Download Pasos generales de la técnica de ELISA

REACCIONES
INMUNOLÓGICAS PRIMARIAS
REACCIONES INMUNOLÓGICAS
CLASIFICACIÓN
REACCIÓN
PRIMARIAS
IN VITRO
MÉTODO
SISTEMA INDICADOR
IF
FLUOROCROMOS
ELISA
ENZIMAS
RIA
ISÓTOPOS
IRMA
ISÓTOPOS
LUMINISCENCIA
LUMINÓGENOS
AGLUTINACIÓN
SECUNDARIAS
PRECIPITACIÓN
FIJACIÓN DE COMPLEMENTO
IN VIVO
TERCIARIAS
ANAFILAXIA
REACCIÓN DE ARTHUS
REACCIONES INMUNOLÓGICAS PRIMARIAS
Fuerza que facilitan la unión AG-AC:
*Uniones electrostáticas
* Uniones o puentes de hidrógeno
* Fuerzas de Van der Waals
* Fuerzas de dispersión de London
REACCIONES
INMUNOLÓGICAS PRIMARIAS
ELISA
Elección de una técnica inmunológica
Screening?
Menor número de falsos negativos Técnica sensible
Confirmación? Menor número de falsos positivos Técnica específica
A
R
B
C
Sensibilidad
Límite de detección
Sensibilidad de las reacciones inmunológicas
MÉTODO
Límite de
detección
Sensibilidad
relativa
Precipitación en geles
20
1
Precipitación en medios líquidos
10
2
RFC
5
4
Aglutinación
0.4
50
HAI
0.15
133
IF
0.05
400
ELISA
0.01
2000
RIA
0.001
20000
EIA: ELISA
Se basan en dos fenómenos biológicos importantes:
1.- elevada especificidad de los Ac
2.- alta actividad de algunas enzimas, lo que permite la amplificación de
la señal generada por la muestra
Empleo de anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los
conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como
enzimática.
Clasificación
Homogéneos: fase líquida
Heterogéneos: fase sólida
ELISA heterogéneo
• COMPETITIVO
Determinación de Ac
Y YY
• NO COMPETITIVO
Determinación de Ag
Determinación de Ac
Pasos generales de la técnica de ELISA
1.- Interacción con la fase sólida
Soporte: placas de poliestireno, PVC
Condiciones: 4ºC, toda la noche; 25ºC 4 h; 37ºC, 1h.
SENSIBILIZACION. Buffer: carbonato-bicarbonato pH 9,6
Proteína nativa: Conserva sus epitopes configuracionales y
conformacionales. Epitopes crípticos.
Lavados. Etapa crítica. Separar componentes que puedan reaccionar
en forma no específica, cualquiera sea la variente del método.
PBS/Tween 20 (se realizarán después de cada paso)
Importancia de la optimización de la
concentración del inmunorreactante en fase sólida
Capacidad de saturación de la placa
Inconvenientes: pérdida de inmunorreactante
(formación de multicapas), competencia por los sitios
Determinación de
antígeno
(ELISA de captura)
Determinación de
anticuerpo
1-10 ug/ml Ag o Ac puros
10-100 ug/ml para mezclas antigérnicas complejas
Pasos generales de la técnica de ELISA (cont.)
2.- Bloqueo: se realiza para bloquear todos los sitios de la
placa que no fueron ocupados por el antígeno.
Proteína inerte para el sistema. Ej. leche descremada
en PBS 7,4.
Condiciones: 1h a 37ºC, 2h a temperatura ambiente, toda la
noche a 4°C.
Proteína inerte
placa
Ag
Pasos generales de la técnica de ELISA (cont.)
3.- Reacción Ag-Ac: En un ELISA indirecto los Ac que se desean
investigar provienen de fluidos biológicos (ej.: suero) el cual se pone
en contacto con el Ag que está adherido a la placa.
Condiciones: 1h a 37ºC o toda la noche a 4ºC.
Diluyente: PBS pH 7,4, Tween 20, proteína inerte.
Suero que contiene Ac
contra los antígenos
adheridos a la placa
Pasos generales de la técnica de ELISA (cont.)
4.-Incubación con el conjugado: Para poner en evidencia los Ac que
se encuentran unidos al Ag, se incuba con un segundo Ac que está
dirigido hacia la cadena pesada del primero. Este segundo Ac se
encuentra conjugado a una enzima.
Ejemplo: Deseo revelar la presencia de IgGh. El segundo Ac será
una anti-cadena gama humana marcado con la enzima.
Enzimas más empleadas: peroxidasa, fosfatasa alcalina, ureasa, etc.
