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Tema-6. MECANISMOS DE ACCIÓN
ENZIMÁTICA
1.- Efectos energéticos
2.- Efectos entrópicos
3.- Efectos de orientación y proximidad
4.- Efectos del anclaje de los Sustratos sobre la
Enzima
Factores responsables de la eficiencia catalítica
* Sabemos que las enzimas actúan estabilizando el estado de
transición del complejo-ES, y que esto tiene como
consecuencia la disminución de la energía de activación.
S#
G
Reacción sin catalizar
G#nc
S
G
Reacción catalizada
SC #
G#c
P
¿cómo consiguen esto?,
Proteínas en solución bajen la G#
Factores de incremento de velocidad del orden de 1010 a 1020
1.- Efectos energéticos
v = k (ES)
Ec. de Eyring:
kBT
k
e
h
 G 
RT
La constante de velocidad, k, puede aumentarse disminuyendo el
valor de la energía libre de activación de Gibbs, G#
.
k  aumenta la velocidad de reacción, v
- Recordemos:
G# = H# - TS#
Entálpia de Entrópia de
activación
activación


kBT
k (
)e
h
 H
RT
e
S
R
v = f(k)
- la disminución de la variación de entalpía de activación, o
calor de reacción, H#, conducirá a la disminución de G# =>
aumento de la velocidad de reacción.
G# = H# - TS#,
- el aumento de la variación de la entropía de activación, S#,
conducirá, también, a la disminución de G‡, => aumento de la
velocidad de reacción.
G# = H# - TS#
Todo ello esta de acuerdo con la estabilización del estado de
transición en la enzima o por la enzima.
* Las enzimas estabilizan el estado de transición de los sustratos
de la reacción por interacciones de sus centros activos con los
sustratos en el estado de transición.
Los centros activos de las enzimas, generalmente, están
formados por unas bolsas o hendiduras apolares que envuelven a
los sustratos.
- En este microambiente apolar la cte. dieléctrica es mucho
menor que en un medio acuoso.
Las interacciones electrostáticas entre la E y el S en el estado de
transición, en este ambiente, será mayor, ya que, de acuerdo
con la Ley de Coulomb, las fuerzas atractivas o repulsivas son
inversamente proporcionales a la constante dieléctrica del medio.
F  (1/e)
e
e
H2O
= 80
apolar
=2-4
Esta estabilización por interacciones electrostáticas del centro activo,
teniendo en cuenta otros factores, podría explica factores
multiplicativos del orden de 108
Lisozima
Glicosidasa hidroliza peptido-glicanos
kBT
k
e
h
 G 
RT
Interacciones electrostáticas rebajan
42,0 a 25kJ/mol
Energía de estabilización
velocidad incrementa 103
2.- Efectos entrópicos
Provocando una ganancia de la entropía S#
kBT
k (
)e
h
ES
 H 
RT
e
S 
R
ES#
Aumento de la concentración efectiva de sustratos
Reacción intramolecular
v  k AB 
A+B
C + D Reacción intermolecular
v ,  k , A  R  B  A-R-B
v , k , A  R  B  k ,


v
k AB 
k A
C + D Reacción intramolecular
Factor multiplicativo de la velocidad
Velocidad en presencia de catalizador se ha multiplicado por un factor
Concentración de sustrato se hubiese multiplicado por ese factor
Reacciones intramoleculares hay elevadas concentraciones
efectivas de sustrato.
Las concentraciones efectivas de substrato se explican en términos de entropía.
Reacción intermolecular la formación del complejo
A+B
Entropía
C + D Reacción intermolecular
Entropía Translacional (Tres dimensiones del espacio)
Depende de la concentración no de la masa 120-150 J K-1 mol-1
Entropía Rotacional (Molécula )
Depende de la masa del orden 120-150 J K-1 mol-1
Entropia Rotacional (Grupos de la molécula)
Menor contribución 0,4-14 J K-1 mol-1
Entropía vibracional (Átomos de la molécula)
Menor contribución 13-21 J K-1 mol-1
Cuando las moléculas se unen hay una pérdida de de entropía
translacional y rotacional
Las reacciones intermoleculares desfavorecidas respecto a
reacciones intramoleculares.
