico molecular
•Pronóstico,
•Tratamiento
•Seguimiento
Han surgido numerosas compañías, que han desarrollo de microarrays
“a medida”, orientados a patologías o agrupaciones de las mismas:
MICROARRAYS
MICROARRAYS
APLICABILIDAD CLÍNICA DE LOS MICROARRAYS
La implementación de los microarrays se caracteriza:
Utilización actual en la práctica clínica relativamente escasa.
Transformación de la citogenética y la genética molecular.
Su capacidad de diagnóstico supera los protocolos de diagnóstico
genético empleados hasta el momento para determinadas patologías.
Existen muchos tipos de microarrays, sus aplicaciones al
diagnóstico, son muy variadas, algunos de los campos en los que se
están aplicando son los siguientes:
MICROARRAYS
Retraso mental y síndromes asociados al mismo
Los arrays-CGH constituyen una metodología más sensible que el cariotipo
convencional, para la detección de duplicaciones o deleciones cromosómicas,
El desarrollo de esta tecnología ha favorecido un incremento en la detección de
reordenamientos crípticos y pequeñas delecciones o amplificaciones no
detectables por citogenética convencional.
Actualmente, existen en el mercado microarrays diseñados específicamente
para la detección de alteraciones cromosómicas asociadas con retraso mental o
malformaciones congénitas.
Microarrays diseñados específicamente para el diagnóstico prenatal de
síndromes asociados con ganancias o pérdidas de material genético.
MICROARRAYS
Retraso mental y síndromes asociados al mismo
Ventajas de esta técnica, frente al cariotipo convencional:
•El estudio se puede hacer sin necesidad de realizar un cultivo celular.
•Permite analizar simultáneamente la mayoría de las causas genéticas
conocidas para estas patologías.
Desventajas:
•No detecta reorganizaciones equilibradas ni mosaicismos de bajo porcentaje.
En los últimos protocolos para el estudio de estos pacientes se contempla como
una herramienta diagnóstica fundamental, que probablemente, en un futuro
precederá al cariotipo tradicional (o el de alta resolución) o al MLPA
MICROARRAYS
Enfermedades oftalmológicas y otorrinolaringología
Oftalmología:
Existen SNP-arrays para el diagnóstico de patologías monogénicas poco
frecuentes.
•Retinosis pigmentaria recesivas, dominantes, ligadas al cromosoma X
•Distrofias maculares recesivas, dominantes, ligadas al cromosoma X
•Distrofias corneales
•Atrofias ópticas
•Degeneración macular asociada a la edad, entre otros.
Otorrinolaringología:
Existen SNP-arrays
•Estudio de los genes más frecuentemente responsables de hipoacusias
familiares (genes nucleares y mitocondriales.)
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Enfermedades hematológicas
Ha permitido clasificar molecularmente muchas neoplasias hematológicas,
de manera que se han podido distinguir entidades clínicas nuevas.
Los arrays-CGH en este campo:
•Detección de mutaciones somáticas (pérdidas y ganancias)
características de algunas entidades oncohematológicas
Los SNP-arrays:
•Permiten la identificación de disomías uniparentales
•Permiten identificar nuevas alteraciones.
Clasificación
Diagnóstico concreto rápido
Pronóstico
Respuesta a tratamiento
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Enfermedades infecciosas
Identificación de patógenos en poco tiempo de diferentes muestras :
•Microarrays para determinación de patógenos respiratorios
•Microarrays para patógenos urinarios en orina,
•Microarrays para septicemias en sangre,
•Microarrays para identificación de HPV en secreciones genitales, etc.
Identificación de resistencias al tratamiento antimicrobiano, permitiendo
instaurar de forma rápida un tratamiento específico.
Evaluar los cambios en la expresión génica del hospedador:
lo que implica una gran cantidad de información con potencial para:
• el diagnóstico,
• el tratamiento
• el pronóstico de los pacientes.
