Download DIAGNÓSTICO ETIOLÓGICO DE LAS ENFERMEDADES

FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS
Área de Enfermedades Infecciosas
Trabajo Práctico N° 2
DIAGNÓSTICO ETIOLÓGICO
DE LAS
ENFERMEDADES INFECCIOSAS
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DIAGNÓSTICO DE
ENFERMEDADES INFECCIOSAS
INMUNOLÓGICO
ETIOLÓGICO
Detección de la respuesta inmunológica
Detección del agente
etiológico/toxina
in vivo
-Cultivo, aislamiento e
identificación bacteriana
(Pruebas bioquímicas)
-Aislamiento viral
-Frotis/Extendidos
-Coloraciones específicas y
no específicas.
-Inmunofluorescencia
-ELISA
-PCR
-Microscopía electrónica
HUMORAL
CELULAR
Prueba de
tuberculina
a
in vitro
PRIMARIA
SECUNDARIA
IFI, ELISA, RIA
AGLUTINACIÓN (antígeno particulado)
TERCIARIA
Fijación del complemento,
seroneutralización,
inhibición de la
hemaglutinación
Detección
de
interferón
gamma
PRECIPITACIÓN (antígeno soluble)
Inmunodifusión en gel de agar
EN TUBO
EN PLACA
SAT, 2-Mercaptoetanol
BPA
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DIAGNÓSTICO ETIOLÓGICO
CULTIVO BACTERIANO
El cultivo es el proceso de crecimiento de microorganismos en un medio artificial a partir de
una muestra clínica. Puede realizarse en placa o en tubo. Luego del desarrollo de
microorganismos, se identifica el potencial patógeno mediante las características macro y
microscópicas, desarrollo en medios selectivos o diferenciales y las pruebas bioquímicas
correspondientes.
AISLAMIENTO VIRAL
El aislamiento viral es el método que permite la observación del efecto citopático de un virus
sobre un cultivo celular.
Los cultivos celulares pueden obtenerse a partir de fragmentos (explantes) de órganos o
tejidos o células embrionarias. Los mismos son obtenidos asépticamente y se disocian
tratándolos con una enzima (tripsina) que rompe el cemento intercelular. La suspensión de
células libres se coloca sobre un soporte sólido (plástico o vidrio) en donde las células se
adhieren y multiplican formando una fina capa de células denominada monocapa celular.
Los cultivos celulares en monocapa son los más usados, aunque existen otros tipos (cultivos
en suspensión, cultivos de órganos).
Luego de inoculado con la muestra sospechosa, el cultivo se incuba a 37ºC por un período de
tiempo variable y se observa con microscopio si hay efecto citopático.
El efecto citopático es la visualización de cambios morfológicos característicos en las células
inoculadas producidas por la acción del virus. Cuando los virus no producen este efecto, se
puede recurrir a otras técnicas (hemadsorción, hemoaglutinación e inmunofluorescencia) para
poner en evidencia su presencia en el cultivo.
EXAMEN DE MUESTRAS AL MICROSCOPIO: Frotis y extendidos.
Observación directa
Se realiza un extendido a partir de la muestra clínica o del cultivo sobre la superficie de un
portaobjetos y se coloca un cubreobjetos. Se observa directamente al microscopio con aceite
de inmersión. Permite visualizar morfología, agrupación y movilidad de los microorganismos
presentes.
Tinción Simple
Se realiza un extendido a partir de la muestra clínica o del cultivo sobre la superficie de un
portaobjetos y se tiñe con un solo colorante (tinta china, azul metileno de Loeffler, azul de
lactofenol). Todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad.
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La tinta china o nigrosina permite observar células capsuladas. Los polisacáridos capsulares
rechazan la tinta china y la cápsula aparece como un halo claro alrededor de los
microorganismos.
Azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de heces para
observar la presencia de leucocitos o para tinción de esporas.
El azul de lactofenol permite observar hongos y sus diferentes estructuras.
Observación: Para visualizar estructuras de hongos se utiliza hidróxido de potasio al 10 %.
Este digiere componentes proteicos (por ejemplo: del pelo), liberando al hongo de su interior
para su visualización al microscopio.
Tinción Diferencial
Se realiza un extendido a partir de la muestra clínica o del cultivo sobre la superficie de un
portaobjetos, que se fija y se tiñe con más de un colorante.
Las estructuras celulares (flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad
respiratoria) se diferencian en función de los diferentes colorantes que se fijan de acuerdo a
su constitución química. Los ejemplos clásicos son la tinción de Gram y la de Ziehl-Neelsen.
INMUNOFLORESCENCIA (IF)
Es una técnica utilizada para la detección de moléculas usando Ac marcados con colorantes
fluorescentes (isotiocianato de fluoresceína, rodamina o ficoeritrina). Estas sustancias al ser
excitadas con una luz ultravioleta (190-380nm), emiten luz visible que se observa como una
fluorescencia amarillo-verdosa o anaranjado rojizo, según se haya empleado isotiocianato o
rodamina.
Esta técnica posee dos variantes: inmunofluorescencia directa (diagnóstico etiológico) e
indirecta (generalmente utilizada para diagnóstico serológico).
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Inmunofluorescencia directa (IFD)
Prueba de interacción primaria que se realiza para detectar antígenos presentes en una
muestra de tejido o células de una monocapa infectada (principalmente con virus), mediante el
uso de anticuerpos marcados con una sustancia fluorescente.
