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Enfermedades bacterianas sistémicas de cítricos:
Diagnóstico molecular de HLB y ecología molecular de
CVC, un proyecto de colaboración argentino-brasileño
L Delfederico, H. Della Coletta Filho, N. Costa, MI Plata, G Truol, R
Haelterman, L Semorile
Proyecto:
PICT-CABBIO (Rs N°055/2009)
Grupos de trabajo
Argentina:
UNQ: Liliana Semorile (IR)
Lucrecia Delfederico
EEA-INTA Concordia:
Norma Costa
María Inés Plata
IFFIVE:
Graciela Truol
Raquel Haelterman
Brasil:
Centro APTA Citros Sylvio Moreira – IAC, SP
Helvecio Della Coletta Filho (Coordinador)
Marcos Antonio Machado
Marco Aurélio Takita
Alexandre A. do Amaral
Introducción
Relevancia del problema
Hipótesis de trabajo
Objetivos
Metodologías propuestas
Cronograma
Productos
Producción mundial de cítricos. Citricultura argentina
Introducción
La citricultura es la actividad de mayor
importancia económica del mercado
mundial de frutales, con una producción
para el año 2007, de 96 millones de
toneladas (FAO).
Los principales productores de cítricos
son Brasil, China y Estados Unidos.
Argentina ocupa el noveno lugar con una
participación del 3,5%.
Dentro de la fruticultura, en Argentina el
cultivo de citrus es la segunda actividad
en importancia socioeconómica, detrás
de la vitivinicultura.
Fuente: SAGPyA
Introducción
Patógenos y vectores, situación en Brasil, situación en Argentina
Huanglongbing (HLB) y Clorosis Variegada de los Cítricos (CVC):
 Enfermedades bacterianas
 Agentes causales, Candidatus Liberibacter spp. y Xylella
fastidiosa, localizados en el interior de vasos conductores de la
planta, difícil control químico
 Transmitidas por vectores y material vegetal propagativo
Introducción
HLB:
 Recientemente introducida en América (Brasil, 2004, Florida, 2005, Cuba,
2006) resulta devastadora para la producción citrícola mundial. En la
actualidad existe en cerca de 40 países de Asia, Africa, Oceanía, América del
Norte, Central y del Sur.
 Agente causal: bacteria Gram negativa, aún no cultivada ?
Candidatus Liberibacter asiaticus (Asia, Brasil y Florida, USA)
Candidatus Liberibacter africanus subespecie capensis (Africa)
Candidatus Liberibacter americanus (Brasil).
 Candicatus Liberibacter psyllaurus, afecta a plantas solanáceas (tomate y
papa) y es transmitida por el psílido Bactericera cockerelli, desconociéndose
su potencial para producir HLB en cítricos.
 Vectores capaces de transmitirla, psílidos: Tryoza erytreae (África) y
Diaphorina citri, en países de Asia y en América.
En Argentina está presente el vector en distintas zonas geográficas, pero aún no
se reportó la presencia de la enfermedad.
Introducción
CVC:
 Agente causal: Xylella fastidiosa, bacteria patógena de plantas,
nutricionalmente exigente, que habita el xilema de múltiples especies
hospedadoras. Diferentes subespecies son responsables de enfermedades
en otros cultivos de interés comercial como uva, ciruela, y café.
 Afecta principalmente naranjos dulces (Citrus sinensis)
 Vectores: insectos homópteros cicadelinos (Homoptera- Cicadellidae).
 Reportada en Argentina y Brasil desde hace 20 años, actualmente es
endémica en el estado de São Paulo (Brasil). La cepa brasileña 9a5c de X.
fastidiosa presenta semejanzas genómicas con el aislamiento Fb7 de Bella
Vista, Corrientes (da Silva et al., 2007).
Hipótesis de trabajo
Necesidad de abordar estudio-diagnóstico de HLB:
 presencia del vector en nuestro país
 cercanía de estados brasileños afectados por la enfermedad.
Ante esta situación es urgente la optimización de métodos moleculares que
permitan la temprana detección de la presencia de la bacteria en el psílido y
en plantas aún asintomáticas a fin de establecer las bases de un sistema de
monitoreo efectivo de alcance nacional.
CVC:
 Datos de unas pocas provincias, vector y enfermedad.
 Necesidad de estudio sistematizado del patógeno a nivel molecular
Un proyecto de este tipo posibilitará su comparación con otras de diferente
procedencia y contribuirá a los estudios básicos complementarios sobre un
fitopatógeno del que se disponen varias secuencias genómicas completas.
