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Enfermedades bacterianas sistémicas de cítricos: Diagnóstico molecular de HLB y ecología molecular de CVC, un proyecto de colaboración argentino-brasileño L Delfederico, H. Della Coletta Filho, N. Costa, MI Plata, G Truol, R Haelterman, L Semorile Proyecto: PICT-CABBIO (Rs N°055/2009) Grupos de trabajo Argentina: UNQ: Liliana Semorile (IR) Lucrecia Delfederico EEA-INTA Concordia: Norma Costa María Inés Plata IFFIVE: Graciela Truol Raquel Haelterman Brasil: Centro APTA Citros Sylvio Moreira – IAC, SP Helvecio Della Coletta Filho (Coordinador) Marcos Antonio Machado Marco Aurélio Takita Alexandre A. do Amaral Introducción Relevancia del problema Hipótesis de trabajo Objetivos Metodologías propuestas Cronograma Productos Producción mundial de cítricos. Citricultura argentina Introducción La citricultura es la actividad de mayor importancia económica del mercado mundial de frutales, con una producción para el año 2007, de 96 millones de toneladas (FAO). Los principales productores de cítricos son Brasil, China y Estados Unidos. Argentina ocupa el noveno lugar con una participación del 3,5%. Dentro de la fruticultura, en Argentina el cultivo de citrus es la segunda actividad en importancia socioeconómica, detrás de la vitivinicultura. Fuente: SAGPyA Introducción Patógenos y vectores, situación en Brasil, situación en Argentina Huanglongbing (HLB) y Clorosis Variegada de los Cítricos (CVC): Enfermedades bacterianas Agentes causales, Candidatus Liberibacter spp. y Xylella fastidiosa, localizados en el interior de vasos conductores de la planta, difícil control químico Transmitidas por vectores y material vegetal propagativo Introducción HLB: Recientemente introducida en América (Brasil, 2004, Florida, 2005, Cuba, 2006) resulta devastadora para la producción citrícola mundial. En la actualidad existe en cerca de 40 países de Asia, Africa, Oceanía, América del Norte, Central y del Sur. Agente causal: bacteria Gram negativa, aún no cultivada ? Candidatus Liberibacter asiaticus (Asia, Brasil y Florida, USA) Candidatus Liberibacter africanus subespecie capensis (Africa) Candidatus Liberibacter americanus (Brasil). Candicatus Liberibacter psyllaurus, afecta a plantas solanáceas (tomate y papa) y es transmitida por el psílido Bactericera cockerelli, desconociéndose su potencial para producir HLB en cítricos. Vectores capaces de transmitirla, psílidos: Tryoza erytreae (África) y Diaphorina citri, en países de Asia y en América. En Argentina está presente el vector en distintas zonas geográficas, pero aún no se reportó la presencia de la enfermedad. Introducción CVC: Agente causal: Xylella fastidiosa, bacteria patógena de plantas, nutricionalmente exigente, que habita el xilema de múltiples especies hospedadoras. Diferentes subespecies son responsables de enfermedades en otros cultivos de interés comercial como uva, ciruela, y café. Afecta principalmente naranjos dulces (Citrus sinensis) Vectores: insectos homópteros cicadelinos (Homoptera- Cicadellidae). Reportada en Argentina y Brasil desde hace 20 años, actualmente es endémica en el estado de São Paulo (Brasil). La cepa brasileña 9a5c de X. fastidiosa presenta semejanzas genómicas con el aislamiento Fb7 de Bella Vista, Corrientes (da Silva et al., 2007). Hipótesis de trabajo Necesidad de abordar estudio-diagnóstico de HLB: presencia del vector en nuestro país cercanía de estados brasileños afectados por la enfermedad. Ante esta situación es urgente la optimización de métodos moleculares que permitan la temprana detección de la presencia de la bacteria en el psílido y en plantas aún asintomáticas a fin de establecer las bases de un sistema de monitoreo efectivo de alcance nacional. CVC: Datos de unas pocas provincias, vector y enfermedad. Necesidad de estudio sistematizado del patógeno a nivel molecular Un proyecto de este tipo posibilitará su comparación con otras de diferente procedencia y contribuirá a los estudios básicos complementarios sobre un fitopatógeno del que se disponen varias secuencias genómicas completas. Relevancia del problema La producción