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GENETICA MOLECULAR 2011
GUIA DE PROBLEMAS
BIBLIOTECAS Y TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN
PROBLEMA 1
A partir de una biblioteca genómica de T. cruzi construida en cósmidos (30.000 pb), se
realizó un rastreo para detectar genes de mucinas con una sonda de un gen completo de
mucina de mamíferos. Se obtuvieron varios clones positivos y se decidió realizar otra
biblioteca a partir de uno de los cósmidos positivos en fragmentos de tamaños entre
2000-3000pb en el vector pBS. Para esto se eligió hacer una fragmentación mecánica
del cósmido.
1. Considerando que las mucinas de mamíferos tienen un 80% de homología con las de
T. cruzi ¿en qué condiciones se habrá realizado el rastreo de la biblioteca de cósmidos?
2. ¿Qué ventajas y desventajas tiene la estrategia elegida para la construcción de la
biblioteca en vector pBS?
3. ¿Cómo seleccionaría los tamaños de insertos dentro del rango de tamaño deseado?.
¿Qué tipo de enzima usaría para digerir el vector y cómo prepararía los insertos para
ligar?
4. ¿Cuántos clones se necesitarán para tener representado todo el cósmido al menos una
vez?
PROBLEMA 2
Con el objetivo de aislar del genoma de A. tumefaciens el gen que codifica la proteína
X, se realizó un rastreo de una biblioteca genómica de expresión realizada en cósmidos.
La biblioteca fue construída por digestión parcial del genoma de A. tumefaciens con la
enzima de restricción EcoR1, de modo de obtener fragmentos de aproximadamente
25000pb, que luego fueron ligados al cósmido digerido por EcoR1. El rastreo se realizó
por hibridización con una sonda obtenida por PCR sobre el gen completo de R. meliloti
(organismo altamente relacionado con A. tumefaciens).
Como resultado del rastreo se identificaron 3 colonias positivas. Los cósmidos
correspondientes a cada una de estas colonias fueron purificados y digeridos con EcoR1
obteniéndose el siguiente patrón de digestión por electroforesis en gel de agarosa:
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La mezcla de digestión (sin distinguir los fragmentos) de cada cósmido se clonó en un
vector pY y cada uno fue transferido a bacterias mutantes de A. tumefaciens, defectivas
en la proteína X, para ver si complementan la mutación. Unicamente se observó
complementación en las mutantes transformadas con los cósmidos A y C.
1. Explique los resultados obtenidos.
2. De acuerdo a los resultados, ¿qué fragmento contendría el gen completo?
3. ¿Qué estrategia seguirá para clonar el gen completo?
PROBLEMA 3
Usted está estudiando las mucinas de Trypanosoma carasii, que forman la cubierta de
este parásito unicelular. Las mucinas purificadas de acuerdo a criterios bioquímicos son
muy heterogéneas, indicando la coexistencia de múltiples mucinas distintas en la
superficie (usted sospecha la presencia de al menos 100 proteínas distintas expresadas
simultáneamente). Por otro lado, otro grupo publicó la secuencia de los primeros 5
genes de mucinas de T. carasii y demostraron que todos ellos tienen una estructura
común, codificando para productos con un segmento N-terminal muy conservado (95%
de identidad) de 100 amino ácidos y un segmento C-terminal altamente variable
(homologías menores al 25% entre cualquier par de genes) de entre 50 y 100 amino
ácidos. En ese mismo trabajo, sus competidores publican un Southern blot hecho en
condiciones de máxima rigurosidad que revela una complejidad genómica altísima para
la familia.
1. Dados los antecedentes y el resultados del Southern blot, ¿Cuál le parece que habrá
sido la sonda utilizada en este ensayo?
2. ¿Cómo estimaría con la mayor precisión posible el número de genes que codifican
para la familia de mucinas en este parásito? (usted cuenta con todas las herramientas de
biologia molecular, DNA genómico de T. carasii en cantidad ilimitada, anticuerpos
contra las mucinas purificadas, una biblioteca de expresión de T. carasii de 3 kpb de
inserto promedio y una biblioteca genómica de T. carasii de 20 kpb de tamaño de
inserto promedio). El genoma de T. carasii consta de 5x106 pb.
PROBLEMA 4
En un laboratorio se está intentando aislar un gen humano, que codifica para una
proteína con una actividad enzimática de interés. Como información previa se conoce la
reacción que cataliza, por lo que contamos con un ensayo para detectar y cuantificar su
actividad enzimática. También se ha purificado la proteína humana y se ha avanzado en
la caracterización molecular de la misma (peso molecular aparente, estructura
cuaternaria, presencia y cantidad de puentes disulfuro, etc.) así como en el estudio de
algunas de sus propiedades enzimáticas (parámetros cinéticos, inhibidores específicos,
etc.). Así mismo, se logró secuenciar el extremo amino terminal:
Ala Gly Gly Met Thr Asp Gln Trp His Trp Glu Gly Ile Val
Por otro lado, se tiene clonado un gen de ratón que codifica para una proteína con la
misma actividad enzimática. De acuerdo a la secuencia proteica deducida a partir de la
secuencia de DNA, este gen está muy relacionado con el humano, pues incluye los
catorce aminoácidos que fueron secuenciados en la proteína humana. Este gen se
subclonó en un vector de expresión, y se obtuvo la proteína recombinante en un sistema
eucariote (células COS). Esta proteína (recombinante) es 100% activa comparada con la
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enzima nativa, y anticuerpos monoclonales contra ella permiten inmunoprecipitar la
enzima humana. Se ha comenzado a analizar la estructura genómica haciendo un
Southern blot con DNA genómico humano, e hibridizando con una sonda heteróloga
(significa “derivada de otra especie”) generada a partir del gen murino, se ven diez
bandas definidas de tamaños medios a grandes (de 4Kb a más de 25Kb). Con la
información de tu Southern blot (que ya habías publicado), otro laboratorio te ganó de
mano y clonó un gen humano, altamente homólogo a la secuencia murina, y, que
coincide perfectamente con la secuencia proteica que vos obtuviste. Sin embargo,
siguiendo una estrategia correcta, y utilizando el mismo sistema en que se expresa la
proteína recombinante activa de ratón, se prueba que este gen clonado codifica una
proteína, pero sin la actividad enzimática buscada.
1. ¿Cómo explicás que el gen humano clonado codifique una proteína inactiva
(sabiendo que la enzima activa se expresa perfectamente)? Elegí una sola explicación,
que sea coherente con las evidencias.
2. Diseñá al menos una estrategia que permita aislar el gen humano que codifica la
proteína con actividad [no entrar en detalles de protocolo, pero sí explicar la(s)
estrategia(s) completa(s)].
