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Estructura tridimensional de
macromoléculas :
su determinación usando
difracción de rayos X
o se trata de biología
estructural…?
Las estructuras
secundarias y terciarias
de las macromoléculas,
conllevan información
clave para determinar las
funciones bioquímicas y
celulares
mioglobina
Proteína A
Sitios activos en 3D
Diagrama 2D
Ecosistemas
Comunidades
Ecología
In vitro
In vivo
Poblaciones
Organismos
Fisiología
Tejidos
Histología
Células
Molécula
s
Atomos
Biología celular
Biología molecular / bioquímica
Biología estructural
Biología estructural
Técnicas biofísicas :
•Cristalografía de rayos X
•Calorimetría
•Microscopía electrónica
• ≠ técnicas
espectroscópicas (CD, EPR, …)
•RMN
•Espectroscopía de masa
•Dispersión de luz
•Espectrofluorometría
•………….
Biología estructural
La estructura 3D de moléculas
biológicas nos permite
contribuir a entender :
•qué moléculas interactúan?
cómo?
•rearreglos conformacionales
disparados por la interacción
•cómo hacen las enzimas para
catalizar reacciones?
…para describir la forma (y la topología)
de algo, lo mejor es…
MIRARLO!
Es muy pequeño?…
usá un microscopio …
lentes
imagen
objeto
… pero… el problema del límite de resolución!
Tamaños relativos entre el objeto a estudiar y la
longitud de onda
Espectro electromagnético
La longitud de onda de los rayos X usados en cristalografía :
1Å - 3Å (Å = 10-10m) ; lo más típico 1.54Å (Cu )
Frecuencia = c/l =(3x108m/s) /(1.54x10-10m) ≈ 2x1018 s-1
… pero, no podemos (aún?) fabricar un
microscopio de rayos X :
•no hay lentes
•aun si las tuviéramos, deberíamos poder
pulirlas con una precisión mejor a 0.1Å!!
Necesitamos aprender a interpretar los
patrones de difracción de rayos X (no
refocalizados), para reconstruir la
distribución de densidad electrónica que
difractó
Proteína purificada
Cristales
Difracción de rayos X
Obtención de fases
Mapa de densidad
electrónica
Construcción de modelo
Refinamiento
Validación
Institut Pasteur de Montevideo
X RAY DIFFRACTION FACILITY
Setup experimental para hacer
difraccion de cristales unicos
Resultado experimental:
estructuras a resolucion
atomica
Qué es un cristal?
•La materia se clasifica en gases, líquidos y
sólidos
•(también hay mezclas homogéneas que están
digamos "en el medio"!! coloides, sólidos
amorfos, etc)
•Sólidos: volumen fijo, incompresibles,
comportamientos anisotrópicos
interacciones
intermoleculares
fuertes
orden
Orden
•Explica el comportamiento anisotrópico
(óptico, mecánico, magnético, eléctrico, etc)
•Arreglo ordenado a largas distancias entre
moléculas
(simetría,
capas
o
planos
moleculares)
Estructura cristalina = motivo * red cristalina
Orden
Estructura cristalina = motivo * red cristalina
cristal
molécula
celda unidad
Teoría
Los diagramas de fase grafican la
solubilidad de las proteínas bajo
distintas condiciones
Teoría
•Saturación las velocidades de pérdida/ganancia de las fases
sólida y líquida son iguales, el sistema está en equilibrio
•Salting-out región derecha del diagrama, la solubilidad de la
proteína se reduce a medida que la concentración de sal aumenta
•Salting-in región izquierda del diagrama, la solubilidad de la
proteína aumenta con la concentración de sal
Qué es lo que queremos?
Agregación ordenada!
La sobresaturación controlada aumenta la
probabilidad de nucleación
Métodos
Experimento de difusión de
vapor
pequeños
volúmenes
de
precipitante y de proteína son
mezclados en una gota que se deja
equilibrar contra un reservorio de
mucho más volúmen conteniendo
precipitante
u
otro
agente
deshidratante
gota colgante
gota sentada
sandwich
Tipico setup de difusión de vapor
Experimentos de
diálisis
Experimentos en batch
Se pueden usar diferents
relaciones prot/precipitante
Aún sin cristales…
Veamos un
experimento de
difusión de vapor
Cristales creciendo!!!
…o un
experimento
en batch…
Ahora A, B y C
son distintos
experimentos
región de salting-in
…o diálisis
cambiando buffers
región de salting-out
Condiciones de screening
Los parámetros que típicamente son variados:
•Concentración de proteína (comenzar lo más alto posible)
•Precipitante (PEG’s, SA, solventes, sales concentradas, etc)
•Presencia de sales (u otros “aditivos”)
•pH y tipo de buffer
•Temperatura
Condiciones de screening
Estrategias de screening :
•Factorial completa
•Factorial incompleta
•Aleatoria
•Rala ("sparse")
Calidad de la proteína
•Está pura?
