Download Resultado

¿Cómo presentar un artículo original de
investigación?
Alfredo Prieto Martín
Professor in Immunology at Alcalá University
Coordinator of Post grade program in Immunology
Consultant in the field of Problem Based Learning
Administrator of:
Web site on PBL
http://www2.uah.es/problembasedlearning
WebBlog site on PBL: http://www.e-pbl-es.tk
Contact me at : [email protected]
or http://www.alfredoprieto.tk
Unidad mixta
CSIC/UAH
Un ejemplo con metodología al
descubierto
Meta mensaje= lo que tienes que contar
Cómo lo muestras
Empieza contándoles
de que vas a hablar
El tema de la presentación
Resumen
Resume el trabajo: ¿Qué hicieron?
• A pacientes con melanoma metastásico, se les extraen linfocitos T, se
seleccionan los antitumorales, se expanden y se reinfunden al paciente
tras la quimioterapia.
• Los tumores regresan
Linfocitos
antitumorales
Pacientes con
melanoma
Linfodeplección
del paciente con
quimioterapia
Reinfusión en
Individuo
linfopénico
Repoblación y
Agresión
al tumor
Resumen
¿Qué han encontrado?
• Las células T reinfundidas proliferan in vivo y
repueblan persistentemente a los pacientes, infilttran
los tejidos tumorales y provocan su regresión asi
como la destrucción autoimmune de melanocitos.
Inmunidad
antitumoral
Reinfusión
Proliferación e
infiltración
del tumor
1$
Autoinmunidad
¿Qué significa?
Resumen
• Esta aproximación permite tratar a pacientes cuyo SI
no es capaz de eliminar un cáncer o una infección
incurable como el HIV
Cáncer
Reprogramación
inmune
Inmunidad
antitumoral
Inmunidad
antiinfecciosa
HIV
Infection
Aporta background a tu audiencia
Introducción a la Introducción:
1. Melanoma
–
–
2.
3.
4.
5.
Estadiaje
Terapia e inmunoterapia
Inmunoterapia adoptiva
Reordenamientos TCR y Pruebas de clonalidad
Crecimiento homeostásico
5. Mecanismos de la inmunidad antitumoral
Introducción a la Introducción
1. Melanoma
concepto
• Tumor de melanocitos
Imagen de Internet
• Tumores altamente metastásicos, primero a ganglios
después a vísceras y tejido nervioso
• Causa: exposición intermitente al sol en gente con
piel clara
• 1 de cada 74 WASP los desarrollan en USA
Introducción a la Introducción
Melanoma-vitíligo
Imagen de Internet
La Inmunidad Antitumoral
Es un tipo benéfico de autoinmunidad
Introducción a la Introducción
Tratamiento del melanoma:
•Quimioterapia no funciona
•Inmunoterapía
–IFNa
–IL-2
–Terapia celular adoptiva
Introducción a la Introducción
2. Inmunoterapia celular adoptiva
(ACT)
• Se lleva intentando desde los 80 sin resultados
clínicos espectaculares.
• Funciona in vitro y en ratones pero hay pocos
resultados clínicos en humanos.
– Vida corta de las células T infundidas.
– Baja tasa respuestas parciales en melanoma metastático
estadio 4 (5-15%).
4. Crecimiento
• Proliferación de linfocitos
T maduros sin necesidad
de estimulación
antigénica.
• Se estimula en situación
de linfodepleción.
• Il-7, IL-15 e IL-21 son
factores de crecimiento
homeostásico muy
importantes.
homeostásico
Introducción a la Introducción
INMUNOTERAPIAS CELULARES
ADOPTIVAS: TIL, LAK
• SA Rosenberg pionero e impulsor
• Extracción TIL PBL, selección y
expansión in vitro de células
antitumorales
• Se han abandonado tras décadas de
esfuerzos infructuosos (SanchezMateos P. SEI 2002)
• Science Octubre 2002
Introducción
Introducción I:
¿por qué y qué?
• ¿Por qué?
•
Explica las razones por las que el estudio
fue realizado
• ¿Qué?
•
Establece la cuestión respondida por el
trabajo
¿Por qué hacerlo?
Porque actualmente no hay ningún
tratamiento eficaz contra el
melanoma metastásico
¿Qué prueban?