PROBLEMA 5
Usted desea clonar el gen leu A+ (que codifica para una de las proteínas de la
biosíntesis de leucina) de Escherichia coli. En el laboratorio dispone de bacterias
Escherichia coli wild type y leu A- (en ambos casos dispone de cepas resistentes y
sensibles a la ampicilina), y un plásmido pBluescript KS que confiere resistencia a
Ampicilina. Diseñe un protocolo de clonado del gen leu A+.
PROBLEMA 6
La enfermedad humana hereditaria llamada distrofia muscular severa de la niñez es
causada por la deficiencia de una proteína de 50 kDa llamada adhalina. Esta enfermedad
es autosómica recesiva, es decir, el gen de la adhalina se encuentra en un autosoma
(cromosoma no sexual) y para que se manifieste la enfermedad tienen que estar mutados
necesariamente los dos alelos del gen. Se clonó primero el cDNA y luego el gen de la
adhalina con el fin de estudiar las mutaciones del gen que causan la enfermedad en
distintos
pacientes. Para clonar el cDNA, rastrearon un banco de cDNA de músculo esquelético
humano (preparado en Escherichia coli, usando un vector carente de promotor de la
transcripción procariótico) por hibridación con una sonda radioactiva de cDNA de
adhalina de conejo previamente aislada por otro grupo (sonda heteróloga). Para clonar
el gen de adhalina, rastrearon un banco de genes, obtenido a partir de DNA genómico
de bazo humano, usando como sonda radioactiva al clon de cDNA de adhalina humana
aislado previamente.
La figura 1 muestra un Northern blot de RNAs de distintos tejidos humanos normales
donde se ve que el mRNA de adhalina es expresado preferencialmente en músculo
esquelético.
Las figuras 2 y 3 muestran un Northern blot y un Western blot, respectivamente de
músculo esquelético de un individuo normal y del paciente JH afectado de distrofia
muscular severa, donde se ve que el paciente JH tiene cantidades normales de mRNA de
adhalina, pero sin embargo la proteína está ausente.
Figura 1
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Figura 2
Figura 3
3
Northern blot
Northern blot
Western blot
sonda: cDNA adhalina
sonda: cDNA adhalina
Ab anti-adhalina
sonda: cDNA actina Ab anti-actina
C: corazón, ME: músc. esquelético, Pl: placenta, Pul: pulmón, H: hígado, R: riñón, Pa:
páncreas.
1. ¿Podrían haber aislado el clon genómico de adhalina de un banco de DNA genómico
humano de glóbulos blancos?
2. Si no hubieran tenido a su disposición ninguna sonda de hibridación, podrían haber
usado un anticuerpo anti adhalina humana como herramienta para encontrar el clon de
cDNA de adhalina a partir del mismo banco de cDNA mencionado más arriba? ¿Por
qué?
3. ¿Podrían haber aislado el clon de cDNA de adhalina de un banco de cDNA de
mRNAs de cerebro?
4. Si el banco genómico tiene 200.000 clones diferentes que en su conjunto representan
a todo el genoma de un ser humano, y el tamaño del genoma haploide humano es de
3x109 pb, ¿Cuál es la longitud promedio en pares de bases de los insertos de los clones
del banco?
5. ¿Qué le sugieren las dos bandas de hibridación en el Northern blot?
6. Sabiendo que el gen de la adhalina se transcribe exclusivamente en músculo
esquelético, ¿Cuál sería el mecanismo molecular de dicha expresión específica de
tejido?
7. Se demostró que los dos alelos del paciente no llevan ninguna mutación que cree
codones stop prematuros (nonsense) y que los mRNAs de adhalina del paciente no
tienen ningún impedimento en la traducción. Sin embargo, se descubre que la mutación
que causa la enfermedad en JH en ambos alelos es el reemplazo de una G por una A que
determina la substitución de la arginina Nº 98 por una histidina. ¿En base a esto y a los
resultados de las
figuras 2 y 3, qué hipótesis tiene para explicar la ausencia de adhalina en el enfermo?
8. ¿Qué importancia tiene haber incluído una hibridación con sonda de actina en el
Northern y un revelado con anticuerpo anti actina en el Western?
9. Para expresar en E. coli la proteína adhalina se clonó el cDNA de la adhalina río
abajo del promotor-operador del operón arabinosa de E. coli. Este operón es inducible
(desreprimible) por el azúcar arabinosa y además está sujeto al mismo tipo de
regulación positiva a que está sujeto el operón lac. Al agregar arabinosa al cultivo de las
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bacterias transformadas con la construcción p-oara-adhalina no se observó expresión de
la proteína debido a que se cometió el error de usar un medio de cultivo que contenía
también glucosa, hecho que se revirtió al hacer el mismo experimento en un medio sin
glucosa ¿Cuál es la base molecular que explica estos resultados?
PROBLEMA 7
Se piensa que una alteración en la actividad de cierta enzima humana está asociada a la
enfermedad de Perkin-Elmer. El gen que codifica para dicha enzima no ha sido
identificado aún. Se cuenta con la enzima purificada en buena cantidad, un ensayo de
actividad para la misma, y todas las herramientas necesarias de genética molecular.
Describir en forma lo más desarrollada posible, qué estrategia seguiría para determinar
efectivamente si existe un ligamiento genético entre la alteración de la actividad de la
enzima y la enfermedad.
PROBLEMA 8
A partir de una biblioteca genómica de P. aeruginosa, se aisló el plásmido pAP1. Este
plásmido contiene un fragmento de 20 kb de ADN cromosomal, clonado en el sitio
Hind III del vector de amplio rango de hospedador pVK102 (Fig. A). Este plásmido
complementó la producción de una proteína X en una mutante X- de P. aeruginosa.
Para localizar la región de ADN responsable de dicha complementación, el plásmido
pAP1 fue mutagenizado mediante inserciones del transposon Tn tac 1. Este transposon
posee un gen de resistencia a kanamicina (Fig. B). El plásmido pAP1 23 formado por
una inserción de Tn tac 1 en el inserto de 20 kb de pAP1 fue digerido completamente
con Hind III, Bam HI y hind III + Bam HI y se corrió en un gel de agarosa (Fig. C). El
tamaño de cada banda se encuentra marcado en la figura.
1. Determinar la localización de la inserción del transposon en el inserto pAP1, y el
sentido de este, justificando su respuesta.
2. Si el transposon se hubiese insertado en el sentido contrario ¿Qué bandas hubiera
esperado encontrar en los cortes con Hind III, Bam HI y con Hind III + Bam HI?