MICROARRAYS
Otras enfermedades
En el diagnóstico de:
Fibrosis quística
Factores de riesgo tromboembólico
Hiperlipidemias
Factores de riesgo para el desarrollo de múltiples patologías:
•Diabetes,
•Alzheimer,
•Enfermedades autoinmunes, etc
En resumen, los microarrays presentan un alto potencial en su aplicación clínica:
Permiten estudiar de forma sencilla y rápida las enfermedades genéticas,
permitiendo un barrido rápido de los cambios conocidos.
Pueden ser diseñados a medida para la patología de interés, cubriendo
muchos genes o exones concretos, cambios puntuales, variciones en número
de copia, variaciones en mRNAs… etc.
MICROARRAYS
FIRMAS GENÓMICAS
Se han desarrollado una serie de firmas genómicas:
Predecir el pronóstico o curso de una enfermedad (firmas pronósticas)
La respuesta a un determinado tratamiento (firmas predictivas).
Identificar y clasificar distintas entidades clínicas (firmas diagnósticas).
Patología mamaria
MammaPrint® (Agendia)
Aprobada por la FDA (Food and Drug Administration) en febrero del 2007
70 genes, capaz de pronosticar el curso de la enfermedad con mayor eficacia
que los parámetros habitualmente utilizados (metástasis en ganglios, grado
histológico).
Uso:
•Autorizado para Tumores invasivos menores de 5 cm, en estadios iníciales,
con ganglios linfáticos axilares negativos.
Limitaciones:
•Sólo informa del pronóstico del tumor, y no acerca de la naturaleza del
mismo por lo que no ayuda a orientar el diagnóstico ni la terapia.
MICROARRAYS
Patología mamaria
Oncotype Dx (Genomic Health).
21 genes, está diseñada para estimar si un paciente de cáncer de mama
requiere o no ser tratado con quimioterapia
Recomendado su uso en la guias de la sociedad Americana de Oncología
Clínica (ASCO) y la National Comprehensive Cancer Network.
Uso:
•Aplicación en pacientes con:
•Tumores invasivos de mama.
•Receptores hormonales positivos.
•Mujeres premenopausicas con ganglios linfáticos axilares negativos.
•Mujeres postmenopáusicas con ganglios linfáticos axilares positivos.
Limitaciones:
•El principal inconveniente es que estratifica a los pacientes en tres grupos
y no está claro cómo debe ser el manejo del grupo intermedio
MICROARRAYS
FIRMAS GENÓMICAS
Patología mamaria
PAM 50 (ARUP laboratorios)
49 genes, basada en la clasificación genómica del cáncer de mama publicada
por Charles M Perou y colaboradores.
Se identifican los distintos subtipos genómicos, a saber; Luminal A, Luminal B,
Her2 enriched y Basal-like.
Uso:Los distintos subtipos tienen características propias, orientando:
•La naturaleza del tumor
•Las opciones terapéuticas,
•El pronóstico.
Limitaciones:
•La principal limitación, es que la firma no identifica el subtipo claudin-low
recientemente descrito.
MICROARRAYS
CONCLUSIONES
Desde los años 90 los microarrays han contribuido al conocimiento de las bases
moleculares de muchas patologías.
 La introducción de estas técnicas a la práctica clínica, ha representado un
complemento importante para las técnicas convencionales, ya que constituyen
una forma rápida, sencilla y cada vez más económica de diagnóstico.
 Esto ha sido especialmente notorio en el ámbito de la citogenética donde los
array-CGH han supuesto un cambio irreversible en cuanto a los métodos
diagnósticos, si bien no han suplantado a la genética convencional.
En otros campos, como la microbiología, oftalmología, etc., los microarrays han
demostrado tener un alto potencial en cuanto a su capacidad diagnóstica y
aunque su aplicabilidad aún no está plenamente validada, su utilización es cada
vez mayor