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Microbiología II
Tema
Prueba de ELISA
OBJETIVO
Conocer la técnica de ELISA, su
fundamento y algunas aplicaciones en
particular para la detección del virus de
sida por medio de esta técnica.
•
Breve repaso de anticuerpos y antígenos.
El sistema inmune de los mamíferos evoluciono para
reconocer y destruir la variedad de patógenos (y sus
variaciones antigénicas) a lo que los organismos deben
enfrentarse a lo largo de la vida.
•
Los elementos básicos de este reconocimiento lo
constituyen los linfocitos B y T, y las células
presentadoras de antigéno: los dos primeros
evolucionaron de forma tal que sus receptores para
antigenos pueden reconocer de manera específica
virtualmente cualquier molécula biológica.
•
Inmunización es un proceso, natural o artificial,
mediante el cual un individuo competente desarrolla
una respuesta inmune al entrar en contacto con un
antígeno.
• Antecedentes de la técnica
•
La detección de la reacción antigéno- anticuerpo.
•
Método sencillo, de alta sensibilidad y especifico, con posibilidad
de ser automatizados y pueden ser realizados en laboratorios sin
grandes recursos técnicos.
•
Dentro de los factores que han propiciado la expansión de este
método se encuentra:
El desarrollo de la industria del plástico, que género materiales
con características de adsorción definidas y reproducibles.
•
Las características y desarrollo de métodos de purificación de las
enzimas que se emplean como marcadores.
•
el desarrollo de métodos más sencillos y confiables de
conjugación de anticuerpos a las enzimas marcadores
Principio de la técnica
• (Enzyme Linked Immunosorbant Assay) fue
descrito en 1971 por Engvall y Perlman.
• Método que utilizan los anticuerpos
conjugados con una enzima, conserva su
capacidad de unión especifica al antígeno al
antígeno.
• La enzima es capaz de una reacción de oxidoreducción.
• EL sustrato se transforma en un producto
colorido.
Descripción de la técnica.
• El ensayo inmunoadsorbido ligado a enzima
(ELISA), técnicas serologías más utilizada.
• Hay dos métodos básicos:
• La técnica de sándwich de doble anticuerpo.
• Ensayo indirecto inmunoadsorbido ligado a
enzima para la detección de anticuerpos.
Método del sándwich de doble anticuerpo.
• Adsorciòn del antisuero a la superficie de los posillos de una placa de
microtitulación.
• El antigéno se añade y reacciona específicamente con los anticuerpos
adsorbidos a los posillos, el antigéno será retenido a pesar de los lavados
que se realicen para eliminar el antigéno libre.
• Anticuerpo específico para el antigéno, el segundo anticuerpo, para el
antigéno.
• Sándwich.
• Con el antigéno entre las dos moléculas del anticuerpo.
• Es visible el segundo anticuerpo añadido está unido a una enzima.
• Peroxidasa de rábano
• Fosfatasa alcalina.
• La actividad enzimática se pone de manifiesto por un cambio de color,
negativo ya que todo el antígeno no unido se elimina al lavar.
Ensayo indirecto inmunoadsorbido.
• En el primer paso de este método se adsorbe el
antígeno,
• Anticuerpos, a las paredes de la placa.
• Muestra de un suero contiene anticuerpos frente a este
antigéno se añade el antisuero a los posillos. se lava y se
añade entonces anti-Ig humana (un anticuerpo que
reacciona con cualquier inmunoglobulina humana), que
se unirá al complejo antígeno-anticuerpo.
• La antiIg humanan. que no se ha fijado es lavada y se
añade entonces el sustrato adecuado para la enzima.
Algunas aplicaciones de la técnica.
•
Determinación de la tirosina.
•
Digoxina, B- metildigoxina, alfa acetilcolina; B –
acetildigoxina.
•
Insulina.
•
Alfa -1-fetoproteina.
•
Tiroxina serica.
•
Tridoyotironina.
• El desarrollo de anticuerpos monoclonales
ha hecho posible por primera vez el
diagnostico de enfermedades de
transmisión sexual producidas por
clamidias.
• El uso de sondas de DNA, aunque no
sean pruebas serológicas, resultará cada
vez más útil para la detección de
patógenos en tejidos o alimentos.
Introducción hacia el SIDA
•
Bacterias, hongos y virus muy comunes que ordinariamente no
ocasionan enfermedad.
•
VIH.
•
Sangre, esperma, saliva, lágrimas, tejido nervioso, leche materna,
y secreciones del tracto genital.
•
La transmisión: contacto sexual incluyendo el sexo anal, vaginal
y oral; por medio de la sangre mediante transfusiones o aguja
infectada; y en mujeres embarazadas al feto, o al dar de mamar
al bebé.
•
Métodos mas raros de transmisión incluyen el pinchazo accidental
con una aguja, la inseminación artificial, en la que la transmisión
ocurre a través del esperma donado, y el transplante de riñón, en
el que el transmisor es el riñón donado.
El virus (VIH) es un
retrovirus, que presenta
hebras de ARN y una
enzima, la transcriptasa
reversa. Posee, además,
una proteína específica,
la GP120, membranolítica
en su capa externa, que
le ayuda a perforar la
membrana de la célula
atacada y penetrar en
ella. En el caso del VIH la
célula parasitada es el
linfocito T4.
• Retrovirus del Sida por el
•
linfocito T4 se debe a que
éste presenta en su
superficie un marcador
específico que le permite
al virus reconocerlo.
El proceso posterior a la
invasión es el típico de
infección por virus:
transcripción de su
genoma al ADN del
huésped, obligando a
éste a réplicas sucesivas
hasta destruirlo, saliendo
luego un gran número de
individuos a parasitar a
otros linfocitos T4.
• Copia la información
genética de él mismo,
de modo que pueda
integrarse en el
propio código
genético de la célula
huésped, lo que hace
que cada vez que se
divida, una célula
huésped, se
reproducirán copias
virales, cada una de
ellas con el código
viral.
Aplicación de la técnica de ELISA, para la
diagnosticación del SIDA
Elaboro: Cruz Cruz Ma. Candelaria.
Bibliografía
• Albert L. Lehninger, PRINCIPIOS DE BIOQUIMICA, 2 ed., ediciones Omega, España,
1995 (pag 145).
• Gerard J. Tortora, INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÌA, editorial Arribia, S.A ,
España , 1993 (pag. 448-449).
• Aldo A. Guerci, LABORATORIO METODOS DE ANALISIS, 4 ed, editorial Librería el
Ateneo , Argentina, 1988 (pag. 457- 475).
• Jorge V. Gavilondo Cowley, ANTICUERPOS MONOCLONALES, editorial Elfos, México,
1995 (pag 71-76, 148-151).
• Vicente T. Devita, SIDA, 2ª , editorial Salvat editores, S.A España , 1990 (pag 123•
133).
http://www.tuotromedico.com/temas/sida_diagnostico.htm
• http://www.utem.cl/trilogia/Volumen_16_n_25_26/p_16_1.htm