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Figura A
Figura B
Figura C
PCR
PROBLEMA 9
En la retina del ojo de los humanos existen dos tipos de células: los bastones y los
conos. Los bastones expresan específicamente una proteína llamada rodopsina, la cual
posibilita la visión en general. Con respecto a los conos existen tres tipos celulares
diferentes: los conos "azules", los "rojos" y los "verdes", expresando específica y
exclusivamente cada uno de estos las proteínas conocidas como pigmentos visuales
"azul", "rojo" y "verde", respectivamente. Estos pigmentos son capaces de captar luz de
los colores indicados por su nombre y el funcionamiento en conjunto de los tres tipos de
conos da por resultado la visión policromática. El gen del pigmento azul (gen A) se
encuentra localizado en el cromosoma humano nº 7. En cambio, los genes de los
pigmentos rojo (gen R) y verde (gen V) se encuentran uno al lado del otro (o sea, en
tandem) en el cromosoma sexual X (figura 1), no habiendo contraparte en el cromosoma
Y.
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Porción del cromosoma X
Figura 1
Cada uno de estos dos genes tiene su propio promotor y región regulatoria de la
transcripción, y se transcribe de manera específica, es decir, el gen R sólo en conos
"rojos" y el gen V sólo en conos "verdes". Los genes R y V tienen secuencias
nucleotídicas muy similares (98% de similitud), a tal punto que muchos sitios para
enzimas de restricción se encuentran conservados en ambos genes. La figura 2 muestra
una estructura más detallada de ambos genes.
Figura 2
Desde 1779 se conoce el carácter hereditario de la alteración en la visión en colores en
humanos. Varones que tengan delecionado el gen R no ven el rojo y varones que tengan
delecionado el gen V no ven el verde.
1. Dibujar las bandas de hibridización que obtendría en un Southern blot de ADN
genómico cortado simultáneamente con las enzimas de restricción EcoR1 (E) y BamH1
(B), obtenido de sangre de los siguientes individuos:
varón R+V+: tiene los dos genes sanos y enteros.
varón R+V-: tiene delecionado el gen V.
varón R-V+: tiene delecionado el gen R.
varón R-V-: tiene delecionados ambos genes.
Se utilizó como sonda a un clon de ADNc que contiene sólo los exones 1 y 2 del gen V.
Esta sonda reconoce ambos, aún en condiciones de alta rigurosidad.
2. ¿Es el experimento anterior útil para determinar los genotipos de las cuatro personas?
3. Dibujar las bandas de Southern que hubiera obtenido de los mismos pacientes si en
lugar de usa la sonda indicada se hubiera usado como sonda sólo el exón 5. ¿Hubiera
sido éste análisis tan informativo como el de la pregunta 1? Justifique.
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4. Una manera más rápida de efectuar el análisis de los cuatro individuos es haciendo
una PCR con primers específicos para el gen V, que aparean en sus exones 4 y 5 según
se ve en la figura 3. Estos primers no aparean con las secuencias de los exones 4 y 5 del
gen R.
Figura 3
Diga si detecta o no productos de PCR y de qué tamaño para cada uno de los cuatro
individuos, habiendo usado como molde ADN genómico obtenido de sangre.
5. ¿Qué productos de PCR y de qué tamaño habría obtenido en cada uno de los
individuos si hubiera usado como molde ADNc total obtenido de retina?
6. ¿Con cuál de las dos hebras (codificante o no codificante) se aparea el primer
izquierdo? ¿Y el derecho?
7. La deleción en la región del cromosoma X marcada como LCR en la figura 1 provoca
una fuerte disminución de la transcripción de ambos genes R y V. ¿Qué función le
atribuiría a la región LCR? ¿Qué motivos de secuencia aminoacídica esperaría encontrar
en las proteínas que se unan a la región LCR? Justifique.
8. ¿Qué colores percibirán los humanos R-V- y los humanos que tienen delecionado el
LCR?
PROBLEMA 10
1. Mencione una causa que haga necesaria una PCR anidada (“nested”) para repetir una
amplificación. ¿Conviene realizar la segunda amplificación con los mismos primers que
la primera? Justifique.
2. ¿Puede realizar una PCR amplificando tres regiones diferentes del molde utilizando
simultáneamente tres juegos diferentes de primers específicos, en el mismo tubo de
reacción? Si fuese posible, ¿qué característica deben tener los productos de
amplificación para que el resultado sea de fácil análisis?
3. Si quiero construir una biblioteca genómica de una planta en la cual la extracción del
ADN genómico, por problemas que desconozco, es de bajo rendimiento, ¿es
conveniente realizar primero una PCR para amplificar el material?
4. ¿Toda genoteca de expresión debe ser construida a partir de mRNAs? Especifique.
5. ¿Qué es la contaminación por producto final en la PCR? ¿El método de TaqMan,
tiene este mismo problema?
6. ¿En qué caso(s) utilizaría geles de poliacrilamida para resolver moléculas de ADN
por electroforesis? ¿Cómo realizaría la tinción?
7. Acabo de realizar un Southern blot, y me doy cuenta (tarde!) que hice la
electroforesis y la transferencia sin antes cortar con la enzima de restricción que había
elegido. De todos modos decido continuar con la hibridización. ¿Qué resultado
obtendré? ¿Qué información me puede dar?
8. Un investigador obtuvo la secuencia parcial de un gen, y desconoce si secuenció la
hebra codificante o la no codificante. Como le sugeriría Ud. realizar una búsqueda de
homología en un banco de datos.
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PROBLEMA 11
1. Analizar el siguiente protocolo de PCR
MEZCLA DE REACCIÓN
DNA genómico humano (100ng/ul)
primer 1 (sense) (100ng/ul)
primer 2 (antisense) (100ng/ul)
Buffer 10X
dNTPs (1mM)
DNA Pol (5U/ul)
H2O
TOTAL
µl
1
1
1
5
5
0.5
36.5
50
Buffer 10X: Tris.HCl pH 8 250mM, KCl 500mM
Primer 1: 5' GGACTGTGAAGGCCCGTGCCCG 3'
Primer 2: 5' GGGATCCGAGACGCTCCCCAGA 3'
RECORDAR: TmºC = 2ºC x (A+T) + 4ºC x (G+C)
Ambos primers son perfectamente homólogos a las secuencias complementarias
específicas del templado.
CICLADO
* 1 X 5min 93ºC
* 30 X {30seg 93ºC ; 2min 72ºC}
* 1 X 5min 72ºC
2. Indicar si faltan o sobran componentes y/o pasos (Organizar el análisis y la respuesta
de acuerdo a las dos partes del protocolo: MEZCLA DE REACCION y CICLADO).
Señalar claramente cuáles son los errores y explicar en detalle cómo se corrigen.
3. Analizar los siguientes oligonucleótidos sintéticos:
5' GTGACGTTTTTCGTTGCA 3'
5' AACTTCGTGCAACGAAAA 3'
¿Encuentra algún problema para que sean usados juntos como primers en una reacción
de PCR?