ENZIMAINMUNOENSAYO (EIA)
El enzimoinmunoensayo es una técnica versátil y muy sensible, que puede utilizarse para
detectar y medir en una muestra tanto Ag como Ac. Los conjugados que se emplean tienen
como marcadores a diversas enzimas. Las enzimas más utilizadas son la peroxidasa, la
fosfatasa alcalina y la ß-galactosidasa.
Esta técnica recibe diferentes nombres de acuerdo al soporte sobre el que se realiza: cuando
es en placa, se denomina ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay); sobre tejidos,
inmunohistoquímica y sobre células, inmunocitoquímica.
ELISA
Existen muchas variantes de ELISA y su diseño depende de lo que se quiera determinar. Se
utilizan para detectar o cuantificar tanto antígenos como anticuerpos, requieren pequeños
volúmenes de muestra y son relativamente rápidos. Pueden aplicarse fácilmente a diversos
fluidos como leche u orina
El ELISA se realiza en placas de poliestireno de 96 pocillos. En general, uno de los
componentes (antígeno o anticuerpo) se adsorbe sobre un soporte (inmunoadsorbente) y se
agregan antígenos o anticuerpos marcados con una enzima. La reacción antígeno-anticuerpo
quedará inmovilizada y, por lo tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un
substrato específico. Al actuar la enzima sobre el sustrato producirá un color, observable a
simple vista (cualitativo) o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro,
expresándose como densidad óptica (cuantitativo). En cada placa se colocan controles del
sistema y controles positivos y negativos de absorbancia conocida.
Los ELISA utilizados para detectar antígenos son:
ELISA directo: las placas se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones problema
(en las que se sospecha que se encuentra el antígeno). Luego se coloca el Ac marcado con
una enzima.
ELISA sándwich o de captura: se liga a la placa un anticuerpo monoclonal o policlonal como
captura de antígeno. Se agrega el material sospechoso de contener al antígeno y luego se
añaden anticuerpos específicos antiespecie marcados con la enzima.
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Adsorber Ac específico A (captura)
Incubar
Lavar
Agregar muestra problema
(conteniendo o no el Ag)
Incubar
Lavar
Agregar Ac específico B (detector)
Incubar
Lavar
Agregar Ac anti-inmunoglobulina
marcada con enzima (conjugado)
Incubar
Lavar
Agregar sustrato enzimático
ELISA SANDWICH
Muestra positiva
Muestra negativa
ELISA competitivo: puede utilizarse para determinar la concentración tanto de Ag como Ac. El
método se basa en la competencia por la unión con el Ac de captura, entre el Ag de la
muestra y un Ag marcado con enzima. Si el Ag de la muestra (Ag sin marcar) tiene afinidad
por el Ac de captura, desplaza al conjugado (Ag marcado), que se elimina con los lavados,
disminuyendo así la cantidad de enzima presente en el pocillo y por consiguiente la cantidad
de color generado al agregar la mezcla de sustrato-cromógeno. Cuanto menor sea la
intensidad del color generado (menor absorbancia medida con el espectrofotómetro), mayor
será la concentración de Ag en la muestra problema.
Inmunohistoquímica (IHQ) e Inmunocitoquímica (ICQ)
La inmunohistoquímica permite evidenciar la presencia de un Ag específico sobre un corte de
tejido determinado y ubicar en que estructuras del mismo se encuentra. Los métodos de IHQ
pueden clasificarse en directos o indirectos. En el primer caso, el único Ac a utilizar se
encuentra conjugado con la enzima reconociéndose la unión del mismo con el antígeno tras el
agregado del sustrato cromógeno. En el segundo caso, existen distintos métodos: método de
dos pasos (el Ac primario unido a su Ag es detectado mediante un segundo Ac marcado),
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método de tres pasos (se agrega un tercer Ac dirigido contra el Ac secundario), método de la
avidina-biotina (conjugación del Ac secundario con biotina que permite la unión específica con
la avidina conjugada con la enzima de interés). Esta prueba se lee con microscopio óptico,
observándose una reacción positiva como un precipitado de color (de acuerdo al revelador),
sobre las estructuras histológicas que contengan el antígeno buscado.
La inmunocitoquímica permite evidenciar la presencia de un Ag específico sobre células
mediante un procedimiento similar.
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
La reacción en cadena de la polimerasa conocida como PCR por sus siglas en inglés
(Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular que amplifica un
fragmento de ADN (bacterias, virus y células de seres vivos) con el objetivo de aumentar las
probabilidades de identificar los mismos.
Desde hace muchos años se utiliza esta técnica para investigaciones científicas. Actualmente
se ha puesto a punto para el diagnóstico de rutina de muchas enfermedades infecciosas.
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN Y DE BARRIDO
La microscopía electrónica es una técnica que requiere instrumentos de alta complejidad y
personal altamente especializado, por lo tanto no se utiliza de rutina.
Los microscopios disponen de un cañón que emite electrones, éstos chocan contra el
espécimen y forman una imagen aumentada.
Hay dos tipos básicos de microscopios electrónicos: el microscopio electrónico de
transmisión (Transmission Electron Microscope, TEM) y el microscopio electrónico de
barrido (Scanning Electron Microscope, SEM).
La microscopía electrónica de transmisión permite la observación de cortes ultrafinos de una
muestra. Puede aumentar un objeto hasta un millón de veces y permite observar las
estructuras internas de las células.
La microscopía electrónica de barrido crea una imagen ampliada de la superficie celular.
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