Reacción intramolecular: Enzimática
E+S
ES
ES
ES#
Paso previo formación del complejo ES
Reacción intramolecular
Componente entálpico puede ser negativo,
aquí el entrópico es negativo
Calor de reacción que se desprende;
Interacciones no covalentes, electrostáticas, hidrobóbicas, etc
Reacciones enzimáticas tienen lugar en el interior enzimas donde
sustratos y residuos de aminoácidos reactivos del centro activo
forman parte de un mismo complejo, como una misma molécula
Conclusión: No hay perdidas de grados de libertad
Hay ganancia entrópica
Ganancia comparativa en el sentido que no ha habido disminución entrópica
3.- Efectos de orientación y proximidad
El efecto de aproximación tiene en cuenta la
aproximación o cercanía de los grupos reactivos.
El efecto de orientación tiene en cuenta la
orientación/disposición espacial de las sustancias
reaccionantes, es decir de la enzima (centro activo) y del
sustrato(s).
Efecto de orientación de los orbitales
Procesos relacionados con la entropía de activación
Efecto de aproximación
Supongamos la siguiente reacción intermolecular:
A+B
k1
<======>
C
v1 = k1 (A) (B)
Supongamos ahora que la reacción es intramolecular:
A B k2
<======>
C
v2 = k2
(
AB
)
k2 > k1, esto es lógico, ya que los grupos reaccionantes están
más próximos y por tanto la probabilidad de encontrarse y
reaccionar será mayor.
¿Pero cuantas veces puede llegar a ser
mayor k2 que k1?
Consideremos la reacción:
k1
A+B
C
- En el caso en que [A] >> [B], la reacción que era de segundo
orden se transforma en una de pseudo-primer orden
- En estas condiciones, podemos suponer que cada molécula de
B está rodeada por moléculas de A  máximo caso favorable de
acercamiento
v1 = k1 (A) (B) = kobs (B)
Donde: kobs = k1 (A)
Pero ¿cual es la máxima concentración de A que podemos
utilizar?
 Utilizar A como disolvente de B  concentración crítica
Luego,
kobs = k1 (A)critica
Si ahora suponemos, kobs = k2
k2 = k1 (A)critica
De donde deducimos que ….
k2/k1 = (A)critica
Veamos ahora, cuál es la concentración crítica de A, [A]critica, es
decir cuanto puede valer.
Supongamos una reacción de hidrólisis un substrato es agua
Mayor concentración de agua en agua es de :
(H2O)critica = 1000 dH2O/PM = (1000 x 1)/18 = 55,55 M
- Lo que nos indica que los efectos de aproximación, como
máximo, nos podrían explicar razones k2/k1, del orden de 5 x 101,
y que para facilitar calculos podriamos benebolamente redondear
a 102.
 que el factor de proximidad solo explicaría
incrementos de hasta102.
El efecto de orientación:orientación/disposición espacial
de las sustancias reaccionantes.
Analicemos el siguiente modelo relacionado con la orientación y la
aproximación:
+
No hay reacción  mala orientación
+
Bien orientado y
proximidad
adecuada
- Alineados pero no bien orientados
- Bien orientado pero no suficientemente aproximado
Efecto de orientación
Supongamos el caso de un ataque nucleofílico:
N: d
d+
C-X
N-C
+ X
- No todas las direcciones de acercamiento (o ataque) son
igualmente favorables => existen orientaciones preferentes.
N:
N:
Ángulo
sólido

C-X
N-C
:N
+ X
A grosso modo El factor multiplicativo lo podemos definir como
 = 360º/º
Si º = 3,6º, el factor multiplicativo  --> 100 (102)
 que el factor de orientación solo explicaría
incrementos de hasta 102.