Relevancia del problema
 La producción argentina abastece el consumo interno y compite en
el mercado de la Unión Europea, en donde los problemas sanitarios
pueden ser motivo de aplicación de trabas proteccionistas.
 El agotamiento de estrategias como la convivencia con las
enfermedades o el control químico de vectores (debido a los
elevados costos y a la acumulación de residuos químicos
indeseables y su consecuente restricción de mercados), requiere
soluciones más sustentables para la actividad citrícola.
 Las diferencias anteriormente citadas, sumadas a las climáticas que
determinan variaciones en la distribución, por ejemplo, de insectos
vectores, establecen que los problemas sanitarios deban ser
abordados según cada realidad regional.
Objetivos
CVC:
Caracterizar microbiológica y molecularmente los aislamientos de
Xylella fastidiosa de naranjos dulces del NEA y conocer las
variantes genéticas presentes en nuestro país y su relación
con las poblaciones de Brasil.
HLB:
Optimizar las metodologías de diagnóstico molecular (qPCR)
considerando las nuevas secuencias genómicas de los
agentes causales disponibles en bancos de datos.
Metodología de trabajo
Candidatus Liberibacter – HLB:
 Análisis de secuencias de genes de inositol-1-monophosphatase
(suhB), phosphoserin aminotransferase (serA), factor de elongación
Ts (tsf) de Ca. Liberibacter asiaticus y Ca. Liberibacter americanus y
diseño de primers (multiplex)
 Validación de primers en muestras cítricas con y sin síntomas,
(Brasil) y en psílidos de cultivares con y sin incidencia (Brasil y
Argentina)
 Generación de probes para qPCR (en vector y planta) según
regiones genómicas de mayor especificidad
Metodología de trabajo
Xylella fastidiosa – CVC:
 Estudio de poblaciones, DGGE
 Obtención y selección de aislamientos
 Tipificación de aislamientos, ARDRA (16S rDNA-ITS , MLST)
 Comparación de secuencias de aislamientos argentinos y brasileños,
análisis filogenético
Cronograma
Año I
Año II
CVC
Aislamiento y poblaciones de X. fastidiosa
IFFIVE, EEA Concordia.
Tipificación, MSLT
UNQ-IFFIVE
HLB
Análisis de secuencias en base de datos
Diseño de primers
Establecimiento de las condiciones de amplificación
Brasil-UNQ, Arg.
Validación condiciones de
amplificación
Brasil-UNQ- EEA Concordia
Análisis de datos
Redacción de manuscritos
Productos esperados
Al finalizar el proyecto, al cabo de dos años, se espera haber obtenido:
para HLB:
Una mejora en la eficacia de detección de los patógenos Ca.
Liberibacter asiaticus y americanus, basada en PCR usando primers
dieñados sobre genes alternativos al 16S rDNA.
Para CVC:
El comienzo de un estudio sistematizado a nivel molecular que posibilite
la comparación de poblaciones autóctonas con otras de diferente
procedencia estableciendo relaciones filogenéticas entre las mismas.
Gracias !
Operón ribosomal
16S
5’
23S
5S
3’
Genes codificantes de los diferentes RNAs organizados en el operón rrn. El número
de operones para una especie dada puede oscilar entre 1 y 11.
La disposición de los genes en el operón es, con pocas excepciones: 16S–23S–5S,
separados entre sí por los espaciadores ribosomales 16S-23S y 23S-5S,
respectivamente.
El gen 16S rRNA es el más empleado en estudios de diversidad microbiana tanto por
la naturaleza de su secuencia, mosaico de regiones conservadas intercaladas con
segmentos variables e hipervariables como por la disponibilidad de una extensa
base de datos de secuencias de este gen.
Amplificación del fragmento de DNA
Ligación en pGem-T
Transformación de bacterias
electrocompetentes con el plásmido
recombinante
Selección de los clones presuntivos
Cultivo de los clones positivos y
extracción de DNA plasmídico
Secuenciación con primers
universales
Clonado en el sistema pGEM-T Easy Vector
Electroporación
Colony PCR
Cultivo de clones positivos
Extracción de DNA plasmídico
ARDRA (Amplified Fragment Length Polymorphism)
Amplificación por PCR del
gen rRNA 16S
En general, es posible usar primers
universales debido a la presencia de
secuencias 5’ y 3’ conservadas en el
gen rRNA 16S
Ventaja: No requiere información
previa de la secuencia del mismo
Con ciertas variaciones, es posible
analizar comunidades microbianas