PROBLEMA 12
Se desarrolló un método para determinar el sexo de embriones bovinos, basado en
polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLPs). El polimorfismo
elegido existe entre los genes ZFX y ZFY, presentes en los cromosomas X e Y
respectivamente. El método que se eligió para realizar el sexado, visualizando el RFLP
fue una PCR, utilizando para ello oligonucleótidos diseñados sobre las secuencias, ya
conocidas de ZFX y ZFY.
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Figura 1
Se realizaron las reacciones de PCR que se detallan a continuación, usando en todas la
misma mezcla de reacción (reacción 1) con los agregados y tratamientos indicados. Los
productos de cada reacción se resolvieron en un gel de agarosa 2%.
En la Fig. 2 se muestra un esquema del resultado obtenido. Las PCR sobre material
embrionario se realizaron sobre el ADN presente en las 4 a 10 células que pueden
recuperarse en una biopsia de la zona pelúcida de un embrión bovino de 7 días. (de 5 a
20 pg.)
Reacciones
1- Mezcla de reacción (MR): 300 ng de cada oligo (P1, P2, P3, P4) , 0,2 mM dNTP,
buffer de reacción 1X y 2 U Taq polimerasa.
2 - MR + 500 ng ADN bovino de hembra adulta. Oligos P2 + P3. Producto digerido con
la enzima PstI.
3 - MR + 500 ng ADN bovino de macho adulto. Oligos P2 + P3. Producto digerido con
la enzima PstI.
4 - MR + Medio utilizado para las biopsias de los embriones. Oligos P1, P2, P3, P4.
5 - MR + ADN embrión A. Oligos P1, P4.
6 - ídem 5 con oligos P2, P3.
7 - MR + 5 ul de reaccion 5. Oligos P2, P3. Digerido con PstI.
8 - MR + ADN embrión B. Oligos P1, P4.
9 - ídem 8 con oligos P2, P3.
10 - MR + 5 ul de reaccion 8. Oligos P2, P3. Digerido con PstI.
11 - MR + ADN embrión C. Oligos P1, P4.
12 - ídem 11 con oligos P2, P3.
13 - MR + 5 ul de reaccion 11. Oligos P2, P3. Digerido con PstI.
14 - MR + 500 ng ADN bovino de hembra adulta. Oligos P1 + P4.
15 - MR + 500 ng ADN bovino de macho adulto. Oligos P1 + P4.
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Figura 2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
A la izquierda se muestra un marcador de peso molecular con los siguientes tamaños:
404, 365, 279 y 86 pb.
PREGUNTAS:
1. ¿Qué otro método podría haberse utilizado, en lugar de la PCR, para visualizar el
RFLP? ¿Por qué no lo utilizaron?
2. Si compararas las secuencias de ZFX y ZFY, ¿esperarías encontrar diferencias en la
secuencia adicionales a la que causa el RFLP?
3. Para que este método de sexado sea adecuado, ¿qué característica tiene que tener el
RFLP respecto de los individuos de la especie?
4. Explicar los resultados de cada reacción y determinar de que sexo son los embriones
A, B y C.
5. ¿Cuál será la fuente más probable de contaminación con ADN foráneo en estos
ensayos de sexado? ¿Cómo lo comprobarías?
6. ¿Era necesario, en las calles 7, 10 y 13, realizar una segunda amplificación con los
oligos P2 y P3 en vez de usar nuevamente los oligos P1 y P4?
PROBLEMA 13
Se desea clonar el gen de la succinato deshidrogenasa (SDH) de Trypanosoma cruzi. En
el laboratorio se dispone del gen homólogo de Trypanosoma carassii, de 600 pb,
completamente secuenciado. Decide hacer una sonda por PCR, sobre el gen completo
utilizando dos oligonucleótidos de las regiones 5´y 3´del gen, que incluyen la Met
inicial (P1) y el codón de stop (P2). En el panel 1 se muestra el Southern blot, lavado en
condiciones de máxima rigurosidad de ADN genómico de T.cruzi digeridos por
diferentes enzimas.
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Panel 1
PstI
EcoRI AccI
A la izquierda se muestra un marcador de peso molecular con los siguientes tamaños:
10, 3 y 0.8 kpb.
En vista de los resultados, y aprovechando el hecho de que los tripanosomas no poseen
intrones, decide intentar el clonado del gen de la SDH mediante una PCR sobre ADN
genómico total de T.cruzi utilizando los mismos oligonucleótidos utilizados para
sintetizar la sonda. Además se utilizó un tercer oligonucleótido (P3), que hibridiza
dentro de la región C-terminal, en orientación sense. Se utilizaron las siguientes
condiciones de ciclado:
5 min 93ºC; (30 seg 93ºC, 30 seg 60ºC, 30 seg 72ºC)x35;10 min 72ºC
Todos los oligonucleótidos tienen un Tm de 65ºC.
Reacciones
Molde
P1
P2
P3
1
+
+
+
-
2
+
+
+
3
+
+
+
En el panel 2 se muestran los resultados de las PCRs en un gel de agarosa teñido por
Bromuro de etidio y en el panel 3 el mismo gel transferido e hibridizado en la sonda de
SDH utilizada en el panel 1.
Panel 2
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Panel 3
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1. Justifique los resultados obtenidos.
2. Si la estrategia seguida no hubiese sido exitosa, proponga una estrategia alternativa
para el clonado del gen completo de la SDH de T.cruzi.
PROBLEMA 14
Usted dispone de un clon parcial de la porina, un antígeno de superficie de Vibrio
cholera (aislamiento clínico A2K), que consiste en las 500 pb del extremo 5´ del gen.
Este clon contiene el ATG propio del gen y, por comparación con porinas de
organismos relacionados usted dedujo que le faltan las 500 pb del extremo 3´del gen
para tenerlo completo. Usted además tiene dos primers (P1 y P2) que le permiten
amplificar todo el fragmento codificante que posee. En el laboratorio se dispone de una
biblioteca genómica de Vibrio cholera (aislamiento clínico Arg2) en el cósmido pXX
cuyo tamaño de inserto promedio es de 50 kpb. Por lo tanto, usted decide usar esta
biblioteca para obtener el gen de la porina completo.
1. ¿Cuántos clones rastrearía como mínimo? (el contenido genómico total de Vibrio
cholera es de 107 pb)
2. Explique brevemente cómo sintetizaría y purificaría la sonda.
3. Indique las condiciones en que haría la hibridización.
Del rastreo de la biblioteca usted obtuvo un único clon positivo, el cual decide analizar
por restricción con las enzimas indicadas en la figura (ninguna de ellas corta dentro de
su fragmento del aislamiento clínico A2K, por supuesto), transferir el gel y hacer un
ensayo de Southern blot con la misma sonda usada para el rastreo de la genoteca.