argentina abastece el consumo interno y compite en el mercado de la Unión Europea, en donde los problemas sanitarios pueden ser motivo de aplicación de trabas proteccionistas. El agotamiento de estrategias como la convivencia con las enfermedades o el control químico de vectores (debido a los elevados costos y a la acumulación de residuos químicos indeseables y su consecuente restricción de mercados), requiere soluciones más sustentables para la actividad citrícola. Las diferencias anteriormente citadas, sumadas a las climáticas que determinan variaciones en la distribución, por ejemplo, de insectos vectores, establecen que los problemas sanitarios deban ser abordados según cada realidad regional. Objetivos CVC: Caracterizar microbiológica y molecularmente los aislamientos de Xylella fastidiosa de naranjos dulces del NEA y conocer las variantes genéticas presentes en nuestro país y su relación con las poblaciones de Brasil. HLB: Optimizar las metodologías de diagnóstico molecular (qPCR) considerando las nuevas secuencias genómicas de los agentes causales disponibles en bancos de datos. Metodología de trabajo Candidatus Liberibacter – HLB: Análisis de secuencias de genes de inositol-1-monophosphatase (suhB), phosphoserin aminotransferase (serA), factor de elongación Ts (tsf) de Ca. Liberibacter asiaticus y Ca. Liberibacter americanus y diseño de primers (multiplex) Validación de primers en muestras cítricas con y sin síntomas, (Brasil) y en psílidos de cultivares con y sin incidencia (Brasil y Argentina) Generación de probes para qPCR (en vector y planta) según regiones genómicas de mayor especificidad Metodología de trabajo Xylella fastidiosa – CVC: Estudio de poblaciones, DGGE Obtención y selección de aislamientos Tipificación de aislamientos, ARDRA (16S rDNA-ITS , MLST) Comparación de secuencias de aislamientos argentinos y brasileños, análisis filogenético Cronograma Año I Año II CVC Aislamiento y poblaciones de X. fastidiosa IFFIVE, EEA Concordia. Tipificación, MSLT UNQ-IFFIVE HLB Análisis de secuencias en base de datos Diseño de primers Establecimiento de las condiciones de amplificación Brasil-UNQ, Arg. Validación condiciones de amplificación Brasil-UNQ- EEA Concordia Análisis de datos Redacción de manuscritos Productos esperados Al finalizar el proyecto, al cabo de dos años, se espera haber obtenido: para HLB: Una mejora en la eficacia de detección de los patógenos Ca. Liberibacter asiaticus y americanus, basada en PCR usando primers dieñados sobre genes alternativos al 16S rDNA. Para CVC: El comienzo de un estudio sistematizado a nivel molecular que posibilite la comparación de poblaciones autóctonas con otras de diferente procedencia estableciendo relaciones filogenéticas entre las mismas. Gracias ! Operón ribosomal 16S 5’ 23S 5S 3’ Genes codificantes de los diferentes RNAs organizados en el operón rrn. El número de operones para una especie dada puede oscilar entre 1 y 11. La disposición de los genes en el operón es, con pocas excepciones: 16S–23S–5S, separados entre sí por los espaciadores ribosomales 16S-23S y 23S-5S, respectivamente. El gen 16S rRNA es el más empleado en estudios de diversidad microbiana tanto por la naturaleza de su secuencia, mosaico de regiones conservadas intercaladas con segmentos variables e hipervariables como por la disponibilidad de una extensa base de datos de secuencias de este gen. Amplificación del fragmento de DNA Ligación en pGem-T Transformación de bacterias electrocompetentes con el plásmido recombinante Selección de los clones presuntivos Cultivo de los clones positivos y extracción de DNA plasmídico Secuenciación con primers universales Clonado en el sistema pGEM-T Easy Vector Electroporación Colony PCR Cultivo de clones positivos Extracción de DNA plasmídico ARDRA (Amplified Fragment Length Polymorphism) Amplificación por PCR del gen rRNA 16S En general, es posible usar primers universales debido a la presencia de secuencias 5’ y 3’ conservadas en el gen rRNA 16S Ventaja: No requiere información previa de la secuencia del mismo Con ciertas variaciones, es posible analizar comunidades microbianas