¿Contribuirá la Quimioterapia al
eliminar a los linfocitos a crear un
mejor ambiente para la expansión
in vivo de células antitumorales?
Materiales y métodos
Establece la aproximación
experimental
¿Qué se hace y qué se mide?
• Linfodepleción del paciente por quimoterapia
• Activación de linfocitos antitumorales in vitro
– Demostración de su capacidad antitumoral
– Expansión in vitro
• Expansión in vivo de los linfocitos antitumorales en el
huésped
– Deplecionado de células T maduras
– El injerto T se expande el numero de células T efectoras
antitumorales se amplifica in vivo
• El efecto antitumoral es muy intenso y efectivo
Materiales y Métodos:
Background e ilustraciones didácticas
detalladas sobre cómo lo hicieron
1. Protocolo
2. Métodos de selección y expansión
3. Estudio de efectos terapéuticos y
secundarios
Linfodepletion followed by adoptive cell
transfer (L+ACT) and IL-2 treatment
1. TIL Extraction
Cell Activation
Clone expansion
and demonstration
of antileukemic
activity
3. T Cell Administration
Clinical response
(heterogeneous populations)
T
Cell
Célul
a T
T Cell
T
Cell
Célul
T Cell
Célul
a T
+IL-2 high dose
a T
2. Lymphodepletion
Ciclophosphamide
+ Fludarabine
25%
50%
mixed responses
Objective Responses
11.5% complete responses
Materiales y métodos
2. Selección y expansión de
linfocitos T antitumorales
Cytokine release assay induced by
-autologous tumor cells
Expansion with
OKT-3 allogeneic
feeder + IL-2 6000 UI/ml
+
-
In vivo
IL-2
Reinfusión
Materiales y métodos
3. Estudio de efectos: caracterización de los
linfocitos expandidos e infundidos
1. Correceptores CD4/CD8
2. Actividad citotóxica
3. Especificidad antigénica, reactividad
•
•
•
Capacidad de unión a tetrámeros con ag de melanoma
Actividad lítica específica
Producción citocinas
4. Región variable de la cadena b (Vb)
Materiales y métodos
Estudio de efectos terapéuticos y
secundarios
• Efecto terapéutico
– Respuesta completa desaparición completa del tumor
– Respuesta parcial (PR) Reducción >50% diámetros
de todas las metastasis observables6/13
– Respuesta mixta (MR) Regresión de algunas
metástasis 10/13
• Efectos secundarios (Autoinmunidad)
– Vitiligo depigmentación autoinmune por destrucción
de melanocitos
– Uveitis inflamación de la uvea
Resultados (y más)
1. Muestra el método, diseño experimental,
resultado y conclusión de cada experimento
– en la misma diapositiva en la que se muestran los
resultados del experimento
– No olvides el significado del resultado: la conclusión
Resultados
Índice Experimentos
1.
2.
3.
4.
5.
Demografía población pacientes
Repoblación linfoide
Clonalidad de la repoblación Vb y CDR3
Persistencia de las células transferidas
Especificidad y función efectora de las células
transferidas
6. Efectos clínicos: manifestaciones antitumorales y
autoinmunes
7. Hallazgos anatomo-patológicos infiltración anti
tumoral de repertorio restringido
2. Repoblación linfoide:
Resultados
Método: linfodepleción, reinfusión, recuentos seriados de cifras linfocitos y neutrófilos
Resultados Evolución temporal de las cifras de linfocitos (ALC,) y
neutrofilos (ANC, Ο) cifras resurgen y se mantienen altas.
Conclusión Los linfocitos reinfundidos repueblan al paciente, linfocitosis y
3. estudios de clonalidad
(background)
–TCR es responsable de la Reactividad
inmune de los linfocitos T.
–Región variable beta (Vb) expresada
por los linfocitos T ab
–Cada linfocito expresa una de 23
posibles
–En un repertorio policlonal cada Vb es
expresado por un pequeño porcentaje
de linfocitos T
–Un repertorio oligoclonal indica que
algunos clones están muy crecidos
determinados Vb estan muy elevados
Resultados
3. Estudios de clonalidad
• Objetivo:
• Uso de genes Vb del TCR en linfocitos CD8 + infiltrantes de
tumor (TIL) y linfocitos de sangre periférica tras el
tratamiento.
