Download Clase 4 - Marcadores Moleculares 1

Marcadores Moleculares
Marcadores Moleculares
ADN
ARN
Proteínas
Polipéptidos
Enzimas
Fenotipo
Marcadores Moleculares
1) Marcadores proteicos
a) Proteínas de reserva
b) Isoenzimas
2) Marcadores de ADN
a) Basados en amplificación molecular  PCR
b) Basados en hibridación molecular  RFLP
c) Basados en amplificación + hibridación molecular  AFLP
Principales aplicaciones de los marcadores
moleculares en fitomejoramiento
1) Identificación genética (genetic fingerprinting).
a) Evaluación de la variabilidad genética preexistente.
b) Clasificación por grupos heteróticos (predicción de la heterosis).
c) Determinación de la "core collections" en los bancos de
germoplasma
d) Certificación de pureza de semillas.
e) Identificación y protección legal de variedades.
f) Caracterización e identificación de patógenos.
2) Apoyo a los programas de mejoramiento.
a) Selección asistida por marcadores moleculares.
b) QTLs o "Quantitative Trait Loci" loci de rasgos cuantitativos.
c) Backcross asistido (introgresión rápida de caracteres de interés).
d) Backcross avanzado desde genotipos "no agronómicos" o
especies silvestres
3) Otras aplicaciones.
a) Construcción de mapas genéticos.
b) Determinación de homología entre especies relacionadas por
mapeo comparativo.
Contenido de ADN de algunos
organismos y organelas
Organismo u organela
Contenido de ADN
Picogramos
Pares de Kilobases
(pg)
(pKb)
0,0047
4,2 x 103
0,0002
1,6 x 102
0,0007
5,7 x 102
0,07
7x 104
0,6
5,8 x 105
0,7
7,1 x 105
7,5
7,2 x 106
3,2
3,9 x 106
E.coli
Cloroplasto (Zea mays)
Mitocondria (Zea mays)
Arabidopsis thaliana
Oryza sativa
Lycopersicumesculentum
Zea mays
Homo sapiens
1 pg= 0,965 x 109 pares de bases (pb) = 29 cm
Genoma haploide del hombre = 3,9 x 10 6 pb
Cada célula humana contiene 1,8 m de ADN
Extracción de ácidos nucleicos
 Tipos de ácidos nucleicos a extraer: ADNss, ADNds,ARNs
 Características del ADN: alto peso molecular y alta calidad.
Pasos generales de un protocolo de extracción a partir de cualquier
tejido y especie:
1) Lisis celular  Macerado con nitrógeno líquido
2) Extracción de ácidos nucleicos del macerado celular e inactivación
de compuestos degradantes
Buffer de extracción (pH 8-9)  Disminuye la acción de ADNasas
Antioxidantes  Disminuye la formación de compuestos fenólicos
p.e. BSA, -mercaptoetanol
Detergente + alta concentración salina acomplejamiento del ADN y
desnaturalización de proteínas
p.e. CTAB +ClNa
3) Purificación y lavado  Combinaciones de extracción y
precipitación
Lavado para remover carbohidratos y proteínas  solventes
orgánicos puros o en mezcla (p.e. fenol o cloroformo:alcohol
isoamílico )
Centrifugación separación del ADN en suspensión de los
contamientes
Precipitación  isopropanol o etanol
Puede realizarse un tratamiento con ARNasas o purificación en
gradiente de ClCs para eliminar ARNs y obtener ADN de mayor
pureza.
4) Secado y resuspención en el buffer de stock
Método CTAB
5) Cuantificación del ADN extraído
Fluorómetro: el valor leído se intercala sobre una curva de calibración
previa, y se extrapola la concentración de las muestras.
Espectrofotómetro de luz UV
 Mediciones de absorbancia a longitudes de onda de A 230, A 260, A280,
y A 310
 A 260 / A 280 < 1,8  Contaminación con proteínas
 A 260 / A 280 > 1,8 < 2  Buena calidad
 A 260 / A 280 > 2  Contaminación con fenoles, cloroformo, etc,
Alta precisión, pero pueden verse afectadas por la presencia de
contaminantes como proteínas, polisacáridos y ARNs.