En la figura se muestra la autoradiografía del Southern blot. Encima de cada calle se
indica la enzima de restricción utilizada para digerir el cósmido positivo y a la izquierda
se indican (en kpb) los marcadores. En base a estos resultados usted decidió subclonar
la banda reactiva de la digestión con HaeII en el vector pUC19. La reacción de ligación
fue un éxito (usted hizo todos los controles apropiados), tomó 2 clones de la placa de
ligación (vector + ligasa + inserto) y los analizó por PCR (utilizando los primers P1 y
P2) y Southern blot, utilizando la misma sonda que la usada para el rastreo de la
genoteca.
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En la figura del Southern blot los signos + y - indican digestión o no con la enzima
HaeII. En la figura de la PCR se indica encima de cada calle el molde usado en la
reacción.
4. Explique los resultados obtenidos.
5. Proponga una estrategia alternativa para clonar el gen completo de la porina Vibrio
cholera.
SUBCLONADO
PROBLEMA 15
Se realizó un rastreo sobre una genoteca de expresión del parásito T. cruzi utilizando un
anticuerpo específico para la enzima trypanotion reductasa. La genoteca está construida
en el vector gt13 que produce una fusión C-terminal con el gen de la -galactosidasa.
Se obtuvo un positivo (al cual se lo llamó clon TR), que se quiere subclonar en un
vector de expresión.
λgt13
BRAZO IZQ. (20000 PB)
INSERTO (2000 PB)
agt cgc gcc ccc aaa gtg tgc ggt acc ccc gaa ttc
KpnI
EcoRI
--------------------------------- aag ctt act gga tcc tca tgg tgc gct tgcta
HindIII BamHI
BRAZO DER. (25000 PB)
En el laboratorio dispone de la serie de vectores de expresión pCAR-1, 2 y 3 cuyos
sitios múltiples de clonado son los siguientes.
pCAR-1
ccc gtg gac cca cca acc gaa ttc aatggc cta gga tcc aat taa tga
EcoRI
HaeIII
BamHI
pCAR-2
ccc gtg gac cca cca acc aga att caa tgg cct agg atc caa tta atg a
EcoRI
HaeIII
BamHI
pCAR-3
ccc gtg gac cca cca acc aag aat tca atg gcc tag gat cca att aat g a
EcoRI
HaeIII
BamHI
Este vector tiene 4.000 pb y produce una fusión C-terminal con el gen de una proteína
que se une a quitina. En todos los mapas, los codones indicados como tripletes señalan
el marco correcto de lectura para lograr la fusión.
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1. Se ha decidido clonar utilizando los sitios EcoRI y BamHI ¿Por qué?
2. A partir de los mapas dados ¿Cuál de los tres vectores usaría y por qué?
Los resultados de la ligación, una vez preparados inserto y vector de acuerdo a lo visto
en el laboratorio, fueron los siguientes:
Vector
vector + inserto
inserto
20 ufc
22 ufc
0 ufc
De acuerdo a estos resultados se decide realizar un mapeo de restricción sobre el clon
TR y el vector de subclonado pCAR.Los productos de digestión corridos en un gel de
agarosa y revelados por BrEt se indican en la figura.
Kpb
1
2
3
4
5
6
23 641.8 -
1- pCAR BamHI
2- pCAR EcoRI
3- pCAR BamHI/EcoRI
4- TR BamHI
5- TR EcoRI
6- TR BamHI/EcoRI
Por otro lado, se amplificó el inserto del clon TR por PCR utilizando los
oligonucleótidos O1 ubicado a 50 bases río arriba del sitio KpnI y O2 ubicado a 50
bases río abajo del sitio BamHI, ambos en el vector λgt13. Se obtuvo el producto de
amplificación esperado de 2100 pb al cual se subclonó en vector T (un vector
linealizado con una T protruyente, en sus extremos 5', que permite el clonado directo de
productos de PCR con la enzima Taq ADN polimerasa).
3. ¿Por qué no se secuencia directamente en el fago λgt13?
El producto clonado en el vector T se secuenció utilizando el oligonucleótido O1
obteniéndose la secuencia que se indica.
4. Escribir la secuencia, de 5' a 3' y describir cuáles partes corresponden al inserto y
cuáles al vector.
5. En base a todos los resultados observados, explique cuál es la causa por la cual no se
logró subclonar en el vector pCAR en los sitios EcoRI y BamHI. Proponer al menos una
alternativa para el subclonado. oligo O1
GM2008 – Guía de problemas
15
PROBLEMA 16
Un joven becario recibió de un amigo el gen que codifica para la glutamato
deshidrogenasa de Plasmodium vivax clonada en el plásmido pUC 19 (3000 pb) y un
anticuerpo policlonal específico contra esta enzima. Ahora quiere clonar este gen en un
vector de expresión (pGEX, 5000pb, cuyas enzimas del polylinker, de 5´a 3´son
BamHI, EcoRI, PstI, PrxI, ApaI, HindIII) para estudiar bioquímicamente a esta enzima.
La persona que le mandó el plásmido le proveyó tan sólo del mapa de restricción que se
indica abajo y la indicación de que el sitio EcoRI está en la fase del pGEX-1:
Los sitios de corte para estas enzimas son los siguientes:
ApaI: C^XCGXG
EcoRI: 5´G^AATTC 3´
SalI: 5´G^TCGAC 3´
PrxI: 5´T^AATTA 3´
HindIII: 5´A^GATCT 3´
EcoSI: 5´ AXT^AXT 3´
GM2008 – Guía de problemas
16
Este joven becario decidió intentar el subclonado utilizando las enzimas EcoRI y PrxI, y
para ello digirió el pGEX-1 con ambas enzimas, lo fosfataseó y procedió a ligarlo con el
inserto del clon proveniente del plásmido pUC19 purificado de gel de agarosa. Obtuvo
200 colonias en la placa de ligación (vector + ligasa + inserto) y sólo 10 en la de control
de religación del vector (vector + ligasa).
1. ¿Qué otros controles de ligación hubiese agregado usted?
2. ¿Porqué decidió fosfatasear el vector si lo digirió previamente con dos enzimas
distintas?
Entusiasmado con los resultados de la ligación, decidió picar sólo 5 colonias
recombinantes y 1 del control de religación y analizarlas por PCR y restricción. Para la
PCR utilizó los oligonucleótidos pGEX sense y pGEX antisense que hibridizan en el
5´y 3´, respectivamente, del polylinker de pGEX-1. Los resultados de la PCR y el
análisis por restricción de esos mismos clones se indican en el gel debajo (el clon
indicado como negativo corresponde a la colonia picada del control de religación).