•Método:
• Para investigar el destino de las células T transferidas se
examinó la región variable del TCR usando anticuerpos
específicos frente a regiones variables de su cadena beta (Vb)
para medir el % de linfocitos T que expresan cada una de las
23 regiones Vb
3. Estudios de clonalidad
Resultados
Resultado
Vb expression
was
highly skewed (underlined and bold) in 5 of
the 6 administered TIL,
and some of these same
Vb families were also
over represented in the
PB of the patients at one
week after cell transfer,
Conclusión: Los clones derivados de los TIL injertan persistentemente. Linfocitos
de sangre repoblados provienen de los clones predominantes en los TIL y persisten.
Fenotipo blástico de los PBL Resultados
de pacientes reinfundidos
Método Blood smears from pat 9 (left) and pat 10 (right)
during the lymphocytic episodes
Resultado they showed the highly activated phenotype of the
lymphocytes, which contain irregular and hyperchromatic nuclei, high
nuclear to cytoplasmic ratio and toxic granulation.
Conclusión los linfocitos infundidos mantienen su proliferación in vivo
Mecanismos de la inmunidad
antitumoral (background)
•
•
•
•
•
Los linfocitos TCD8 reconocen antígenos en
moléculas de histocompatibilidad de clase I
presentados por células de melanoma y las
matan.
El tejido tumoral se inflama y atrae más
leucocitos: APCs y linfocitos T.
El alelo más frecuente de la molécula HLA-A
es el A2
HLA-A2 presenta eficientemente antígenos
de melanoma bien caracterizados.
Tetrámeros HLA-2 pueden cargarse con
péptidos antigénicos de melanoma
a1,2,3
HLA-A2
Ag.
Gp100
MART-1
b 2m
Resultados
4. Persistence of the MART-1 reactive clones
Método marcaje con antiVB y tetrameros HLA-A2/MART-1
Diseño PBLs from patients 9 (left) or 10 (right) were analyzed by FACS using
antibodies against specific TCR Vbfamilies (Vb7, ; Vb12, ; Vb14, ;
average of other Vb ) or HLA-A2/MART-1:26-35(27L) tetrameric complexes
(A2/MART tetramer, ).
Resultado Las células VB12 son antiMART. Las células antimelanoma
dominan en los PBL tras 4 meses.
Conclusión La repoblación con células antimelanoma es persistente por más
5. Mecanismos de la inmunidad
antitumoral
• Linfocitos T CD4 al reconocer antígenos
tumorales producen IFN.
• El IFN induce sobrexpresión de moléculas de
histocompatibilidad de clase I y II en las células
tumorales.
• Esto es un suicidio para las células tumorales si
el tumor esta infiltrado por linfocitos T
antitumorales.
5. Función de células T Resultados
transferidas: Secreción de interferón 
Método PBL collected 9 days (pat 9, left, pat 10, right) after cell transfer were
cultured overnight in the absence (striped boxes) or presence (solid boxes) of
600 IU/ml IL-2, washed, and tested for cytokine release
Diseño Se usan distintas APCs para estimiular la secrección
Resultado Responden a antígenos de melanoma presentados en HLA-A2.
Conclusión secretan IFN en respuesta a melanoma, IL-2 aumenta secreción
5. Actividad Citotóxica
Resultados
Método: lisis de de células de melanoma marcadas radioactivamente
TIL
PBL
after
PBL before
Resultados The infused TIL () and PBL collected 7 days after cell transfer
(), but not pretreatment PBL () from patients 9 (left) and 10 (right)
specifically lysed the HLA-A2 + melanoma cell line 526 (lower graphs) but not
the HLA-A2 - 938 (upper graphs).
Conclusión La infusión con TIL genera actividad CTLMHCI restricta por HLAA2.
Resultados
6. Manifestaciones Antitumorales de la
transferencia de linfocitos T anti-MART-1
Método Tomografía computerizada
Conclusión los linfocitos transferidos pueden eliminar
metástasis
Resultados
6. Efectos secundarios: vitíligo
manifestaciones autoinmunes: As cancer regressed in the
lower extremity of patient 9, patchy areas of vitiligo
appeared as shown on the forearm.