!Aun estamos muy lejos de 1012 -1018¡
* Así pues, teniendo en cuenta los efectos de orientación y de
aproximación estaríamos en condiciones de explicar/justificar
incrementos de velocidad del orden de
.
104
Muy lejos todavía de los valores observados
experimentalmente, 108 -1018.
Efecto de orientación de los orbitales.
El efecto debido a la orientación de los orbitales de los átomos
reaccionantes: “Orbital steering effect”.
Koshland, tras el estudio detallado de estos efectos, llegó a la conclusión de que, en el caso de las enzimas, son
éstas, las enzimas, las que orientan y aproximan los grupos reactivos, pero que además hay que tener en
cuenta un tercer efecto.
Koshland parte de la hipótesis de que, además de los efectos
de orientación y aproximación de los grupos reactivos,
existe otro efecto, más fino, consistente en la orientación
de los orbitales electrónicos de los grupos reaccionantes,
permitiendo un solapamiento máximo entre ellos.
Con modelos sacado de la Química Orgánica, Koshland estudió el efecto de aproximación de una serie de
reacciones de esterificación intramoleculares
.
Sustratos libres
Reacción intramolecular
pero con libertad de giro
Reacción intramolecular pero
con menos libertad de giro
Reacción intramolecular
pero con menos libertad de
giro
Reacción intramolecular
pero con MENOS libertad
de giro
Reacción intramolecular
pero con MENOS libertad
de giro
Sustratos libres
Reacción
intramolecular
pero con libertad
de giro
Idem pero con
menos libertad de
giro
Idem pero con
menos libertad
de giro
Idem pero con
MENOS
libertad de giro
Idem pero con
MENOS
libertad de giro
- Koshland, observó que la velocidad de reacción era diferente
según las posibilidades de giro que tenían los grupos reactivos de
la molécula.
- La velocidad de reacción era mayor ( la reacción está
favorecida) a medida que disminuía el número de
orientaciones posibles,, es decir a medida
que disminuían los grados de libertad.
- Ante estos datos Koshland dedujo que además de los efectos
de orientación general y acercamiento, -que están presentes en
todas las reacciones intramoleculares- debía haber otro efecto de
orientación debido a la limitación de giro de los grupos
reaccionantes.
- Todo esto hizo proponer a Koshland la siguiente hipótesis para
una reacción enzimática (catalizada por una enzima).
Según Koshland la eficiencia catalítica de las enzimas
depende de su habilidad, no sólo para atraer y yuxtaponer
los grupos reaccionantes, sino también de orientar los
orbitales, de los átomos implicados, de manera tal que el
solapamiento es máximo.
La enzima favorece este tipo de solapamiento, orientando los
correspondientes orbitales.
Chequeo y critica de la Teoría de Koshland
¿Cuánto, cómo de fina ha de ser esta orientación de
orbitales?
- Esta orientación orbital es tan fina que basta que haya una
pequeña desviación en la orientación de los orbitales, para que el
efecto sea mucho menos eficaz, es decir, para que la velocidad
de reacción sea mucho menor.
- Para probar esto, se estudió la misma secuencia de
reacciones de esterificación anteriormente indicadas, en las
que se sustituyó el grupo -OH por un grupo -SH
¿Qué implica esto?
O
105º
S
108º
- Comparando las velocidades de reacción de lactamización con
las de tiolactamización, se observa que en todos los casos la
velocidad de tiolactamización es significativamente menor,
de 102 - 104 veces, dependiendo de cada reacción.
- Así pues, la orientación de orbitales puede explicar aumentos
de velocidad de reacción, hasta del orden de 107, que
conjuntamente con los efectos de orientación y aproximación
nos permiten justificar valores del orden de …..
11
10
*Critica de Bruice
- La crítica se basa, fundamentalmente, en el calculo del grado de
orientación de los orbitales para explicar los órdenes de
incremento de velocidad de reacción mayores, p. ej., > 103)
- Según la Teoría de la “orientación de los orbitales”, la
orientación debe ser tan fina, que bastaría una desviación de
0,1º para que la reacción no tuviera lugar a esas altas
velocidades.
