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Xenotrasplante de islotes porcinos
y células de Sertoli en pacientes
diabéticos tipo 1.
Dr. Rafael Valdés González-Salas
Laboratorio de Xenotrasplantes,
Hospital Infantil de México Federico Gómez,
México, D.F. MEXICO.
Antecedentes
Antecedentes
•
•
•
•
•
Diabetes en México.
Evolución del tratamiento convencional.
Evolución del esquema intensivo
Trasplante de islotes (alogénico).
Trasplante de islotes (xenogénico).
Justificación
• Aún con el esquema intensivo las
complicaciones aparecerán.
• En transplantes alogénicos:
–
–
–
–
–
–
–
Escasez de donadores cadavéricos.
Mayor riesgo de transmisión de enfermedades.
Complicaciones quirúrgicas
Daño hepático
Alto costo del tratamiento inmunosupresor
Alto riesgo de complicaciones secundarias
Tiempo de sobrevida corto
Xenotrasplante
• Riesgo de infección por Retrovirus
Endógeno Porcino (PERV)
• Otras zoonosis
Retos del Xenotrasplante
• Supervivencia de las células implantadas:
– Rechazo inmunológico
– Factores no inmunológicos
• Compatibilidad funcional de las células
implantadas
– De la insulina porcina y otras hormonas
– De los sistemas reguladores humanos
Diseño Experimental
a) Creación de un sitio inmunológicamente
privilegiado:
• Dispositivo
• Formación de colágena autóloga
• Inmunomodulación por células de Sertoli
b) Trasplante Islotes + Sertoli
Dispositivo
Usamos un dispositivo diseñado en
nuestro laboratorio, que consiste en un
cilindro de malla metálica de 6 cm de largo,
con dos tapones de polipropileno, uno de
ellos con un émbolo que llena el cilindro.
Implante del dispositivo
Dos meses antes del xenotrasplante,
dos a cuatro dispositivos fueron
implantados subcutáneamente en la
pared abdominal anterior.
Procesamiento de Islotes y Sertolis
Se utilizan
cerdos de 7
días de vida
El páncreas y los testículos son
macerados y digeridos con una
solución de Liberasa HI.
El páncreas es
removido
inmediatament
e después de
eutanasia por
exanguinación.
Los islotes y las Sertolis
son cultivados
separadamente a 37°C
Control de calidad
La pureza de los islotes
es de 88%
Con tinción de Ditizona.
La viabilidad es determinada por
tinción de ioduro de propidio
(Islotes:94%, Sertoli 95%)
Funcionalidad:
Pureza de Sertoli 93.6%:
por MIS y sox9.
Índices de
estimulación de
Islotes =11.5
Apoptosis (Islotes: 4.8%,
Sertoli 10.5%)
Cytometría de flujo contra
Annexina
Sertoli:
detección de
Closterinas
Diseño Experimental
•12 adolescentes con Diabetes Tipo 1
•Consentimiento Informado:
– Reclutamiento totalmente
voluntario
– Pronóstico con
tratamientos actuales
– Procedimiento
Experimental
– Objetivos
–
–
–
–
Metas
Riesgos
Costo económico
Obligaciones del
voluntario
– Obligaciones del Hospital
Bioética
• Instituciones revisoras:
– Comisión Nacional de Bioética
– Facultad de Medicina, UNAM
– Hospital Infantil de México Federico Gómez
Bioética
• Cumplimiento de la declaración de Helsinki
– “Art. 32. Cuando los métodos preventivos,
diagnósticos o terapéuticos disponibles han
resultado ineficaces en la atención de un enfermo,
el médico, con el consentimiento informado del
paciente, puede permitirse usar procedimientos
preventivos, diagnósticos y terapéuticos nuevos o
no probados, si, a su juicio, ello da alguna
esperanza de salvar la vida, restituir la salud o
aliviar el sufrimiento. Siempre que sea posible, tales
medidas deben ser investigadas a fin de evaluar su
seguridad y eficacia. En todos los casos, esa
información nueva debe ser registrada y, cuando
sea oportuno, publicada. Se deben seguir todas las
otras normas pertinentes de esta Declaración..”
Diseño Experimental
• Monitoreo:
–
–
–
–
–
Requerimientos de insulina exógena
Hemoglobina glicosilada
Insulina porcina circulante
Antígenos Anti a-Gal y hemolíticos de cerdo
PERV (incluyendo familiares cohabitantes)
• 1 dispositivo removido 3-5 años después, para
permitir el retrasplante y tratar de obtener
independencia de la insulina.
– Detección inmunohistoquímica de:
• Células positivas a Glucagon
• Células positivas a Insulina
• Células positivas a CD3, CD4 y CD8
• Células positivas a MIS y sox9 (Sertoli)
Seguridad
• Medidas de seguridad de los animales en la
granja:
–
–
–
–
–
Granja cerrada y aislada (5km).
Red contra aves.
Barreras contra roedores.
Programa extensivo de vacunación
Cuarentena estricta (Baño de entrada – Baño de
salida).
– Monitoreo de salud aleatorio.
– Registro e identificación detallada de cada animal.