Conclusión los linfocitos transferidos agreden no solo a
células de melanoma también a melanocitos cutáneos
normales
Resultados
7.
Efecto del tratamiento en los nódulos tumorales:
Metodo inmunohistoquímica en nodulos tumorales
Conclusión La infusión induce: 1) Infiltration by CD8+ T
cells,2) Expression of MHC I y II by tumor cells
scant CD8 + cells
strong stromal cell
staining but weak of
tumor cells
sporadic staining
(macrophages) but
minimal of tumor cells
diffuse CD8 + infiltrate ubiquitous expression in tumor cells
Resultados
7. Inmunopatología en nódulos tumorales:
repertorio de linfocitos infiltrantes
Metodo inmunohistoquímica en nodulos tumorales
Resultados A resected tumor nodule (p9 day 20) shyows infiltrating CD8 + Vb12 +,
but no Vb7 + T lymphocytes. Similarly, a residual tumor nodule biopsied (p10, day 14)
contained areas densely infiltrated by CD8 + Vb7 + T cells but few Vb12 +.
Conclusión Los linfocitos infiltrantes en los nodulos tumorales expresan los mismos
VB de los TIL originales
Discusión
1. Sipnosis
de
resultados
lista
compuesta de las conclusiones principales
de los experimentos más relevantes.
2. Integración de resultados
3. Aplicaciones e implicaciones
4. Repercusiones y recomendaciones
1. Sipnosis de los resultados yDiscusión
conclusiones
1. Células tumorales pueden usarse para activar TIL que
pueden expandirse in vitro
2. La reinfusión en el paciente linfodeplecionado provoca
repoblación persistente por células eficaces en la
eliminación de células tumorales
3. Las células antitumorales son capaces de detener el
crecimiento del tumor localmente en un 75% de los
pacientes tratados y en casi un 50% de los pacientes son
capaces de detener su crecimiento en todo el organismo y
destruir mas de un 50% de la masa tumoral
Discusión
2. Integra los resultados de los experimentos
en un mensaje más global
•Los autores demuestran que la terapia con linfocitos
antitumorales en huéspedes linfodepleccionados es la mejor
terapia para el melanoma metastático
Discusión
3. Discute las aplicaciones e implicaciones
• Esta aproximación puede ser igualmente exitosa en
otros contextos
• Inmunoterapia de otros tumores
• Inmunoterapia de infección por HIV y HCV
Discusión
4. Repercusiones
La repoblación linfoide con células
antileucémicas expandidas in vitro en
pacientes linfodeplecionados tiene un enorme
potencial como terapia antitumoral
Los investigadores en el campo no debemos
dejar escapar una oportunidad así
Créditos
• Búsqueda bibliográfica y recursos on line
Eduardo Reyes
• Animaciones y transiciones
David Díaz
• Guión y coordinación
Alfredo Prieto
Bibliografía y webgrafía
• Manuales y diccionarios que has utilizado
• Direcciones de los sitios web de los que has
obtenido información
Facilitar a tu audiencia el acceso a
las fuentes de información que has utilizado
Cuestiones
Hemos visto
1. Como ordenar la presentación de un artículo
2. La introducción a la introducción es muy importante
3. Hay que aportar imágenes para ilustrar la introducción y
los materiales y métodos.
4. Como contar un experimento recapitulando su
background e integrando si es posible en una
diapositiva: método, diseño experimental resultado y
conclusión.
No olvidéis
• Presentación del articulo
1. Definir la cuestión a la que responde el artículo
2. Aportar background para comprender el
contexto de esta cuestión y por que es
importante
3. Cuando sea útil mostrar los modelos y diseños
experimentales
4. Presentar los datos de las figuras describir como
se realizan los ensayos y las conclusiones que se
alcanzan.
Ejercicios Evaluación de vuestro
artículo
1. Evaluar el artículo que presentéis:
2. Comentar los aspectos fuertes y débiles que
encontráis en el abordaje y el diseño
experimental
3. Juzgar si están bien soportadas y justificadas las
conclusiones
4. Describir asuntos pendientes o cuestiones o
nuevas áreas que el artículo abre para estudios
futuros.