Condiciones: 1h a 37°C
Conjugado:
Ac, dirigido contra la cadena
pesada del primer Ac,
marcado con la enzima.
Pasos generales de la técnica de ELISA (cont.)
5.- Revelado: en este paso se incuba con una solución de revelado que
contiene el sustrato de la enzima y un cromógeno, el cual debido a la
actividad enzimática sobre el sustrato induce un cambio en el estado de
oxidación del cromógeno. Este último pasa de una sustancia incolora a
un producto coloreado.
Condiciones: 15 a 30 min a temperatura ambiente.
Sustrato de revelado:
sustrato de la enzima,
cromógeno y buffer del
sustrato.
Pasos generales de la técnica de ELISA
5.- Revelado (cont.):
Cromógeno o prod. formado
Ej. peroxidasa
2DH + H2O2
2 H2O + 2D
Donante de hidrógeno: OPD, o-fenilendiamina
6.- Reacción de parada: agregado de H2SO4 4N
Pasos del ELISA
Resultados
1. Sensibilización
Revelado
Lavado
PBS-T
Lavado
PBS-T
Lavado
PBS-T
2. Incubación con la muestra
3. Incubación con el conjugado
Reacción Ag-Ac. Determinación de anticuerpos
ELISA no competitivo
(tipo sandwich)
Búsqueda de Ag
Ac anti- TNFa
marcado con enzima
Ac anti- TNFa
TNFa
ELISA competitivo (tipo
sandwich)
Búsqueda de Ag
TNFa
marcado con enzima
Ac anti- TNFa
TNFa de la muestra
Procesamiento de los datos y expresión de resultados
Ensayo de ELISA
Punto de corte:
cualitativo
semicuantitativo
X + 2 SD
cuantitativo: Curva patrón
Sistema
no competitivo
Sistema competitivos
Tipos de curvas patrones (análisis cuantitativo)
R
Competitivo
C
R
No competitivo
C
Sistemas alternativos de reconocimiento
Sistema proteína/biotina (vitamina).
Avidina: proteína de la clara de huevo.
Estreptavidina: proteína producida por ciertas levaduras.
Sistema Digoxigenina/anti-Digoxigenina (DIG/anti-DIG).
Esteroide que se encuentra en forma natural sólo en dos especies de
plantas del género Digitalis.
Proteína A: proteína de la pared de S. aureus.
Peroxidasa
Px
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Biotina
Y
Y
Avidina
Y
Biotina
Px
Y
Sistema Avidina/biotina
DIG
Sistema DIG/anti-DIG
Peroxidasa
Px
Y
Y
Y
Y
Y
Proteína A
IgG
Sistema Proteína A
Diseño de ELISA de captura (no competitivo) para la
determinación de p24 en suero de paciente
infectado con HIV
suero
Ac monoclonal anti-p24
Ac monoclonal anti p24-POD
1° Sensibilización de la placa con anticuerpos monoclonales antip24 (proteína del core de HIV)
Incubación-Lavado PBS-Tween 20 0.05%
2° bloqueo con leche descremada al 1% en PBS
Incubación-Lavado PBS-Tween 20 0.05%
3° Adicionar la muestra (suero de paciente infectado)
Incubación 60 min a 37°C-Lavado PBS-Tween 20 0.05%
4° Adicionar el conjugado (anticuerpos monoclonales anti-p24
marcado con POD)
Incubación 30 min a 37°C-Lavado PBS-Tween 20 0.05%
5° Adicionar la solución de sustrato (TMB)
Incubación 30 min a 37°C
Formación de un color azul verdoso
6° Adicionar solución stop (2M Ac. Sulfúrico)
7° Leer absorbancia a 450nm. Cálculos. Procesamiento de datos.
OBJETIVO
Análisis cualitativo: presencia o ausencia de p24 en suero de paciente infectado
con HIV
Por lo tanto necesitamos comparar con un control positivo y un control negativo.
Cut-off
(punto de corte)
CONTROL POSITIVO
A
B
C
D
REACCIÓN POSITIVA
P24 (antígeno recombinante)
CONTROL NEGATIVO
Suero humano normal (no posee p24)
El sustrato no es
No se une el reducido
conjugado
No se evidencia color
A
B
C
D
REACCIÓN NEGATIVA
S1
S2
C(-) 3
S3 S4
C(-) 2
S5
Muestras: S1, S2, S3, S4, S5
Controles negativos 1, 2, 3
C(-) 1
En el paso 3 del ELISA de captura adicionamos en diferentes pocillos las muestras
y los controles NEGATIVOS
Diseño de ELISA de captura (no competitivo) para la
determinación de p24 en suero de paciente
infectado con HIV
Suero y/o controles
Ac monoclonal anti-p24
Ac monoclonal anti p24-POD
Lectura a 450 nm
Realizamos el cálculo del punto de
corte (cut-off) con los controles
negativos
Hemos realizado un análisis
cualitativo
Y las muestras cuya lectura supera el punto de corte son consideradas
positivas
Presencia de p24
Y aquellas que son inferiores al punto de corte son consideradas
negativas
Ausencia de p24
Chagatest- ELISA lisado
SIGNIFICACION CLINICA
La enfermedad de Chagas es una infección
parasitaria producida por el Trypanosoma
cruzi.