En la figura se muestra el gel de agarosa teñido por BrEt. Los marcadores (en pb) se
indican a la izquierda.
3. ¿Qué controles adicionales hubiese agregado a la PCR?
4. Analice los resultados para cada uno de los clones, explique la situación en cada caso
e indique con cuál de los clones proseguiría el trabajo.
5. En base a sus deducciones, ¿qué cree que hubiese ocurrido si no fosfataseaba el
vector antes de ponerlo a ligar?
6. Sugiera una estrategia alternativa de subclonado en pGEX-1 para optimizar los
resultados.
7. ¿Cómo podría confirmar la expresión correcta de la glutamato deshidrogenasa?
PROBLEMA 17
Se dispone de un clon en el vector pVAN conteniendo el gen anti-freezing de un raro
sapo ucraniano. El esquema del clon es el siguiente:
GM2008 – Guía de problemas
17
pVAN
________________________________________________________________
|
|
|
|
EcoRI
HindIII BamHI
AvaI
______
50 pb
_________________________________________
2500 pb
Se sabe que el ATG (codón de iniciación de la traducción) de este gen se encuentra
localizado entre los sitios HindIII y BamHI y que el gen completo mediría unas 500 pb
pero no se conoce la orientación de este gen dentro del clon. Lo que se hizo fueron dos
reacciones independientes de restricción sobre este clon, la primera con las enzimas
BamHI + EcoRI y la segunda con las enzimas HindIII + AvaI. Ambos fragmentos se
purificaron de gel de agarosa y se subclonaron en el vector pTT, cuyo polilinker se
indica debajo:
Utilizando el oligonucleótido pTT sense, que primea 20 pb río arriba del 5´ del
polylinker de pTT, se hicieron reacciones de secuenciación sobre ambos clones,
llamados pTT BE y pTT HA, respectivamente. Las secuencias obtenidas se indican
debajo (ambas en sentido 5´-3´):
Reacción sobre el clon pTT BE:
TAAAGCTTGGATCCAATTGATAAATGAAACACCGGCTCAATTTTCCCGAA
GATAAGCTTAAAGCGGCGT
Reacción sobre el clon pTT HA:
TAAAGCTTATCTTCGGGAAAATTGAGCCGGTGTTTCATTTATCAATTGGAT
CCGGGTATCAACAA
1. Indique la orientación del gen en el clon del vector pVAN original y la secuencia
codificante del gen anti-freezing que obtuvo de este experimento.
2. Indique una estrategia de subclonado de este gen al vector de expresión pQUIT (que
da un producto de fusión con una proteína de unión a quitina) cuyo polylinker consta de
las enzimas 5´- BamHI-HindIII-EcoNI-EcoRI-AvaIPstI-3´.
3. Indique las características generales que debería reunir un vector de expresión
bacteriano del tipo pQUIT.
NOTA: Sitios de reconocimiento para las enzimas mencionadas
HindIII: AAGCTT
BamHI: GGATCC
EcoRI: GAATTC
GM2008 – Guía de problemas
18
AvaI: CXCGXG
PstI: CTGCAG
Codon iniciación de la traducción: ATG.
Codones de finalización de la traducción: TAA, TGA, TAG.
PROBLEMA 18
Obtuve el gen que codifica para una proteína de interés, a partir del rastreo de una
genoteca de expresión en el vector λgt11. Ahora para continuar con la manipulación de
este fragmento tengo que subclonarlo en los plásmidos pUC18 y pGEX-1. ¿Por qué?
Mapa del inserto en λgt11:
Diseñar el protocolo completo para subclonar el fragmento de interés desde el fago
λgt11 a los dos plásmidos (con la figura que se incluye y usando los manuales y
protocolos que se les proporcionan).
Polilinker pUC18
GM2008 – Guía de problemas
19
PROBLEMA 19
El plásmido p7000 de 3.000pb contiene un origen de replicación bacteriano y un gen de
resistencia a ampicilina. Además posee el plásmido pUC19 conteniendo un fragmento
de ADN clonado en el sitio EcoRI de su polylinker de 200pb, que codifica para el gen
de resistencia a tetraciclina (indicado con una flecha negra en el gráfico). Su jefe quiere
que usted obtenga un plásmido de resistencia a ambos antibióticos. Los mapas de
restricción de ambos plásmidos son los siguientes:
Los sitios de restricción para las enzimas indicadas son:
StuI: 5´AGG^CCT 3´
SalI: 5´G^TCGAC 3´
PvuII: 5´CAG^CTG 3´
EcoRI: 5´G^AATTC 3´
Usted decide realizar el clonado utilizando el sitio EcoRI. Explique brevemente el
protocolo de pasos a seguir. Cuando aisla clones supuestamente recombinantes, usted
decide analizarlos por restricción, utilizando las enzimas EcoRI y SalI, obteniendo los
siguientes resultados:
GM2008 – Guía de problemas
20
1. Explique a que se debe el polimorfismo de los clones obtenidos. ¿Tiene este resultado
alguna relevancia para sus experimentos?
2. ¿Cómo podría hacer un clonado direccionado?
PROBLEMA 20
Se quiere clonar un fragmento de ADN que contiene un gen de interés en el vector pVer
en el sitio Sma1. En la figura se muestran los sitios de corte en el fragmento a clonar y
en el vector. Indique los pasos a seguir para el subclonado, es decir:
1. ¿Con qué enzimas cortaría el inserto para subclonarlo?
2. ¿Cómo prepararía el vector?
3. ¿Cómo haría para poder ligar el inserto en el vector?
4. ¿Cómo haría para saber la orientación del inserto?
BbeI
BstxI
EcoRI HindIII
HindIII: 5’ protuyente
BstxI: 3’ protuyente
SmaI: romo
BbeI: 3’ protuyente
GM2008 – Guía de problemas
21
PROBLEMA 21
Se pretende subclonar un fragmento de 600 pb liberado por la enzima EcoRI, en el
vector pUC19 (AmpR, permite el rastreo por pérdida de actividad β-galactosidasa). El
fragmento se purificó mediante corrida en gel de agarosa y se largaron las siguientes
reacciones de ligación en un volumen final de 10 µlitros:
Reacción
Inserto
pUC19 / EcoRI
PUC19 / EcoRI / CIP
Buffer ligasa 10X
ATP 100mM
pUC19 100pg
Agua
Ligasa
1
1
1
1
1
5
1
2
1
1
1
1
5
1
3
1
1
1
6
1
4
1
1
1
6
1
5
1
1
1
6
1
6
1
1
1
6
-
7
1
1
7
-
CIP: fosfatasa alcalina.