Seguridad
• Medidad de seguridad de los animales donadores.
• Tamiz microbiológico para:
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
Aujeszky (elisa)
Erisipela (elisa)
Salmonella sp.(elisa)
Salmonella sp.(cultivo de hígado y válvula ileocecal)
Brucella a. (aglutinación).
Influenza Porcina (inhibición de aglutinación)
Leptospira (microaglutinación 16 especies).
Mycoplasma hyopneumoniae (elisa)
Coronavirus (elisa)
Toxoplasmosis (elisa)
Contingencias
Observ. Clínica o
de Lab
sospechosa
Contactar
familias y
Personas
cercanas
Reunión
de
Persona
l
Granja
Productora
Manual de
bioseguridad de
la granja
Secretaría
de Salud
Instituciones
Externa
Diagnóstico
Hospital
Cuarentena
Tratamiento
específico
Seguimiento
Tratamiento
OMS
Retrovirus Endógeno Porcino
Carriles:
1.
Marcadores de tamaño
2.
Control Negativo
3.
DNA porcino
4.
DNA de Pacientes
1
2036
1636
1018
PERV 814 bp
506
396
2
3
4
Resultados
• Anticuerpos Anti a-Gal
títulos
4500
4000
3500
3000
12
2500
2000
8
12
1500
1000
500
0
9
2°nd Tx
2
Tx
12
PreTx
12
5
11
8
Día 7 Día 14
1mes
3mes
6mes
Día 7
Tiempo Post trasplante
1mes
1año
Anticuerpos en el ensayo Mexicano
(2000-2001) vs. El Sueco (1990-1993)
Títulos de hemaglutininas IgM contra eritrocitos porcinos replicando
exactamente el método de Lindeborg E. Xenotransplantation 2001:
8; 273-283.
p<0.0001, Mann-Whitney U test
256
Titer (mean ±sem)
128
*
64
32
16
8
4
2
Valdes et al. Groth et al.
Requerimientos de Insulina
Resultados
•El primer grupo de 12 pacientes trasplantados al primer año del
trasplante,
•6 no tuvieron reducciones, 6 mostraron reducciones variadas.
Insulina Exógena Unidades/día
Pre Tx
Post Tx
Hemoglobina
Glicosilada
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
ML
(97%)
JO
(68%)
PA
(51%)
GS
(100%)
Paciente (% Reducción)
AA
(34%)
DO
(86%)
Resultados
• Detección de insulina porcina en suero por
HPLC
Resultados
• Un dispositivo fue removido de cada uno de los
pacientes, para poder ser retrasplantados y
posiblemente llegar a la independencia de
insulina.
• Los dispositivos removidos fueron analizados por
inmunohistoquímica para insulina, glucagon, MIS
(un marcador de células de Sertoli), y CD3, CD4
y CD8.
Insulina
HE
4
1
4
3
1
2
3
2
Glucagon
Sustancia Inhibidora
Mulleriana (MIS)
Resultados
4
5
3
CD3 Humano
1
2
6
Q-03-164-5
4
5
1
6
Insulina
3
2
Resultados
Conclusiones
• No ha habido señales de zoonosis
• No hay complicaciones metabólicas
• No hay intolerancia al dispositivo o al
procedimiento.
• El sistema inmune de los pacientes se
mantiene intacto, medido por reacciones
intradérmicas.
Conclusiones
• Respuesta Inmune
– Persistencia de insulina (100% de los
dispositivos removidos) y células positivas a
glucagon (90%) en cantidades variables
después de 5 años, y de manera
sorprendente, coexistiendo con linfocitos T
– No hay correlación entre los niveles de
anticuerpo y supervivencia de las células.
– No hay una respuesta típica después del
retrasplante
Conclusiones
• Modificaciones en los requerimientos de insulina
exógena
– En 50% de los casos hubo reducciones, en algunos
casos cerca de 100% por varios meses.
– El otro 50% pudiera no haber tenido suficientes
células supervivientes, o una menor sensibilidad a
la insulina.
• La presencia de insulina porcina se ha podido
detectar en la circulación por medio de HPLC
Pasos Inmediatos
• Identificar los sistemas antigénicos en el
cerdo que sean importantes para el
xenotrasplante a humano
– Respuesta humoral
•
•
•
•
Anticuerpos Anti a-Gal
Grupos sanguíneos tipo ABO
Fenómeno de Acomodamiento en los dispositivos
Pruebas de reactividad cruzada para antígenos proteicos
en islotes y Sertolis contra anticuerpos humanos
preformados.
– Respuesta celular
• Caracterización de los linfocitos T en los dispositivos.
Pasos Inmediatos
• Cuantificación de la composición celular
dentro de los dispositivos.
Hospital Infantil de México
“Federico Gómez”
Colaboración con otras
Instituciones.
Dr David White,
Robarts Research Institute,
University of Western Ontario
Dr Camillo Ricordi, Dr Luca Inverardi
Diabetes Research Institute,
University of Miami
Dr Gordon Weir,
Joslin Diabetes Center.
Boston, MA
Dr Robert Elliott,
Diatranz Ltd, New Zealand