El diagnóstico de laboratorio depende del
estadio en el cual se encuentre la
enfermedad.
Chagatest- ELISA lisado
• Durante la fase aguda, se efectúa
directamente mediante la comprobación
de los parásitos en sangre o por métodos
inmunológicos que detecten IgM.
• Durante la fase crónica, se pueden usar
métodos inmunológicos como:
hemaglutinación, inmunofluorescencia,
ensayo inmunoenzimático (ELISA) o
Western blot.
FUNDAMENTOS DEL METODO
• Chagatest ELISA lisado es un ensayo
inmunoenzimático "in vitro" para la detección
cualitativa de anticuerpos anti-T. cruzi en
muestras de suero o plasma humano.
• La muestra se diluye en la policubeta, cuyos
pocillos se encuentran sensibilizados con
antígenos de T. cruzi, correspondientes a
zonas altamente conservadas entre distintas
cepas.
• Si la muestra contiene anticuerpos
específicos, éstos formarán un complejo con
los antígenos y permanecerán unidos a la
fase sólida.
• La fracción no unida se elimina por lavado y
luego se agrega el conjugado (anticuerpo
monoclonal anti-IgG humana conjugado con
peroxidasa), el cual reacciona
específicamente con los anticuerpos anti-T.
cruzi inmunocapturados. El conjugado no
unido se elimina por lavado.
• La presencia de peroxidasa unida al
complejo se revela mediante el agregado del
sustrato cromogénico, tetrametilbencidina.
• Las muestras reactivas desarrollan color
celeste. La reacción enzimática se detiene
mediante el agregado de ácido sulfúrico,
produciendo un viraje del color celeste al
amarillo.
• La densidad óptica se mide en forma
bicromática a 450/620-650 nm o a 450 nm
INMUNOFLUORESCENCIA
Desarrollada originalmente por Coons y col (1942). Demostró antígenos
microbianos en tejidos.
Coons AH,Creech HJ, Jones RN: Immunological
properties of an antibody containing a fluorescent
group. Proc Soc Exp Biol Med 1941; 47: 200202.
Actualmente es un método empleado para demostrar antígenos celulares y
tisulares o anticuerpos en fluidos biológicos provenientes de numerosas
condiciones clínicas humanas, animales y experimentales.
INMUNOFLUORESCENCIA
Técnica relativamente poco costosa, rápida, simple, altamente sensible y confiable.
Desarrollada originalmente por Coons y col (1942). Demostró antígenos
microbianos en tejidos.
Ahora es un método usado para demostrar muchos otros antígenos celulares y
tisulares en numerosas condiciones clínicas humanas y animales.
Identificación de microorganismos en materiales infectados (agentes infectivos en
materiales sospechosos)
Identificación de reacciones antígeno-anticuerpo desarrolladas con cantidades
mínimas de reactivos.
Identificación de células comprometidas en la biosíntesis de anticuerpos
Sensibilidad de las reacciones inmunológicas
MÉTODO
Sensibilidad
relativa
Límite de
detección
Precipitación en geles
20
1
Precipitación en medios líquidos
10
2
RFC
5
4
Aglutinación
0.4
50
HAI
0.15
133
IF
0.05
400
ELISA
0.01
2000
RIA
0.001
20000
INMUNOFLUORESCENCIA
Fundamento
Empleo de anticuerpos marcados con sustancias fluorescentes o fluorocromos
Fluorocromo
Excitación
Emisión
Tiempo
Fluorescencia
máx(nm)máx(nm) declin.(nseg)
Isotiocianato
de fluoresceína
495
525
4.5
verde
(FITC)
Isotiocianato
de rodamina
(TRICT)
550
585
3.0
anaranjado-rojiza
PASOS GENERALES
IFD
IFI
Preparación de una impronta, corte tisular o frotis; suspención celular
Fijación
Incubación con anticuerpos antimarcador, conjugado con un
fluorocromo
Incubación con anticuerpos antimarcador, no conjugado
Lavados con solución salina tamponada
Observación entre porta y cubre
Montaje y observación
Incubación con segundo anticuerpos
anti- primer Ac, conjugado con un
fluorocromo
Lavado
Observación
Fundamento
s
Empleo de anticuerpos marcados conjugados con
sustancias fluorescentes o fluorocromos
F
Fluorescencia
Diagrama Jablonski
1°: Excitación: se entrega un fotón de energía por una fuente
externa a un fluoróforo que absorbe, pasando a un estado
electrónico excitado S1’
2°: Duración del estado excitado: existe por un período de
tiempo finito donde el fluorocromo, sufre cambios
conformacionales. En consecuencia la energía de S1’ es
parcialmente disipada produciendo un estado excitado
relajado desde el que se emite la fluorescencia.