•el requisito más importante
•hacer (SDS-PAGE, MS) + (SEC, IEC)
•Está plegada correctamente?
•testear actividad si se tiene un ensayo
•testear el espectro CD (o PAGE nativo)
•Es fresca?
•Es monodispersa?
•monodispersión significa que la proteína existe en solución
como una única especie de estructura terciaria/cuaternaria
determinada (homogeneidad conformacional)
•usar una columna de exclusión por tamaño (SEC) como
último paso de purificación
•usar dispersión de luz (DLS o SLS) como control de calidad
Observación
Hay ± 9 cosas distintas que se pueden llegar a ver, a veces
combinando más de una en la misma gota
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Gotas claras
Materia
Precipitado
Geles
Piel
Separación de fases
Aceites
Esferulitas
Cristales
Precipitado microcristalino
1D - agujas
2D - placas
Algunas fotos…
…algunas más…
Optimización
Cuando se llega a identificar algo "interesante"
se procede a
•Rastrear alrededor de la condición ("afinar")
•Usar aditivos
•Sembrar gotas frescas preequilibradas, con el
material "interesante" : micro and macro-seeding
un cristal demasiado observado nunca crece!!
Tomar la primer foto!
El único requerimiento para considerar un cristal de proteína
como 'bueno' es que difracte
La difracción depende de :
Tamaño
•La intensidad de dispersión es proporcional al número de
celdas unidad en el cristal
•El N° de celdas unidad es proporcional al volúmen del
cristal (duplicando todas las dimensiones de un cristal cúbico
dará reflexiones ~8 veces más intensas)
•El N° de celdas unidad de un cristal depende del tamaño de
las celdas (tamaño de la proteína, cuan compacto sea el
empaquetamiento, N° de proteínas en la unidad asimétrica,
simetría)
Orden
•La difracción depende de cuan idénticas son las celdas
Tomar la primera foto!
•Encontrar la concentración mínima de crio-protector
para el licor madre (criocristalografía)
•Poner el cristal en la solución crioprotectora por x
tiempo, y montarlo en un loop
no hay difracción
débil (anisotrópica)
10 Å
Fuerza
•Colectar una imagen con un prometedora
ángulo de oscilación
4.5-6 Å
grande. Si el cristal es de sal, los puntos
van a estar bien alejados <
y podrían
buena
3Å
no verse
toma un ángulo pequeño.
Calidad
de si
lasedifracción
cristal múltiple / split
Si lamentablemente es sal,
se verán
muy
cristal
único puntos
muy mosaico
Calidad
intensos difractando
aun a muy
alta
resolución (celdas
cristal
único
unidad muy pequeñas, bien ordenadas)
Sabemos entonces por qué usamos rayos X …
Pero por qué obtenemos densidad electrónica?
Qué son los rayos X?
Fotones = un campo eléctrico oscilante*
*también un campo magnético oscilante de la misma
frecuencia, pero ortogonal y desfasado 90°
Qué son los rayos X? Fotones. Un campo eléctrico oscilante
E
a
t
Amplitud
(fase)
long. de onda
E(t) = A cos(wt + a)
w=2pc/l
Un electrón en un campo
eléctrico oscilante
Los electrones e- orbitan a una velocidad aprox
1/100th c (≈2x106m/s),
Por lo que en un ciclo del haz de Rx, e- viajará
2x106m s-1 / 2x1018s-1 = 10-12m = 0.01Å (no mucho
comparado al tamaño del átomo)
En otras palabras, los Rx ven a los e- como si
estuvieran quietos.
e- oscilan en un campo eléctrico...
•la oscilación de e- tiene la misma frecuencia que los Rx
•la oscilación de e- es mucho más rápida que el
movimiento de orbitado
•la amplitud de la oscilación de e- es grande porque la
masa de e- es pequeña. Los núcleos atómicos no oscilan
apreciablemente
E
e-
e-
ee-
e-
e-
e-
e-
t
e-
…cargas en oscilación crean
fotones!
hn
e-
Å
…en todas direcciones
Esto es DISPERSION!
e-
En el fenómeno de dispersión hay al menos
3 efectos :
•Fotoeléctrico --->> absorción
•Compton (interacción incoherente)
•Thompson o difracción de Bragg
(coherente, elástica)
Dispersión de Thompson
I  I0
e4
2r2m2c4
(1 + cos2)
Por qué necesitamos cristales para ver
difracción?
•Amplificación de la señal
….(efecto de interferencia a tener en cuenta!)
cristal
molécula
celda unidad
Difracción:
Cada electrón dispersa
Las ondas emitidas se suman … y se restan!!
El resultado final depende de las fases relativas de las ondas
adicionadas en cada dirección
Ley de Bragg :
nl = 2d sin 
Usar el sitio interactivo
http://www.journey.sunysb.edu/
ProjectJava/Bragg/home.html