Con las reacciones de ligación se transformaron bacterias E. Coli competentes que se
plaquearon sobre medio LB conteniendo Amp, IPTG y X-Gal. Se las dejó crecer una
noche a 37ºC y se analizaron las colonias obtenidas.
Reacción
1
2
3
4
5
6
7
colonias azules
2900
100
100
3200
100
100
5000
colonias blancas
26
650
0
5
0
0
0
1. Explique brevemente para qué se realizó cada reacción y los resultados obtenidos y
en cual de ellas espera encontrar la construcción deseada.
2. ¿Qué ensayos utilizaría para comprobar que ha obtenido la construcción deseada?
3. Sabiendo que se plaqueron en todos los casos 5 ul del volumen total de recuperación
(1 ml), calcule la eficiencia de transformación.
PROBLEMA 22
Un experimentado investigador se encuentra realizando una serie de construcciones.
Todas consisten en la inserción de un fragmento de ADN obtenido por digestión de un
plásmido con BamH I (G/GATCC) y Bgl II (A/GATCT), purificado luego de un gel de
agarosa, en un vector digerido con las mismas enzimas y con sus fosfatos 5´ terminales
eliminados por tratamiento con fosfatasa alcalina. En cada caso se trata de una
preparación de vector diferente. Durante unos días se dedicó a ligar y transformar, y
finalmente se sentó a analizar sus resultados. La tabla muestra las colonias observadas
en las placas en las que se rastrillaron las bacterias transformadas con las distintas
ligaciones.
GM2008 – Guía de problemas
22
1. ¿Era necesario el tratamiento con fosfatasa alcalina de los vectores?
A
B
C
D
E
F
1
Sin ligasa
2
Con ligasa
2
1
300
2
2
0
4
6
305
310
3
0
3
Inserto:vector
(1:1)
8
95
320
330
1
1
4
Inserto:vector
(3:1)
50
44
350
380
2
3
5
Inserto:vector
(9:1)
97
6
390
420
0
7
6
0,1 ng vector sin
cortar
52
47
45
61
50
6
Luego de mirar los resultados, se dio cuenta que algunos subclonados habían andado
mejor que otros. Decidió tratar de aprovechar estas placas al máximo y, en paralelo,
mejorar las ligaciones que habían tenido problemas.
2. La siguiente es una lista de las seis decisiones que tomó respecto de cada una de las
ligaciones. Asigne una de estas decisiones a una y solo una de las ligaciones. No
repita opciones, lealas todas antes de empezar.
A. Transferir las placas 3, 4 y 5 a nitrocelulosa e hibridarlas con el inserto marcado
radioactivamente.
B. Picar 10 colonias de la placa 3 (inserto 1X) y analizar la presencia del inserto
cortando con enzimas de restricción.
C. Idem 1.
D. Picar todas las colonias de las placas 3, 4 y 5 y analizar la presencia del inserto
cortando con enzimas de restricción.
E. Descartar las placas y empezar de nuevo.
F. Picar 10 colonias de la placa 5 y analizar la presencia del inserto cortando con
enzimas de restricción.
3. En el caso del análisis con enzimas de restricción de los posibles recombinantes,
¿utilizaría usted Bgl II y BamH I? Con los resultados de dos de las ligaciones se mostró
conforme (¿Cuales son?), pero con los otros decidió hacer nuevos intentos modificando
algún aspecto del protocolo.
4. Asigne una de las siguientes modificaciones a una de las cuatro ligaciones a mejorar.
No repita opciones, léalas todas antes de empezar.
A. Transformar lo que quedó de la primera ligación en bacterias competentes de alta
eficiencia.
B. Tratar nuevamente al vector con fosfatasa alcalina, esta vez usando mayor cantidad
de enzima.
C. Preparar un nuevo vector, digiriendo un DNA más puro con ambas enzimas en
cantidad y tiempos controlados y tratando luego con fosfatasa alcalina.
D. Realizar una nueva ligación usando más ligasa.
GM2008 – Guía de problemas
23
PROBLEMA 23
En los ensayos de ligación para el subclonado de un gen (500 pb) se probaron dos
vectores (3.000 pb). Tanto inserto como vector fueron digeridos con la misma enzima
de restricción y las preparaciones de vector fueron tratadas con fosfatasa alcalina. De las
transformaciones se obtuvieron los siguientes resultados:
Inserto
16 ng
10 ng
3 ng
10 ng
-
Vector 1
20 ng
20 ng
20 ng
20 ng
1ng sin cortar
Transformantes 1
100
30
10
0
5
200
Vector 2
20 ng
20 ng
20 ng
20 ng
1 ng sin cortar
Transformantes 2
400
320
250
0
280
150
1. ¿Qué relaciones molares de Inserto:Vector se usaron?
2. ¿Que problema presentaron las preparaciones del vector 1 y 2? ¿Qué control falta
para saber qué fue lo que anduvo mal? ¿Cuál de las transformaciones usaría para
continuar con el subclonado?
3. Teniendo en cuenta que se plaqueo una quinta parte de cada transformación, calcule
la eficiencia de transformación con cada uno de los vectores.
PROBLEMA 24
Usted está intentando clonar una pequeña proteína de unión a RNA de Trypanosoma
cruzi que estaría involucrada en la regulación de la expresión génica. Luego de un
intenso trabajo de rastreo de una biblioteca y subclonado logró aislar un pequeño
fragmento genómico conteniendo aparentemente la secuencia completa de la proteína
buscada (cuyo tamaño es de 78 pb incluyendo el codón de inicio y stop). Usted tiene
clonado el fragmento genómico en el vector pSPLIII en los sitios HindIII y XhoI. Para
confirmar la identidad de su proteína, y que clonó la secuencia completa decide
secuenciar el inserto. Justo cuando está por hacer la reacción de secuencia se da cuenta
de que cometió un error en la dilución de los ddNTPs y estos están más concentrados,
por lo cual solo podrá obtener secuencias muy cortas. Para solucionar esto decide usar 4
oligos (dos que hibridan en el vector, y dos heterólogos que hibridan en diferentes
lugares de la secuencia codificante) y hacer cuatro recciones de secuencia de tal forma
de que podría obtener la secuencia completa a partir de la unión de los distintos
fragmentos.
En la siguiente hoja se muestran los resultados de las cuatro secuencias obtenidas.
GM2008 – Guía de problemas
24
1. Escriba las secuencias obtenida de cada una de las reacciones (de 5` a 3`). Logró
obtener la secuencia completa de la proteína? Determine en todos los casos en que sea
posible si la secuencia obtenida pertenece la hebra codificante o la complemetaria.