- Esto hace suponer que los orbitales son sumamente rígidos
- Calculando la rigidez de los orbitales, Bruice llegó a la
conclusión de que para que se cumpla la Teoría de Koshland los
orbitales deberían ser unas 100 veces más rígidos de lo que son,
según la propia Teoría de los O. M.
- La vibración térmica de los orbitales, ya por sí, es de 5º
* Todo lo anterior nos está indicando que la Teoría de Koshlan de
la “Orientación de los Orbitales” no es del todo correcta y
necesitamos darle algunos retoque o desarrollar otras teorías.
4.- Efectos del anclaje de los Sustratos sobre la
Enzima
Reuben, propuso nueva teoría, la “Teoría del Anchoring” o “Teoría del
anclaje”.
Reuben. PNAS 68, 563 (1971)
La Teoría de Reuben se basa en el tiempo de colisión de los
sustratos que van a reaccionar
-El tiempo de colisión entre dos partículas en solución acuosa es
sumamente pequeño, del orden de 10-11 a 10-12 segundos.
- Sin embargo, en presencia de una enzima, el tiempo de
residencia de los sustratos sobre la enzima, es sensiblemente
mayor del orden de 10-4 a 10-7 segundos,.
- Estos valores del tiempo de residencia, pueden utilizarse
para explicar el aumento de la velocidad de reacción:
La probabilidad de que tenga lugar la reacción viene dada por:
t --> tiempo de choque
P = 1 - e-w t
w --> una cte que depende de la naturaleza de la reacción
Pe
1 - e-we te
P
1 - e-w t
------- = -----------------
- Suponiendo que:
i) we = w, ya que el tipo de reacción es el mismo,
ii) tc y tnc <<< 1
- Desarrollando en serie los términos exponenciales tenemos
Pc
1 - 1 – w e te
te
------- = ---------------------- = ------
Pnc
1-1–wt
t
-Lo que nos está diciendo que la probabilidad de choque
eficiente es proporcional a los tiempos de colisión.
Con otras palabras, la probabilidad de reacción, y por tanto la
velocidad de reacción, es directamente proporcional al tiempo
de choque o residencia.
Así, para la siguiente reacción:
Alcohol-DH
Acetona + NADH + H+ <=========> Etanol + NAD+
Enzima
Tiempo de residencia
ADH-Higado-buey
3,20 ms
ADH-levadura
0,002 ms
Velocidad de reacción
3,5 105 moles s-1
5,0 102 moles s-1
- Estos datos experimentales apoyan la validez de la Teoría del
Anchoring o del “Anclaje”.
- Actualmente sabemos, que además de estos factores, también
debemos considerar otros, que bien, de una manera
independiente, o en sinergia, pueden contribuir a la catálisis.
- Actualmente, se piensa que lo que hace que una reacción
enzimática sea tan rápida en comparación con la misma reacción
no catalizada, o catalizada por un catalizador químico, es en
realidad un compendio de efectos que actúan de manera
sinérgica:
-efectos de proximidad y orientación
- efecto de orientación de orbitales
- incremento de tiempo de anclaje
ESTABILIZACIÓN COMPLEJO ACTIVADO:
AUMENTANDO S# Y DISMINUYENDO H#
RESUMEN
Mecanismo de la acción enzimática se explica por la estabilización del
estado de Transición.
Varios efectos coinciden en la acción enzimática.
a) El centro activo de la enzima se encuentra en el interior de la
proteína de naturaleza apolar. Tiene como consecuencia que las
interacciones electrostáticas entre los residuos de los aminoácidos y los
substratos sean más fuerte.
b) El Paso del complejo ES a ES # favorecido entropicamente al ser una
reacción intramolecular.
c) Las enzimas se aproximan a los reactantes y posiblemente orienten los
orbitales de los grupos que van a reaccionar.
d) Las enzimas aumentan el tiempo de residencia de los subtratos
reacionantes faboreciendo la probabilidad de choques eficaces.