3°: Emisión de fluorescencia: un fotón se emite, lo que
permite el retorno al fluoróforo al nivel S0.
INMUNOFLUORESCENCIA
Intensidad de luz
 excitación
Absorción de
luz
 detección
Emisión de luz
Longitud de onda
Fig 1. Principio de medición de la fluorescencia.
Alexa Fluor
Alexa Fluor® dye
Absorption
max. (nm)
Emission
max (nm)
Emission color*
Extinction
coefficient**
Alexa Fluor® 350
346
442
Blue
19,000
Alexa Fluor® 405
401
421
Blue
34,000
Alexa Fluor® 430
433
541
Green/Yellow
16,000
Alexa Fluor® 488
496
519
Green
71,000
Alexa Fluor® 532
532
553
Yellow
81,000
Alexa Fluor® 546
556
573
Orange
104,000
Alexa Fluor® 555
555
565
Orange
150,000
Alexa Fluor® 568
578
603
Orange/Red
91,000
Alexa Fluor® 594
590
617
Red
73,000
Alexa Fluor® 610
612
628
Red
138,000
Alexa Fluor® 633
632
647
Far Red
239,000
Alexa Fluor® 635
633
647
Far Red
140,000
Compuestos orgánicos sintéticos que proporcionan una
señal de fluorescencia más intensa y estable que los
flourocromos convencionales
Invitrogen
Importante
• Las reacciones de IF ponen en evidencia o
demuestran la presencia de antígenos que se
encuentran expresados sobre estructuras las cuales
reciben el nombre de improntas
Bacterias
Parásitos
Células
Tejidos
INMUNOFLUORESCENCIA
Ac-anti Ig fluorocromo
Lavar
amplificada por
complemento
Lavar
Complemento
Lavar
Ac-anti C3
fluorocromo
Y YY
Lavar
YYY
Lavar
INDIRECTA
Y
Y
Corte de tejido
Anticuerpo
Y
Ac-fluorocromo
INDIRECTA
Y
DIRECTA
Lavar
Clasificación Inmunofluorescencia
•Inmunoflorescencia Directa (IFD)
Impronta Ag de interés
•Inmunoflorescencia Indirecta (IFI)
Impronta Ag de interés
Inmunofluorescencia
directa
Utiliza un solo anticuerpo
Inmunofluorescencia
indirecta
Utiliza un 2° anticuerpo conjugado
Anticuerpo 2°
Anticuerpo 1°
Anticuerpo 1°
Antígenos
Ventajas y
desventaja
s
Antígenos
Se realiza en una etapa
Se realiza en más de una etapa
Alta especificidad con
menos problemas de
background
El mismo anticuerpo conjugado
se utiliza para distintas
reacciones.
Baja sensibilidad
Baja especificidad
Alta sensibilidad
PASOS GENERALES
Preparación de una impronta, corte tisular o frotis; suspensión celular
Fijación
Incubación con el anticuerpo
IFD
IFI
IFD
El anticuerpo esta marcado con un
florocromo.
Lavado con Solución
salina
IFI
El anticuerpo NO ESTA marcado
con un florocromo.
Lavado con Solución
salina
Incubación con segundo
anticuerpos anti- primer Ac,
marcado con un fluorocromo
Montaje y Observación
Lavado con Solución
salina
SISTEMA PARA LA VISUALIZACIÓN DE LA
INMUNOFLUORESCENCIA
FUENTE: lámparas que emiten radiaciones ultravioletas (xenón, halógenas y
de mercurio a altas presiones)
FITRO DE EXCITACIÓN: selecciona la logitud de onda que incidirá en la impronta
( máxima de absorción del fluorocromo)
FILTRO BARRERA: que se coloca entre el ocular y la impronta (eliminación de las
radiaciones dañinas y radiaciones de fondo)
SISTEMA DE MICROSCOPIOS
EPI-ILUMINACIÓN
TRANS-ILUMINACIÓN
Microscopio confocal
APLICACIONES Y EJEMPLOS
DE LA IF
APLICACIONES
IFD: búsqueda de antígenos en cortes de tejido, en la superficie de
microorganismos, identificación de poblaciones celulares, etc.