2. Haga un esquema indicando la posición relativa de cada uno de los fragmentos
secuenciados, los sitios de corte donde se clonó el inserto completo, posibles sitios de
corte internos, codones de iniciación y stop, y las secuencias pertenecientes al vector si
es que hay alguna. Una vez que logró confimar la identidad de su proteína decidió
subclonarla en el vector de expresión pVAC II para obtener su proteína recombinante y
hacer ensayos de unión a RNA. Este vector expresa proteínas como fusión carboxilo
terminal con GST para facilitar su purificación. El polilinker o Sitio de Clonado
Múltiple (SCM) de dicho vector se muestra en la figura.
3. Diseñe y describa detalladamente una estrategia para clonar la secuencia completa de
su proteína en el vector de expresión pVAC II.
4. ¿Qué elementos debe tener necesariamente un vector de expresión en organismos
procariotas?
GM2008 – Guía de problemas
25
PROTEÍNAS
PROBLEMA 25
La proteína X es codificada por un único gen en el mosquito, que tiene 15 Kb de
longitud y sólo se expresa en músculo y en cerebro. En el músculo produce un ARNm
de 3 Kb de longitud, en tanto que en cerebro da un ARNm de 2.7 Kb.
• El ARNm de músculo se traduce en un polipéptido de 750 aminoácidos. La
proteína X de músculo corre como una única banda de 220 KDa en peso
molecular en geles de poliacrilamida con SDS sin previo tratamiento con
mercaptoetanol. Cuando la misma proteína es tratada con mercaptoetanol da una
única banda en el gel de 110 KDa,
• El ARNm de cerebro se traduce en un polipéptido de 650 aminoácidos. La
proteína X de músculo corre como una única banda de 71.5 KDa en geles con
SDS, tanto sin como con tratamiento previo con mercaptoetanol.
• Otros datos: El peso molecular promedio de cada aminoácido es 110 Da. En
ninguno de los dos tejidos la proteína sufre proteólisis post-traduccional.
1. ¿Cómo explica la diferencia entre el tamaño del gen y el de sus mensajeros?
2. ¿Cómo explica la diferencia de tamaño entre el ARNm de músculo y el de cerebro?
3. ¿Cuál es la longitud de las regiones 5´y 3´ no codificantes del ARNm de músculo?
¿Y la del ARNm de cerebro?
4. ¿Cuál de las dos proteína podría estar glicosilada y dónde? Justifique.
PROBLEMA 26
Con motivo de encarar el screening de una genoteca de expresión, se desea fabricar
anticuerpos policlonales contra una proteína cuyo gen se desea clonar. Conociendo el
peso molecular aparente (estimado usando una columna de filtración molecular), decido
hacer una electroforesis preparativa en gel de poliacrilamida bajo condiciones
desnaturalizantes (SDS-PAGE). Siembro una purificación parcial de la proteína, y luego
de una buena resolución, corto el gel en la región correspondiente al tamaño de la
proteína. Con esto inmunizo animales. Plantee los riesgos asociados a esta estrategia
que podrían hacer fracasar el objetivo final (encontrar y clonar el gen buscado).
PROBLEMA 27
En células vegetales, la disponibilidad de la cab (proteína que se une a la clorofila) es
clave para el proceso de fotosíntesis. La proteína cab está codificada por un gen cuya
expresión es exclusiva de tejidos verdes y está regulada por la luz solar, a nivel de
transcripción.
Se clonó el promotor más la región regulatoria del gen cab y se lo fusionó río arriba del
ADNc de la luciferasa.
La construcción Prom. cab-ADNc luciferasa fue introducida en tejidos embrionarios de
plantas de tabaco, las cuales dieron lugar, después de un tiempo, a plantas transgénicas
que contenían una sola copia del transgén en todas sus células.
Al rociar las plantas transgénicas con el sustrato de la luciferasa, llamada luciferina,
éstas emitieron luz (o sea, fueron luminiscentes) en determinados momentos del día. Tal
emisión de luz fue medida en hojas intactas a distintas horas, comenzando a las 6 de la
mañana (figura 1).
Para confirmar a nivel molecular los resultados logrados, se extrajo ADN, ARN y
proteínas totales a partir de hojas de una planta transgénica a las mismas horas en que se
GM2008 – Guía de problemas
26
realizó el ensayo de luminiscencia, para realizar experimentos de Southern blot,
Northern blot y Western blot que se muestran a continuación (figuras 2, 3 y 4).
1. ¿Podría afirmar que la luciferasa es monomérica? ¿Por qué?
2. ¿Qué porcentaje aproximado de cada molécula del ARNm maduro de la luciferasa es
codificante? (dato: 1 aá = 110 Da).
3. ¿Qué tipo de resultado esperaría de un Southern como el de la figura 2 si se usa como
sonda el promotor del gen de la luciferasa?
4. Usando como sonda en el mismo Southern al promotor del gen cab se obtienen dos
bandas de hibridación, una de 5 y otra de 8 kb. ¿Por qué?
5. Qué tipo de resultado (presencia o ausencia de banda/s, variación a lo largo del día)
esperaría de un Northern de hoja de planta transgénica si usara como sonda:
a. el promotor del gen cab.
b. un exón de 300 pb de largo, del gen de la luciferasa?
6. ¿Qué puede concluir del ritmo temporal de la expresión del gen cab en hojas de
tabaco salvaje (no transgénico)?
7. En estos experimentos, el DNAc de luciferasa es utilizado como gen reportero ya que
la actividad de su producto es fácil de medir. La enzima luciferasa, al tener una vida
media corta de sólo 5 min, es apropiada como enzima indicadora en los experimentos de
luminiscencia y Western. ¿Es correcto este razonamiento? ¿Qué resultados de Northern
y Western se habrían obtenido si en lugar del DNAc de luciferasa se hubiera utilizado el
DNAc de otra proteína reportera cuyo RNAm tuviera la misma vida media que la del
RNAm de luciferasa, pero la proteína tuviera una vida media de 10 horas?
Nota: vida media de una población de moléculas es el tiempo en que se degrada el 50%
de las mismas.
8. ¿Se alterarían los resultados de luminiscencia (fig.1) y Western (fig.4) si antes de
efectuar los respectivos experimentos las hojas fueran calentadas a 80ºC?
9. ¿Qué resultados de los experimentos anteriores (figs. 1, 2, 3 y 4) se alterarían (y de
qué manera?) si el material vegetal proviniera de la raíz de una planta transgénica en
lugar de la hoja?
10. ¿Qué resultados de los experimentos anteriores se alterarían (y de qué manera?) si el
cDNA de la luciferasa usado como parte del transgén hubiera sufrido una mutación
consistente en la inserción de un nucleótido extra entre el primer y el segundo codón?
GM2008 – Guía de problemas
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