Diluciones con un estándar de ADN comercial de concentración conocida,
con bromuro de etidio. Se observan las diluciones a la luz UV en forma
conjunta con los ADN incógnitas y se estima la concentración por
comparación.
Geles de cuantificación (agarosa 0,8%) con marcadores de peso
molecular conocido para cuantificar los ADN extraídos por comparación
de bandas.
Marcadores moleculares de ADN
basados en la hibridación
RFLP
Enzimas de restricción
 Endonucleasas
Capaces de cortar el ADN en sitios de secuencias de
bases específicas  Sitios de restricción
Tipos de corte
 En el centro de simetría de la secuencia de reconocimiento
Produce fragmento de ADN con extremos
“romos” o“rasurados
 En diferentes posiciones del eje de simetría de la
secuencia de reconocimiento
Produce fragmento de ADN con extremos
“cohesivos” o“pegajosos”
Origen y secuencias de reconocimiento de algunas
endonucleasas de restricción
Organismo de origen
Arthrobacter luteus
Nombre Secuencia de reconocimiento
AluI
Haemophilus influenzae
HindIII
Escherichia coli
EcoRI
Providencia stuarti
PstI
AG CT
TC GA5´
5´ A AGCT T
T TCGA A5´
5´G AATT C
C TTAA G5´
5´C T GCA G
G ACGT C5´
5´
Se conocen más de 400 enzimas de restricción
Acción de la enzima de restricción EcoRI:
Digestión de ADN con enzimas de restricción
Se generan fragmentos de diferente tamaño llamados
segmentos de restricción
Un ADN pequeño como el de un cloroplasto puede generar
40 segmentos de restricción cuando se digiere con EcoRI
El tamaño de los fragmentos refleja la distribución de los
sitios de restricción en el ADN
Estos fragmentos cargados negativamente migran hacia el
ánodo en un campo eléctrico
Durante la electroforesis en geles de agarosa o
poliacrilamida, migran en el gel a una tasa proporcional a sus
pesos moleculares
Electroforesis de ADN
 Los geles usados en la separación
de ácidos nucleicos son matrices de
agarosa o poliacrilamida, con tramas de
dimensiones moleculares.
 Los ácidos nucleicos están cargados negativamente, ellos
emigran hacia el polo positivo en un campo eléctrico.
 Cuando el campo eléctrico se aplica a
través del gel, las cadenas más cortas se
mueven más rápidamente que las más
largas. Así, las cadenas se extienden en el
gel según su tamaño.
 El ADN doble cadena puede ser visualizado agregando bromuro
de etidio, un químico aromático que se intercala entre los pares de
bases de la hélice doble. Cuando el bromuro de etidio se halla ligado
al ADN produce, al irradiarse con UV,una fluorescencia naranja.
Gel de agarosa coloreado
con BrEt
Calles 1y5: Marcador de
peso molecular
 La diferencia en los
tamaños de los fragmentos
obtenida por la digestión con
enzimas de restricción del
ADN nuclear, de una organela
o el ADN total, se denomina
“RFLP”
Calles 2,3,4: ADN de tres
plantas de Solanum
tuberosum digerido con
EcoRI
RFLP: Restriction Fragment Lenght Polymorphisms
Los RFLP del ADN nuclear no pueden ser
directamente visualizados.