IFI: búsqueda de anticuerpos en líquidos biológicos, análisis de autoanticuerpos
circulantes (enfermedades autoinmunes).
IFI amplificada por el complemento: detección de anticuerpos fijadores de
complemento específicos para el antígeno fijado en la impronta.
IF de tinción doble: evidenciar la presencia de dos antígenos sobre la misma
impronta con el empleo de dos tipos de anticuerpos marcados con dos
fluorocromos distintos cuyas  de emisión están separadas entre sí.
IF Directa
Aplicación: búsqueda de antígenos en cortes de
tejido, microorganismos, identificación de
poblaciones celulares, etc.
Identificación de Linfocito B por IF
Observación, por
microscopía de
fluorescencia, de las
inmunoglobulinas de
superficie de un
linfocito B
Esquema de la técnica para la observación de las
inmunoglobulinas de superficie de un linfocito B. Un
suero policlonal o monoclonal (a) marcado con
isocianato de fluoresceína (b) reacciona con las
inmunoglobulinas de la membrana.
Detección del receptor de factor de crecimiento epidermal
en biopsia de un tumor humano
Ac anti-EGF marcado con Alexa Fluor 488.
IF de tinción doble
Aplicación: evidenciar la presencia de dos
antígenos sobre la misma impronta con el
empleo de dos tipos de anticuerpos marcados
con dos fluorocromos distintos cuyas  de
emisión están separadas entre sí.
Visualización de filamentos de actina en
Tetrahymena thermophila y celulas endoteliales de
arteria pulmonar bovina
Ac anti-tubulina marcado con
Texas Red.
Ac anti-tubulina marcado con
Alexa Fluor 488.
Visualización de filamentos de actina y
mitocondrias en fibroblastos
Ac anti-tubulina marcado con Alexa Fluor 350, anti proteína inhibidora del complejo
V marcado con Alexa Fluor 500.
Procesamiento e información de resultados
Generalmente en IFD el objetivo es evidenciar la presencia o
ausencia de un Ag de interés. En la mayoría de los casos la
muestra problema es comparada con una que contiene el Ag
de interés (CONTROL +) y otra que no lo contiene
(CONTROL -)
Resultado cualitativo
IF Indirecta
Aplicación: la IFI puede ser empleada con los
mismos propósitos que la IFD. Sin embrago,
tiene gran aplicación en el laboratorio clínico
para demostrar la presencia de anticuerpos en
líquidos biológicos en un amplio número de
patologías.
Células infectadas con el virus de la peste porcina africana
Técnica de IFI. Células MS infectadas con el virus de la peste porcina
africana. Se puede observar como los anticuerpos se han unido a la
células infectadas, destacándose en el citoplasma unas zonas con una
intensidad mayor, que corresponden a zonas de mayor replicación
viral, y por tanto mayor fijación de anticuerpos.
Detección de células germinales en ovario de ratón
Ac 1º anti PGC7 (conejo) , Ac 2º anti IgG de conejo marcado con Alexa
Fluor 488
Prueba de inmunofluorescencia de Crithidia luciae para
anticuerpos hacia el DNA . Prueba diagnóstica en LES.
Determinación de Ac anti-citoplasma de Neutrófilos
(ANCA) en suero de paciente con Vasculitis Sistémica
Impronta con Neutrofilos
Suero Paciente
Control (-)
Ac 2º Ig anti-inmunoglobulinas humanas marcado con FITC
Patrón de IFI de un suero obtenido de un paciente
con AC anti-T. cruzi
Ac 2º Iganti-inmunoglobulinas humanas marcado con FITC
Como informar un título de AC por IF?
1/2
1/4
1/8
1/16
C-
Impronta con T. cruzi fijados
C+
El título de la muestra será la
última dilución que de
fluorescencia positiva
Procesamiento e información de resultados
En el caso de una IFI puedo procesar los resultados de
manera cualitativa. Sin embargo, en el caso que el objetivo
sea determinar el titulo de Ac de una muestra debo emplear
un método semicuantitativo.
Resultado cualitativo y
semicuantitativo.
Procesamiento de los datos
• Cualitativa. Presencia y ausencia. Controles negativos y
positivos
• Semicuantitativa. Informar título. Controles negativos y
positivos
Citometría de flujo