Para ello se usan pequeños
fragmentos de ADN como sondas o
“probes” para detectar fragmentos de
restricción individuales
Análisis por Southern blot del
ADN de tres plantas de
Solanum tuberosum. La sonda
utilizada es un fragmento del
gen nptII
Confección de bibliotecas de sondas o “library”
El ADN purificado de
la especie de interés es
digerido con enzimas de
restricción
Los fragmentos de restricción individuales son unidos a plásmidos, y
el plásmido es incorporado a una célula bacteriana (p.e. E.coli)
 Se multiplican las células bacterianas transformadas. Los cultivos
pueden mantenerse por largo tiempo
 Aislamiento de los fragmentos de restricción de los plásmidos
transformados. Se obtiene un gran número de copias para ser usados
como sondas
 Las sondas se marcan radioactivamente con P32 (2-5 Kb)
 También puede usarse tinción no radiactiva basada en la
quimioluniniscencia (p.e.dioxigenina)
Detección de RFLPs por la técnica de Southern
Blot
Aislamiento y purificación del ADN
Digestión con enzimas de restricción (10-15 u/µg de ADN)
Es conveniente hacer un minigel para verificar la digestión total
del ADN previo a la corrida
Fracciónamiento y separación de los fragmentos de restricción
mediante electroforesis en gel de agarosa (1%)
La migración de los fragmentos debe ser lenta (de 6 hasta 48
horas)
Desnaturalización del ADN por inmersión del gel en solución
desnaturalizante (OHNa + ClNa)
Se forman cadenas simples de ADN que permiten la posterior
hibridación de las sondas.
Southern Blot: el ADN monohebra
es transferido del gel a una membrana
de nylon o nitrocelulosa.
Desmontado el Southern se lava la
membrana para eliminar restos de
agarosa y se incuba envuelta en papel
de filtro a 80°C para fijar el ADN a la
membrana
Procesamiento de la sonda
•La sonda, inserta en un plásmido, es separada mediante digestión con
enzimas de restricción y electroforesis en gel de agarosa de bajo
punto de fusión y purificada mediante columnas.
•Cuantificación, ajuste de la concentración de la sonda y marcaje
Tratamiento de prehibridización
•La membrana es tratada con solución de prehibridización para evitar
hibridaciones inespecíficas de la sonda
La sonda desnaturalizada se agrega a la solución de prehibridización.
La sonda hibrida con los fragmentos de restricción homólogos a ella.
Revelado por autoradiografía
Esquema de la técnica de
Southern Blot
Herencia de los RPLPs
Para esta combinación particular de enzima de restricción y sonda de hibridación,
se obtiene este modelo de hibridación de bandas
Siempre que los fragmentos reconocidos por la sonda sean de longitudes noidénticas, decimos que las bandas son polimorficas.
Flor celeste
Flor blanca
8 Kb
6 Kb
Color de flor
celeste
dominante
rr
RR
Padres
homocigotas
F1
Rr
F2
RR
6 Kb
Rr
8 Kb
6 Kb
Rr
8 Kb
6 Kb
Los RFLPs son codominantes
rr
8 Kb
Marcadores genéticos convencionales vs
RFLP
 Mayor variación de RFLP  se adaptan mejor a la construcción de
mapas genéticos.
 Los RFLPs no dependen del estado de desarrollo ni de las
condiciones ambientales en las que crece determinado genotipo
 Los RFLPs poseen bajo efecto fenotípico
 Los RFPLs son codominantes y se comportan de esta manera en
diferentes fondos genéticos
RFLP
Elevado número de polimorfismos.
Permiten crear mapas genéticos
saturados de marcadores.
Isoenzimas
Menor variabilidad.
No existen suficientes marcadores para
un mapa a intervalos pequeños.
No se ha encontrado una adecuada
Esta mejor cobertura del genoma
correlación entre distancias genéticas
permite determinar adecuadamente
determinadas por isoenzimas y
relaciones genéticas entre genotipos.
relaciones genéticas entre genotipos.
Sólo resuelve aquellas mutaciones que
Pueden detectarse en principio todas las
sustituyan un aminoácido que afecte la
diferentes mutaciones.
movilidad de la proteína.
Detección de la variabilidad no
Cubre variabilidad en genes
restringida a regiones codificantes.
estructurales solamente.
No depende del estadío de desarrollo. Depende del estadío de desarrollo.
No depende del tejido.
Depende del tejido.
Herencia codominante pero se complica
Herencia codominante.
cuando la enzima estudiada no es un
monómero.
Si se usan sondas genómicas no se
Por tratarse de genes estructurales
esperan efectos pleiotrópicos pues en
podrían presentar efectos pleiotrópicos.
general es variabilidad fuera del gen.
Estudio directamente el genotipo.
Estudio el fenotipo.